2.1  各组软骨大体观及组织学检查结果 

2.1.1  各组软骨大体观  见图1。

空白对照组：兔精神状态良好，食欲正常，活动自如，右侧后膝关节无肿胀、畸形，毛发光亮，体质量无减轻。股骨髁及胫骨平台软骨面色泽正常，表面光整，无骨赘。

骨关节炎模型组：兔精神状态、食欲差，造模后随时间推移活动逐渐受限，右膝关节出现肿胀，跛行，毛发稀疏暗淡，体质量减轻。关节软骨色泽灰暗，表面溃疡形成，可见大量骨赘形成，部分关节面软骨缺失，软骨下骨裸露。

金骨莲灌胃组：兔精神状态较好，食欲较正常，关节活动无明显受限，膝关节无明显肿胀，毛发较光亮，体质量无减轻。关节软骨色泽稍变暗，关节面粗糙，未见骨赘及软骨下骨裸露。

p38抑制剂组：兔精神状态、食欲较差，关节轻度肿胀。关节面粗糙伴糜烂，可见少量骨赘形成，未见明显软骨下骨裸露。

2.1.2  各组软骨组织学检查结果  关节软骨行病理切片苏木精-伊红及番红O染色观察，见图2。

空白对照组：软骨结构完整，软骨细胞排列整齐，在钙化层及辐射层之间可见到完整的细胞潮线。番红O染色观察到细胞基质正常染色。

骨关节炎模型组：软骨变薄，软骨4层结构不完整，结构紊乱，裂隙深，可见放射带，软骨细胞明显减少，潮线破坏。番红O染色观察到细胞基质失染。

金骨莲灌胃组：软骨浅表层不规则，软骨细胞弥漫性增生，细胞潮线可见。番红O染色观察到细胞基质轻度失染。

p38抑制剂组：软骨变薄，软骨细胞局部增生，细胞潮线欠完整，番红O染色观察到细胞基质中度失染。

2.2  各组软骨Pelletier及Mankin评分  骨关节炎模型组Pelletier及Mankin评分较金骨莲灌胃组及p38抑制剂组明显升高(P < 0.05)，金骨莲灌胃组Pelletier及Mankin评分较p38抑制剂组明显降低(P < 0.05)，见表2，图3。

2.3  金骨莲灌胃对骨关节炎软骨细胞凋亡的影响

2.3.1  各组软骨组织中Bcl-2 mRNA的相对表达量  药物干预8周后，金骨莲灌胃组Bcl-2 mRNA的相对表达量较骨关节炎模型组及p38抑制剂组均明显升高(P < 0.05)；与骨关节炎模型组相比，p38抑制剂组Bcl-2 mRNA的相对表达量明显升高(P < 0.05)，见表3和图4。

2.3.2  各组软骨组织中Bax mRNA的相对表达量  药物干预8周后，金骨莲灌胃组软骨组织中Bax mRNA的相对表达量较骨关节炎模型组及p38抑制剂组均明显降低(P < 0.05)；与骨关节炎模型组相比，p38抑制剂组Bax mRNA的相对表达量明显降低(P < 0.05)，见表3和图4。

2.3.3  各组软骨组织中Cleaved Caspase-3蛋白的表达量  药物干预8周后，金骨莲灌胃组Cleaved Caspase-3蛋白的表达量较骨关节炎模型组及p38抑制剂组均明显降低(P < 0.05)；与骨关节炎模型组相比，p38抑制剂组Cleaved Caspase-3蛋白的表达量明显降低(P < 0.05)，见图5。

2.4  各组软骨组织P-p38蛋白的表达量  药物干预8周后，金骨莲灌胃组P-p38蛋白的表达量较骨关节炎模型组及p38抑制剂组均明显降低(P < 0.05)；与骨关节炎模型组相比，p38抑制剂组P-p38蛋白的表达量明显降低(P < 0.05)，见图6。

骨关节炎是软骨细胞、软骨下骨、软骨基质3者合成与降解偶联失衡，以及滑膜组织、半月板组织退变、关节囊肥厚等共同作用的结果^[1-4]，是目前世界范围内最常见的引起关节疼痛、功能障碍的疾病^[5-6]。据调查在全球范围内65岁以上的人群中有50%以上受到骨关节炎的影响^[7]，临床上治疗该疾病的方法有限^[8-9]，因此有必要对骨关节炎的药物研发进行进一步的研究。

