胸椎黄韧带骨化患者的差异蛋白组学研究

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.3202

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (17): 2625-2629.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.3202

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胸椎黄韧带骨化患者的差异蛋白组学研究

胡万东，何佳林，张隆盛，廖文波

遵义医科大学附属医院脊柱外科，贵州省遵义市 563000

收稿日期:2020-08-15 修回日期:2020-08-18 接受日期:2020-10-16 出版日期:2021-06-18 发布日期:2021-01-07
通讯作者: 廖文波，博士，教授，遵义医科大学附属医院脊柱外科，贵州省遵义市 563000
作者简介:胡万东，男，1990年生，贵州省务川县人，仡佬族，遵义医科大学在读硕士，主要从事组织工程和脊柱退行性变研究。
基金资助:
贵州省科学技术基金项目(黔科合J字[2007]2221)，项目负责人：廖文波

Differential proteomics study of patients with sternal ossification of the ligamentum flavum

Hu Wandong, He Jialin, Zhang Longsheng, Liao Wenbo

Department of Spine Surgery, Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi 563000, Guizhou Province, China

Received:2020-08-15 Revised:2020-08-18 Accepted:2020-10-16 Online:2021-06-18 Published:2021-01-07
Contact: Liao Wenbo, MD, Professor, Department of Spine Surgery, Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi 563000, Guizhou Province, China
About author:Hu Wandong, Master candidate, Department of Spine Surgery, Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi 563000, Guizhou Province, China
Supported by:
the Science and Technology Foundation of Guizhou Province, No. [2007]2221 (to LWB)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
黄韧带骨化：是脊柱韧带的一种病理性异位骨化性疾病，由纤维组织转化成骨性组织的过程。有黄韧带附着的脊柱部位均可发生，其中尤以T10-T12发病率最高。
生物信息学：是生物学、计算机科学、信息工程、数学和统计学的综合学科，主要内容是使用生物算法和相关的软件工具采集、处理、存储、分析和解释生物数据。其研究重点主要体现在基因组学(Genomics)和蛋白质组学(Proteomics)两方面，具体说就是从核酸和蛋白质序列出发，分析序列中表达的结构功能的生物信息。生物信息学已成为许多生物学领域研究的重要组成部分。

背景：针对胸椎黄韧带骨化发病原因及机制研究主要集中在功能基因组的研究，而从蛋白组学对其进行研究者甚少。
目的：探讨胸椎黄韧带骨化患者骨化黄韧带与正常黄韧带组织差异蛋白质，寻找发病相关靶点蛋白。
方法：收集3例胸椎黄韧带骨化患者的骨化黄韧带和相邻水平正常黄韧带组织，通过蛋白质提取、定量、同位素标记相对和绝对定量TMT技术标记肽段，运用液相色谱 - 串联质谱(LC-MS/MS)技术鉴定及筛选差异蛋白质。
结果与结论：①共鉴定出差异表达蛋白质589种，其中表达上调蛋白质532种，表达下调蛋白质57种；②进一步分析鉴定出与炎性相关蛋白质共23种，其中蛋白CYBB、PODXL、S100A12、LXN、S100A10、GJA1、LIPA、FOLR2、CYBA、IFI16、ABCF1、HMGB1、RPS19、PRDX5、MAP2K3表达上调，蛋白KRT14、IL17D、IL1RAP、SLC7A2、RHOB、COMP、KRT6B表达下调；③这些炎性相关蛋白可能是参与胸椎黄韧带骨化疾病发生发展的靶点蛋白，尤其S100A10、FOLR2、S100A12、HMGB1这4种炎性相关蛋白在胸椎黄韧带骨化疾病发生发展中可能起重要作用，成为诊治的重要靶点。

https://orcid.org/0000-0002-0910-7619 (胡万东)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 黄韧带, 骨化, 蛋白质组学, 组织, TMT技术

