2.1  参与者数量分析  80例患者的腰椎黄韧带标本均进入结果分析。

2.2  两组黄韧带标本的细胞凋亡情况  黄韧带组织TUNEL染色结果见图1：实验组表现为细胞稀疏，细胞排列紊乱，可见散在分布的棕黄着色细胞核，并伴有细胞核碎裂或染色质浓集；对照组表现为细胞密集，细胞排列规律，可见少量阳性染色细胞。

实验组和对照组细胞凋亡率分别为(37.80±3.04)%，(13.18±1.34)%，经t 检验组间差异有统计学意义(t=41.83，P < 0.001)，表明肥厚黄韧带中细胞凋亡率升高。

2.3  两组黄韧带标本中凋亡因子caspase-3、fas、p53的表达  SP免疫组织化学染色结果见图2。

2.3.1  实验组  肥厚黄韧带组织免疫组化染色情况多表现为细胞核染色呈棕黄色或棕褐色，细胞排列紊乱，正常形态结构消失，胞核变小，胞膜皱缩，着色深。①caspase-3染色阴性为0例，阳性为33例，强阳性为17例，阳性率为100%；②fas染色阴性为0例，阳性为32例，强阳性为18例，阳性率为100%；③p53染色阴性为0例，阳性为34例，强阳性为16例，阳性率为100%，均表达阳性率高。

2.3.2  对照组  正常黄韧带组织免疫组化染色情况多表现为细胞核染色呈淡黄色或棕黄色，细胞排列规律，细胞形态正常，着色较浅。①caspase-3染色阴性为26例，阳性4例，强阳性为0例，阳性率为13.3%；②fas染色阴性为25例，阳性5例，强阳性为0例，阳性率为16.7%；③p53染色阴性为27例，阳性3例，强阳性为0例，阳性率为10%，均表达阳性率较低。

实验组和对照组凋亡因子caspase-3、fas、p53阳性表达强度经卡方检验，差异均有统计学意义(χ²=64.78，   χ²=61.55，χ²=68.24，P < 0.001)，说明凋亡因子表达上调与肥厚黄韧带细胞凋亡具有一定的相关性。见表1。

腰椎管狭窄症可导致腰部及下肢的疼痛和麻木，其主要病理变化为腰椎骨与软组织(椎体、小关节突、椎板、黄韧带、椎间盘等)的形态及组织结构的变化，导致中央椎管、侧隐窝、神经孔狭窄，使神经根和马尾神经受到刺激或压迫，从而产生一系列的临床症状。现今临床上对于退变引起的下腰痛多先采用保守治疗，对于通过正规保守治疗症状不能缓解者采用手术治疗。应用最广泛的手术是减压和脊柱融合术，近年来这两类手术技术取得了长足的进步，微创外科技术的应用使创伤越来越小且确实、有效地缓解了症状^[1]。但是，减压后必然导致椎间关节结构、形态、功能异常和不稳定，融合后亦加速邻近节段的退变，远期优良率在70%左右，疗效并不理想。为提供更好的治疗方法就必须清楚退变的病因和确切发病机制，目前为止并未发现良好的方法来延缓或者防止黄韧带肥厚与退变。

腰椎管狭窄症多伴有黄韧带的增生和肥厚，从而加重其腰腿痛的症状。王伟敦等^[2]通过影像学及病理解剖学研究发现黄韧带病变是造成腰椎管狭窄的常见原因。阚敏慧等^[3-4]通过CT验证发现腰椎管狭窄症患者黄韧带明显比腰椎间盘突出症患者肥厚。目前关于黄韧带的影像学及病理研究较多，关于细胞凋亡的研究较少，此次研究通过TUNEL染色及SP免疫组织化学染色方法，探讨凋亡基因caspase-3、fas、p53在黄韧带中的表达情况。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  设计  病例对照研究。  

1.2  时间及地点  实验于2018年4月至2019年2月在新疆医科大学第六附属医院及新疆医科大学中心实验室完成。

1.3  材料  兔抗人caspase-3单克隆抗体(Abcam公司，英国，编号ab184787)，fas单克隆抗体(Abcam公司，英国，编号ab133619)，p53单克隆抗体(Abcam公司，英国，编号ab28)；In Situ Apoptosis Detection试剂盒(Abcam公司，英国，编号ab206386)；二抗山羊抗兔IgG(中衫金桥公司，中国，编号ab6722)；LEICA DM4光学显微镜及成像系统(LEICA公司，德国)。