关于骨关节炎的发病机制，目前认为丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)信号通路在其中扮演着中心调节作用^[10]，包括p38、ERK、JNK、ERK5等多个亚家族^[11-12]，它能激活多种炎性因子的表达，导致软骨细胞凋亡，从而发生骨关节炎，其中p38信号通路是MAPK家族中的重要组成部分。对于骨关节炎的保守药物治疗，如非类固醇类抗炎药，主要用于急性期止痛^[13]，氨基葡萄糖和硫酸软骨素可增加软骨基质中蛋白多糖与Ⅱ型胶原的合成^[14]，但长期疗效也不尽人意。骨关节炎发展到终末期需进行关节置换术，但手术仍存在相关风险及并发症、后期翻修等诸多问题。

祖国医学在骨关节炎治疗中有着深厚的历史底蕴及特有的优势，其中金骨莲胶囊作为一种传统的苗药组方，具有祛风除湿、消肿止痛之功效，对该药物及其成分的研究显示可抑制软骨组织中白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α及基质金属蛋白酶3的表达，从而对关节软骨产生保护作用^[15-16]。目前金骨莲胶囊发生软骨保护的作用机制还不清楚，其是否可抑制软骨细胞的凋亡或在骨关节炎发生的信号通路中产生作用仍有待研究。p38信号通路是MAPK家族中的重要组成部分，该通路中的p38蛋白被激活后成为磷酸化p38蛋白，其表达量与骨关节炎的严重程度呈正相关，但有研究报道在鼠关节腔进行注射p38抑制剂(SB203580)后，可抑制骨关节炎模型中基质金属蛋白酶3，13的表达，对骨关节炎软骨具有保护作用^[17]，说明该抑制剂可负性调控p38通路。该实验除检测软骨组织凋亡相关蛋白以外，还试图探寻该药物是否在p38通路中发挥作用，以探讨该药物可能的软骨保护机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  设计  随机对照动物实验。

1.2  时间及地点  实验于2017年10月至2018年4月在遵义医学院动物实验中心及细胞工程实验室完成。

1.3  材料

1.3.1  实验动物  成年健康家兔40只，体质量2.1-3.2 kg，雌雄不限，由遵义医学院动物中心饲养，饲养条件为24 h昼夜循环、自由摄水摄食。

1.3.2  实验仪器  SM2000R型病理组织切片机(Leica德国)；-80 ℃超低温冰箱(DW-86L1486，Haier，中国)；微量紫外可见分光光度计(ND1000，Thermo Scientific，美国)；实时荧光定量PCR仪(CFX96，BIO-RAD，美国)；酶标仪(SUNRISE，TEC-CAN，奥地利)；Western blot制胶板(0.75 mm、1 mm，BioRad，美国)；Western blot电泳/转槽(中型，BioRad，美国)；Western blot 荧光感应曝光机(700/800通道，Odyssey，美国)。

1.3.3  实验主要药物及试剂  金骨莲胶囊(批号：150707，规格：0.25 g×24粒/盒，贵州益佰制药股份有限公司)；p38抑制剂(SB203580，10 mmol/L，1 mL，美国Medchem Express公司)；Anti-p38抗体[M138](Abcam公司)；Anti-p38(phosphor T180+Y182)抗体[M139](Abcam公司)；Anti-Caspase-3抗体[ab13847](Abcam公司)；HRP结合亲和山羊抗兔IgG(H+L)(武汉三鹰)；Trizol提取液(日本Takara公司)；扩增试剂盒(美国BIO-RAD公司)；反转录试剂盒(日本Takara公司)；实时荧光定量PCR试剂盒(SYBR Premix Ex Taq^TMⅡ)(日本TaKaRa公司)。