Abstract: BACKGROUND: The research on the pathogenesis and mechanism of thoracic ossification of the ligamentum flavum mainly focuses on the research of functional genome; however, less is reported on it from proteomics.
OBJECTIVE: To investigate the differential proteins between ossified ligamentum flavum and normal ligamentum flavum in patients with thoracic ossification of the ligamentum flavum, and to search for disease-related target proteins.
METHODS: Ossified ligamentum flavum and adjacent normal ligamentum flavum samples were collected from three patients with thoracic ossification of the ligamentum flavum, and detected through protein extraction, quantification, isotope labeling for relative and absolute quantitative technique-labeled peptides. Differentially expressed proteins were identified and screened by liquid chromatography-tandem mass spectrometry.
RESULTS AND CONCLUSION: Totally 589 kinds of differentially expressed proteins were identified, including 532 up-regulated proteins and 57 down-regulated proteins. Further analysis identified 23 kinds of proteins related to inflammation, among which, the expression of CYBB, PODXL, S100A12, LXN, S100A10, GJA1, LIPA, FOLR2, CYBA, IFI16, ABCF1, HMGB1, RPS19, PRDX5, MAP2K3 was up-regulated, and the expression of KRT14, IL17D, IL1RAP, SLC7A2, RHOB, COMP, KRT6B was down-regulated. These inflammation-related proteins may be important diagnostic and therapeutic targets involved in the occurrence and development of thoracic ossification of the ligamentum flavum.

Key words: ligamentum flavum, ossification, proteomics, tissue, TMT technology

中图分类号:

胡万东, 何佳林, 张隆盛, 廖文波. 胸椎黄韧带骨化患者的差异蛋白组学研究[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(17): 2625-2629.

Hu Wandong, He Jialin, Zhang Longsheng, Liao Wenbo. Differential proteomics study of patients with sternal ossification of the ligamentum flavum[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(17): 2625-2629.