1.4  对象  收集新疆医科大学第六附属医院2018年4月至2018年10月行腰椎后路减压融合内固定术及单纯开窗减压髓核摘除术的患者共80例。实验组50例经MRI及术后测量证实肥厚黄韧带组织，均取自腰椎管狭窄症行手术减压的患者，其中男22例，女28例，年龄32-74岁，平均54.46岁。对照组30例正常黄韧带组织，取自急性腰椎骨折和经MRI及术后测量证实无黄韧带肥厚的腰椎间盘突出症患者，其中男19例，女11例，年龄19-67岁，平均47.27岁。

纳入标准：①黄韧带肥厚占主要因素的腰椎管狭窄症患者纳入实验组；②单纯腰椎间盘突出症及爆裂骨折患者纳入对照组；③患者或其父母均对该研究知情同意；④影像学(CT、MRI等)检查支持诊断；⑤初次行腰椎后路减压手术。

排除标准：①有脑血管疾病等严重脑器质性疾病者；②有高血压、糖尿病等严重躯体疾病者；③其他肝脏疾病、传染病、以及患有其他恶性疾病及肿瘤患者；④影像学(CT、MRI等)不支持的患者。

该研究通过了新疆医科大学第六附属医院伦理委员会批准，伦理编号为LFYLLSJ2016007。

1.5  方法

1.5.1  标本来源处理方法  实验组肥厚黄韧带组织，取自腰椎管狭窄症行手术减压的患者，取材部位为L₂-S₁，黄韧带厚度4.5-8.0 mm(平均5.63 mm)；对照组正常黄韧带组织，取自急性腰椎骨折和经MRI及术后测量证实无黄韧带肥厚的腰椎间盘突出症患者，取材部位为L₂-S₁，黄韧带厚度2.3-4.0 mm(平均3.56 mm)。

1.5.2  TUNEL染色检测腰椎黄韧带标本中细胞凋亡  组织标本石蜡包埋，切成4 mm切片，置于65 ℃恒温箱中烤片，湿盒复温20 min，脱蜡至水，PBS漂洗3 min×3次。蛋白酶K溶液100 μL/片，室温湿盒内孵育20 min，PBS漂洗3 min×3次。体积分数3%H₂O₂溶液100 μL/片，室温湿盒内孵育     5 min，PBS漂洗3 min×3次。TdT平衡缓冲液100 μL/片，室温湿盒内孵育30 min。最后5 min冰上制备标记反应混合物40 μL/片，盖上盖玻片37 ℃湿盒孵育1.5 h，去除盖玻片，PBS漂洗3 min×3次。滴加停止缓冲剂100 μL/片，室温湿盒内孵育5 min，PBS漂洗3 min×3次。滴加阻塞缓冲剂100 μL/片，室温湿盒内孵育10 min。最后5 min冰上配置1∶25 Conjugate试剂100 μL/片,室温湿盒内孵育30 min，PBS漂洗3 min×3次。滴加DAB显色液100 μL/片，低倍光镜下控制染色时间，显色后自来水冲洗。苏木素复染2 min，1%盐酸乙醇分化1 s，PBS冲洗反蓝，并通过梯度乙醇脱水，二甲苯缸透明，中性树胶封固，观察标本。采用脱氧核苷酸末端转移酶(TDT)介导的原位缺口末端标记法(TUNEL法)，细胞核呈黄褐色者为阳性细胞，即凋亡细胞。每例取5个400倍视野，评估视野细胞中含凋亡细胞个数为凋亡指数(AI)。

1.5.3  SP免疫组织化学染色检测腰椎黄韧带标本中凋亡因子的阳性表达  组织标本进行石蜡包埋，切成4 mm切片；置于65 ℃恒温箱中烤片，湿盒复温20 min，脱蜡至水，PBS漂洗3 min×3次；用体积分数3%H₂O₂室温下孵育   15 min灭活内源性过氧化物酶，PBS洗涤3 min×3次；使用柠檬酸盐缓冲液行抗原修复，PBS洗涤3 min×3次；羊血清封闭液进行封闭，室温下孵育30 min；将一抗(caspase-3、fas、p53单克隆抗体)加入切片中，4 ℃的冰箱中过夜，室温下平衡30 min，PBS洗涤3 min×3次；滴加二抗山羊抗兔IgG 100 μL/片，37 ℃保持30 min，PBS 3 min×3次；滴加DAB显色液100 μL/片，在室温下孵育，低倍光镜下控制染色时间，显色完成后自来水冲洗；苏木素复染2 min，1%盐酸乙醇分化1 s，PBS冲洗反蓝，并通过梯度乙醇脱水；二甲苯缸透明；中性树胶封固，观察标本。每例取5个400倍视野观察每个切片。