1.4  方法

1.4.1  动物分组及造模   实验前所有动物在动物中心分笼饲养适应1周，从40只家兔中随机挑选10只作为空白对照组，余下的30只家兔以改良Hulth法在兔右后膝建立骨关节炎模型^[18-20]，并随机分为骨关节炎模型组(10只)、金骨莲灌胃组(10只)，p38抑制剂组(10只)。造模前，先于耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠30 mg/kg，术区备皮，常规消毒铺巾操作，选择髌旁内侧长约2 cm切口，显露关节腔，切除前交叉韧带及内侧半月板，行抽屉实验确认前交叉韧带已完全断裂，生理盐水冲洗创腔，缝合关闭关节腔及皮肤。术后每只兔每天肌肉注射青霉素钠6×10⁴ U/(kg·d)，连续注射7 d，单笼饲养并每日驱赶1 h。

1.4.2  动物用药及取材  参考临床常规用量及相关文献，同时结合《药理实验方法学》中动物药物剂量换算公式得出金骨莲使用剂量为57.5 mg/(kg·d)，与双蒸水配制成10 mL灌胃；p38抑制剂与PBS配制浓度为10 μmol/L，以0.5 mL行家兔右膝关节腔注射，每周1次；其余两组以等量双蒸水灌胃。灌胃及关节腔注射均于造模1周、伤口情况稳定后开始，干预8周后过量麻药注射处死动物，取负重区股骨髁及胫骨平台，标本于多聚甲醛及液氮(-196 ℃)中保存待检。

1.4.3  软骨大体观察  截取右膝关节股骨髁及胫骨平台观察软骨大体观，采用Pelletier评分评估软骨损伤情况^[21]：①0分：关节面光整，色泽如常；②1分：关节面粗糙，有小的裂隙且色泽灰暗；③2分：关节面糜烂，软骨缺损深达软骨表中层；④3分：关节面溃疡形成，缺损深达软骨深层；⑤4分：软骨剥脱，软骨下骨暴露。评分由3位具有副高职称以上关节外科医师进行评价，评分者对分组情况不清楚。

1.4.4  组织学检查  采用40 g/L多聚甲醛固定标本3 d，然后用EDTA脱钙液脱钙2周，软骨组织切片后，行苏木精-伊红染色及番红O染色，显微镜下观察。根据Mankin评分标准评估软骨退变情况^[22]。

1.4.6  Western blot检测软骨组织中P-p38及Cleaved caspase-3蛋白的表达  将提取的软骨组织尽量剪碎，在匀浆机中充分匀浆，裂解，操作均在冰上进行，然后4 ℃   12 000×g离心5 min，取上清，分装于0.5 mL离心管中-80 ℃保存。严格按BCA蛋白定量试剂盒操作说明测定蛋白浓度，取适量上清，加入上样缓冲液，煮沸10 min，放于-20 ℃保存。按分子质量大小配置12%分离胶及浓缩胶；将各蛋白总样品40 μg加入电泳槽上样孔中，分别在80 V、120 V进行电泳分离，至溴酚蓝刚跑出即可关闭电泳仪停止电泳；取出凝胶，严格按操作步骤进行冲洗，转膜，封闭；用封闭液稀释一抗，4 ℃孵育过夜；用封闭液稀释对应的HRP标记的二抗(1∶50 000稀释)，37 ℃摇床孵育2 h，TBST充分清洗，转入曝光机曝光。

1.5  主要观察指标  ①股骨内侧髁及胫骨内侧平台软骨大体观，并行Pelletier评分评估软骨损伤情况；②软骨病理切片行苏木精-伊红染色及番红O染色，进行Mankin评分评估软骨退变情况；③实时荧光定量PCR法检测软骨组织中Bcl-2、Bax mRNA的表达量；④Western blot检测软骨组织中P-p38及Cleaved caspase-3蛋白的表达。