在每个视野中，评估细胞数以确定阳性染色细胞的比例。计算5个视野的平均值。根据样品评分，样品染色细胞百分比(0：<10%，1：10%-20%，2：20%-50%，和3：> 50%)和细胞的颜色强度(0：无，1：淡黄色，2：棕黄色，3：棕色)。这2个分数的乘积用于分类表达水平，当乘积≤2时表达被认为是阴性的，乘积为3-5时为阳性，当乘积  是≥6时为强阳性。

1.6  主要观察指标  ①黄韧带标本中细胞凋亡率；②黄韧带标本中凋亡因子caspase-3、fas、p53的阳性表达。

1.7  统计学分析  数据以x(_)±s表示，采用SPSS 22.0进行统计分析。免疫组化阳性表达的组间差异采用卡方检验，凋亡细胞率组间的均数比较采用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

SAKAMAKI等^[5]通过磁共振横向放射学研究表明，腰椎管狭窄症组黄韧带厚度的平均值为4.44 mm，非腰椎管狭窄症组厚度均值为2.44 mm，随着年龄的增长黄韧带的厚度逐渐增加，L₄-L₅的增厚在30-39岁患者中已经开始，总厚度多大于3.5 mm，且增厚值高于L₂-L₃、L₅-S₁。此次研究通过影像学及术后标本测量大于4 mm作为实验组，通过免疫组织化学染色及TUNEL染色法对比两组细胞凋亡率及凋亡因子的表达差异。ALTINKAYA等^[6]研究表明脊柱水平、椎间盘突出、椎间盘退变、腰椎管狭窄、衰老、体质量指数等均与黄韧带增厚有关，而性别和疼痛程度与黄韧带的厚度无关。ABBAS等^[7]发现黄韧带的肥厚具有年龄依赖性。周纲等^[8]通过CT对比测量患者腰椎黄韧带厚度，发现性别与黄韧带的厚度无明显相关，而族别有一定的相关性，随着年龄的增长及体质量指数的增加，会导致黄韧带的增厚，故此次研究没有进行年龄、性别及体质量等因素的分析研究。研究发现，机械应力及组织炎症反应的累积，造成纤维化(瘢痕形成)的不断增多，进而导致黄韧带肥厚，机械应力能增加黄韧带细胞的成骨分化速率，并可能通过骨形态发生蛋白(BMP)-Smad1和Src-p38MAPK信号通路进而造成黄韧带的肥厚发生^[9-11]。蒋玉权等^[12]研究发现碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子β1在腰椎黄韧带肥厚形成过程中有重要作用，引起黄韧带肥厚的主要胶原产物为Ⅰ型胶原蛋白。实验表明转化生长因子β的表达与黄韧带的肥厚密切相关，通过适当的检测转化生长因子β表达水平可以用来预测黄韧带肥厚的进展^[13-15]。导致黄韧带肥厚现研究主要有炎性反应、力学因素、细胞因子、代谢异常及多种蛋白质的改变，关于凋亡因素研究相关报道较少。此次研究通过TUNEL染色观察到肥厚黄韧带组织染色表现为细胞稀疏，细胞排列紊乱，可见散在分布的棕黄着色细胞核，并伴有细胞核碎裂或染色质浓集，实验组和对照组凋亡细胞率对比差异有统计学意义，肥厚黄韧带中细胞凋亡率升高。

研究证实细胞凋亡在机体发育和许多生理、病理过程中均起着重要作用，人们对于凋亡的研究一直具有很高的热情。对于人类黄韧带细胞的凋亡事实由NAKAMA等^[16]通过生理学研究证明，并通过免疫组化检测活化的caspase-3，还观察到活化的caspase-3免疫反应存在于其中。Caspase是一类天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白酶，在人类细胞中Caspase的超量表达和激活均会引起细胞凋亡，因此又称死亡蛋白酶，它以依赖线粒体和非依赖线粒体2条途径促进细胞凋亡^[17]。赵英伦等^[18]在腰椎间盘突出症患者血清中通过酶联免疫吸附实验证实了caspase-3和caspase-9可通过表达上调促进细胞凋亡过程，且突出节段越多表达量越高。此次研究通过免疫组化方法观察到肥厚黄韧带的细胞染色情况多表现为细胞核染色呈棕黄色或棕褐色，细胞排列紊乱，正常形态结构消失，胞核变小，胞膜皱缩，着色深，且caspase-3表达高于对照组，可能肥厚黄韧带组织中caspase-3的表达与黄韧带细胞凋亡具有一定的相关性。

Fas蛋白又称为Apo-1或CD95，属于肿瘤坏死因子受体(TNFR)/神经生长因子受体(NGFR)家族成员，广泛存在于多种组织细胞。一般认为，Fas蛋白分子中至少有3个与凋亡诱导功能密切相关的结构域：EXT、“死亡”域(DD)和调控区(RR)^[19]。PARK等^[20-21]首次在腰椎间盘细胞内发现Fas分子的表达，并进一步研究证实在退变的腰椎间盘中存在Fas分子表达上调的现象，为后续Fas凋亡途径在椎间盘中的研究奠定了基础。李小川等^[22]表明了Fas/Fasl系统是椎间盘细胞凋亡的主要途径。吕浩然等^[23]试验表明在腰椎退变软骨终板的凋亡中基制降解酶MMP、fas均具有高表达，推测MMP类蛋白酶对细胞外基质的降解和Fas介导的细胞凋亡具有相互协同作用，促进了椎间盘的退变过程。此次研究观察到肥厚黄韧带的细胞染色多表现为细胞核染色呈棕黄色或棕褐色，细胞排列相对紊乱，正常形态结构消失，胞膜皱缩，着色深，黄染比例及染色程度高于对照组，可能肥厚黄韧带组织中fas的表达与黄韧带细胞凋亡具有一定的相关性。

p53基因对防止细胞增生和保持DNA受损基因组的完整性有重要作用，p53基因因其表达产物即分子质量53 kD的磷酸递传的凋亡信号后，主要经内源性和外源性2种途径引发细胞程序性死亡^[24]。LU等^[25]通过免疫组化研究表明血管内皮生长因子和p53基因协同表达在退行性椎间盘组织中，共同作用于新生血管和浸润，可加速椎间盘组织变性。YURUBE等^[26]通过鼠尾模型模拟人类椎间盘衰老和变性中的脊索细胞消失和凋亡细胞死亡，持续的静态压迫通过死亡-受体途径诱导细胞凋亡的瞬时活化，并通过p53介导的椎间盘细胞中的线粒体途径持续激活细胞凋亡。此次研究发现实验组肥厚黄韧带多表现为细胞核染色呈棕黄色或棕褐色，细胞排列紊乱，正常形态结构消失，胞核变小，胞膜皱缩，表明p53表达高于对照组，可能肥厚黄韧带组织中p53的表达与黄韧带细胞凋亡具有一定的相关性。

黄韧带位于相邻的椎弓板之间，前面构成椎管后壁，后面与棘间韧带相邻，主要作用是限制脊柱过度前屈和维持人体直立姿势，它是脊柱后部的重要连接结构，主要由弹性纤维、胶原纤维、网状纤维及基质4种成分构成，其中弹性纤维所占比例达75%左右^[27]。随着年龄的增加，黄韧带易出现肥大、钙化和骨化等退变反应，黄韧带退变肥厚是导致腰椎管狭窄症的重要因素之一。对于黄韧带的凋亡相关研究报道不多，此次研究通过TUNEL染色及免疫组化方法得出肥厚黄韧带组织中细胞凋亡增加，caspase-3、fas和p53的表达与黄韧带细胞凋亡具有一定的相关性。LIANG等^[28]通过建立了一个永生化髓核(NP)细胞系稳定转染重组人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因延长复制能力，发现这些细胞可以通过20多个世代，基因没有显着变化且Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达水平无显著变化，进一步证实NP细胞中hTERT的过度表达不仅可以预防血清饥饿引起的细胞凋亡和G₁细胞周期停滞，也可以抑制基因caspase-3、Fas和p53的表达，它可能为通过调节凋亡基因的表达治疗椎间盘退变提供新的治疗策略。此次研究没有继续研究控制凋亡的相关方法，那么黄韧带的退变凋亡是否也可以通过基因的调控来预防及减缓，可能成为今后治疗腰椎管狭窄症的重要研究领域。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：
黄韧带：由左右两部分组成，韧带上下分别附着于上位椎板的前下方，下位椎板的上缘，连接椎弓板，参与围成椎管，控制脊柱过度前屈，维持脊柱稳定。黄韧带肥厚可造成椎管管腔减小及椎间孔狭窄，硬膜囊和脊神经根的压迫，从而产生临床症状。
免疫组织化学技术：是用标记的特异性抗体(或抗原)对组织内的抗原(或抗体)的分布进行定位、定性、定量检测，经过组织化学呈色反应在组织原位显示抗原(或抗体)，如各种蛋白质、多肽、磷脂和多糖等成分的一门技术。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

黄韧带位于相邻的椎弓板之间，前面构成椎管后壁，后面与棘间韧带相邻，主要作用是限制脊柱过度前屈和维持人体直立姿势，它是脊柱后部的重要连接结构，主要由弹性纤维、胶原纤维、网状纤维及基质4种成分构成，其中弹性纤维所占比例约达75%左右。随着年龄的增加，黄韧带易出现肥大、钙化和骨化等退变反应，黄韧带退变肥厚是导致腰椎管狭窄症的重要因素之一。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程