1.6  统计学分析  采用SPSS 18.0软件进行分析，计量资料以x(_)±s表示，进行单因素方差分析和组内比较，检验水准取α=0.05。

成功建立骨关节炎动物模型是进行药物及相关治疗研究的基础，改良Hulths法被证实是非常有效的骨关节炎模型建立方法，MURPHY等^[23]将山羊单侧膝关节前交叉韧带及内侧半月板切除行骨关节炎建模，观察到股骨髁及胫骨平台关节软骨面被侵蚀、关节周围骨赘形成等典型骨关节炎表现，ROMAN-BLAS等^[19]使用该方法建模后，将软骨标本行病理切片可观察到软骨表面裂隙深及软骨深层、软骨细胞明显减少，基质失染等进行性骨关节炎的表现。HAYAMI等^[24]切断动物前交叉韧带及内侧半月板建立骨关节炎模型，造模后1周从组织病理学上检测到软骨表面破坏及蛋白多糖的丢失，在第6周观察到关节边缘大量骨赘形成的终末期骨关节炎表现。此次实验使用改良Hulths法行造模，从骨关节炎模型组软骨标本大体观及病理切片观察到明显的骨关节炎改变，且Pelletier评分及Mankin评分较空白对照组明显增高，差异有显著性意义，证实骨关节炎模型成功建立，同时证明该造模方法的稳定性及可重复性。

祖国医药在骨关节炎的治疗上已有悠久的历史，并取得良好疗效^[25]，随着祖国医药在骨关节炎中的治疗作用越来越多的被报道，使其成为目前研究的热点。金骨莲胶囊为传统的苗药组方，其主要成分金铁锁在贵州分布广泛，前期对金骨莲胶囊及其成分进行研究，显示其可抑制兔骨关节炎模型软骨组织中白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α等炎性因子的表达，还可抑制基质金属蛋白酶3的表达，增加基质金属蛋白酶抑制剂1的表达，延缓关节软骨退      变^[13，26-27]，但是该药物延缓关节退变的机制仍不清楚。从引起软骨退变的病理生理方面进行分析，软骨退变的重要因素是软骨细胞凋亡^[28]，细胞凋亡存在3种途径：内源性途径、外源性途径、内质网途径，但是3种途径最后都会在半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)家族中汇聚^[29]，当该酶激活后，可启动细胞凋亡程序，在Caspase家族中，活化的Caspase-3(Cleaved Caspase-3)是细胞凋亡的终末剪切酶，Cleaved Caspase-3通过一系列高度调控的级联反应使细胞凋亡，在细胞凋亡过程中起核心作用^[30]。SHARIF等^[31]对人髋、膝关节骨关节炎软骨与正常膝关节软骨进行软骨细胞凋亡检测发现，髋、膝关节骨关节炎软骨细胞的凋亡率较正常软骨细胞的凋亡率明显增高，且Cleaved Caspase-3的表达较正常软骨明显增高。陈喜德等^[32]进行不同病期骨关节炎大鼠软骨组织中Cleaved Caspase-3与软骨细胞凋亡的相关性研究发现，随着骨关节炎的进展，Cleaved Caspase-3的表达逐渐增多，且软骨细胞凋亡亦逐渐增多，说明在骨关节炎中Cleaved Caspase-3的表达与软骨细胞凋亡呈正相关关系。该实验通过检测Cleaved Caspase-3的表达，分析金骨莲灌胃与软骨细胞凋亡的关系，结果显示金骨莲灌胃组Cleaved Caspase-3的表达较空白对照组明显升高，差异有显著性意义，但较骨关节炎模型组明显降低，差异也有显著性意义，说明金骨莲灌胃可以通过抑制Cleaved Caspase-3的表达，使软骨细胞凋亡减少，延缓软骨退变进程。与p38抑制剂组相比，Cleaved Caspase-3的表达明显降低，说明金骨莲灌胃组在抑制Cleaved Caspase-3的表达上优于p38抑制剂组。

软骨细胞的凋亡受p53基因、Bcl-2基因等家族的调   控^[33]，其中Bcl-2基因家族研究最多，在Bcl-2基因家族中，Bcl-2、Bax基因是该家族中与细胞凋亡相关的最重要的2个基因。Bcl-2存在于软骨细胞线粒体外膜上，可阻止线粒体膜的透化，抑制促凋亡因子细胞色素C的释放和caspase自身正反馈激活，进而抑制软骨细胞凋亡^[34]。Bax基因则能诱导细胞凋亡，研究显示在兔骨关节模型软骨组织中检测Bax的表达较正常软骨组明显升高，而Bcl-2的表达是降低的^[35]。实验使用实时荧光定量PCR法检测各组软骨组织中Bcl-2、Bax mRNA表达，金骨莲灌胃组与空白对照组相比，Bax mRNA的表达量明显升高，差异有显著性意义，但与骨关节炎模型组及p38抑制剂组相比，Bax mRNA表达明显降低，差异有显著性意义；在Bcl-2 mRNA的表达上，金骨莲灌胃组较空白对照组明显降低，但较骨关节炎模型组及p38抑制剂组明显升高，差异均有显著性意义，说明金骨莲灌胃虽不能完全完全阻断骨关节进程，但可通过抑制软骨凋亡相关蛋白的表达有效延缓兔骨关节炎模型软骨退变。

既往的研究结果显示，p38抑制剂SB203580可减轻动物骨关节炎模型软骨退变程度并缓解疼痛^[36]，可减少由一氧化氮诱导的软骨细胞凋亡^[37]。实验结果显示p38抑制剂组Bax mRNA及Cleaved Caspase-3蛋白的表达较空白对照组明显升高，但较骨关节炎模型组明显降低，Bcl-2 mRNA的表达较空白对照组明显降低，但较骨关节炎模型组明显增高，从而抑制了软骨细胞的凋亡，和既往的研究结果是相同的。p38抑制剂还可抑制磷酸化p38(P-p38)蛋白的表达^[37]，P-p38蛋白是p38MAPK信号通路经过磷酸化级联反应直接磷酸化酪氨酸、丝氨酸/苏氨酸残基，激活p38，存在于软骨组织中^[38]，相关研究显示骨关节炎患者软骨组织中P-p38蛋白的表达较正常组织明显升高^[39]，且表达量是随着骨关节炎的加重逐渐增加^[40]。实验使用Western blot法检测各组软骨组织中P-p38蛋白的表达，金骨莲灌胃组P-p38蛋白的表达较骨关节炎模型组明显降低，说明金骨莲灌胃通过抑制软骨组织中P-p38蛋白的表达，延缓了兔骨关节炎模型软骨的退变，金骨莲灌胃组在抑制P-p38蛋白的表达上优于p38抑制剂组，虽然p38抑制剂SB203580是P38MAPK的专一阻断剂，但p38MAPK存在4个亚型：p38α、p38β、p38γ、p38δ，其中p38α和p38β各有2种异构体，抑制剂SB203580对p38α、p38β敏感较好，但对p38γ、p38δ敏感性较差，相关文献报道在骨关节炎软骨细胞内检测到p38α、p38γ、p38δ的表达，而未检测到p38β的表达^[41]，且MOREL等^[42]研究发现SB203580并不能阻断上游激酶对p38的激活，而是作用于p38三磷酸腺苷(ATP)活性结合位点，使p38失去酶的活性，因此实验发现p38抑制剂组在延缓兔骨关节炎模型软骨退变方面不及金骨莲灌胃组，考虑与该抑制剂的敏感性及作用机制相关。实验发现金骨莲灌胃抑制了P-p38蛋白的表达，但其是否对p38MAPK通路产生影响，仍需要对该通路上游及下游的相关因子进一步研究才能明确，是后期重点研究的方向。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：

细胞凋亡：为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主有序的死亡。与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等作用，是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。

P-p38蛋白：磷酸化p38蛋白，存在于P38MAPK信号通路中，该通路是丝裂原活化蛋白激酶的亚类之一，该通路中的特异性p38蛋白经过磷酸化级联反应直接磷酸化，从而被激活并具备生物活性，存在于软骨组织中，可反映骨关节炎严重程度。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

随着祖国传统医药逐渐被重视，其在骨科领域的应用也越来越多，并取得较好的临床疗效，不仅可缓解患者关节疼痛，改善功能，还能达到软骨保护的作用。既往研究多对骨关节炎相关的细胞因子或炎性介质进行研究，但其是否在骨关节炎的信号通路中发挥作用，还不得而知，且该类药物多为复方制剂，包含多种中药成分，每种成分又包含多种化学单体，到底是何种成分，甚至精确到某一种化学单体在发挥作用，将会是未来研究的方向。