图/表（结果） 3

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引言

黄韧带骨化是脊柱韧带的一种病理性异位骨化性疾病，由纤维组织转化成骨性组织的过程。有黄韧带附着的脊柱部位均可发生，其中尤以T10-T12发病率最高[1-2]。胸椎黄韧带骨化是引起胸椎管狭窄及脊髓卡压的最常见原因[3]，其进一步发展也可导致脊髓损伤，甚至发生截瘫，从而给患者带来严重的后果。目前手术是治疗该疾病的唯一方法，早期筛查和诊断胸椎黄韧带骨化并提前做出预防对于患者的诊治非常重要。
目前胸椎黄韧带骨化发病相关机制主要集中在转录组及基因组水平研究，先前有研究表明氟中毒、遗传背景、饮食习惯、代谢异常、机械应力及炎症等因素与胸椎黄韧带骨化发病有关[4-8]，但胸椎黄韧带骨化的病因及发病机制仍不清楚。与很多疾病一样，胸椎黄韧带骨化的疾病过程也被认为与蛋白质的特定定量及功能变化有关。有研究报道通过蛋白质组学可鉴定病理组织的生物标志物[9]。目前蛋白组学在后纵韧带骨化、骨质疏松、强直性脊柱炎、腰椎管狭窄症、骨肿瘤及骨关节炎等骨相关疾病中研究报道[10-15]。蛋白组学在胸椎黄韧带骨化中研究甚少，极少有研究报道，虽然Wang等[2]、姜宇等[16]对胸椎黄韧带骨化进行了蛋白组学研究报道，但仍没有找到能够阐明与胸椎黄韧带骨化发病的相关靶点蛋白。此次研究旨在通过同位素标记相对和绝对定量TMT(Tandem Mass Tag)联合液相色谱 - 串联质谱(LC-MS/MS)技术，将胸椎黄韧带骨化患者的骨化黄韧带和正常黄韧带进行比较，筛选出差异蛋白质，明确差异蛋白质功能，寻找胸椎黄韧带骨化发病相关靶点蛋白，为找到病因及发病机制提供理论依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计差异蛋白鉴定及生物信息学分析。
1.2 时间及地点实验于2017年10月至2019年5月在遵义医科大学附属医院完成。
1.3 对象收集遵义医科大学附属医院胸椎黄韧带骨化患者3例，2例女性，1例男性，年龄分别为50，52，58岁。术前均签署知情同意书，并经遵义医科大学附属医院伦理委员会同意。
1.3.1 纳入标准术前通过体格检查、X射线片、CT和MRI确认了胸椎黄韧带骨化的诊断。
1.3.2 排除标准排除其他系统性病变或器质性病变。
1.4 材料 BCA 定量试剂盒(碧云天)；乙腈 (Merck)；Urea试剂盒、TMT试剂盒(Thermo Fisher)；C18 分析柱(Thermo Fisher)；RP 色谱柱(Waters)；Easy nLC 色谱系统 (Thermo Fisher)；Q Exactive plus 质谱仪 (Thermo Fisher)；分析软件：Proteome Discoverer 2.1 (Thermo Fisher)。
1.5 方法
1.5.1 黄韧带标本组织采集与保存在脊柱外科手术期间，无菌获取骨化黄韧带和非骨化区正常黄韧带组织，小心剔除周围软组织，将附有血渍的标本用PBS洗净，液氮固定30 min，保存在-80 ℃至使用。
1.5.2 蛋白质提取、定量将组织加入SDT 裂解液(4%SDS)，转移至 Lysing Matrix A 管中，用 MP 匀浆仪匀浆破碎2次。超声处理后，沸水浴10 min。14 000 ×g离心15 min，取上清过滤，然后收集滤液。采用 BCA 法进行蛋白质浓度测定。将样品分装后冻存于-20 ℃。
1.5.3 FASP 酶解、TMT标记各样品取 150 μg 蛋白质溶液，分别加入 DTT 至终浓度为 100 mmol/L，沸水浴 5 min，冷却至室温。加入200 μL UA buffer混匀，转入 30 kD 超滤离心管中，12 500×g离心15 min，弃滤液(重复1次)。加入100 μL IAA buffer，600 r/min 振荡 1 min，室温避光孵育30 min，离心12 500×g 15 min。加入100 μL UA buffer后以12 500×g 离心15 min，重复2次。加入100 μL 40 mmol/L NH4HCO3溶液，12 500×g离心1 min，重复2次。加入40 μL Trypsin buffer，600 r/min振荡1 min，37 ℃放置 16-18 h。换收集管，
12 500×g离心15 min；再加入20 μL 40 mmol/L NH4HCO3溶液，12 500×g离心15 min，收集滤液。采用C18 Cartridge 对肽段进行脱盐，肽段冻干后加入40 μL 0.1%甲酸溶液复溶，将A值设置到280时进行肽段定量。各样品分别取100 μg肽段，按照Thermo公司TMT标记试剂盒说明书进行标记。
1.5.4 Easy nLC 色谱每份样品采用纳升流速 Easy nLC 系统进行分离。缓冲液A液为 0.1%甲酸水溶液，B液为 0.1%甲酸乙腈水溶液(乙腈为 80%)。色谱柱以 100%的A液平衡，将样品上样到分析柱分离，流速为300 nL/min。使用2 h梯度：0-5 min，B液 6%；5-75 min，B液线性梯度从6%-38%；75-85 min，B液线性梯度从38%-100%； 85-90 min，B液维持在 100%。
1.5.5 质谱鉴定样品经色谱分离后用Q Exactive plus 质谱仪进行质谱分析。分析时长为 120 min，以正离子为检测方式，母离子扫描范围 350-1 800 m/z，一级质谱分辨率为 70 000，AGC target为 3e6，一级Maximum IT为 50 ms。多肽和多肽碎片的质量电荷比按照此方法采集：每次全扫描(full scan)后采集10个碎片图谱(MS2 scan)，MS2 Activation Type为 HCD，Isolation window为2 m/z，二级质谱分辨率35 000，Microscans 为 1，二级 Maximum IT为 45 ms，Normalized
Collision Energy 为30 eV。
1.5.6 质谱数据库搜索实验使用 Proteome Discoverer 2.1(Thermo Fisher Scientific)软件将Q Exactive plus 产生的原始图谱文件(.raw文件)转化为.mgf 文件，提交到
MASCOT2.6服务器进行数据库检索。然后通过Proteome
Discoverer 2.1将MASCOT服务器上形成的查库文件传回软件，按照FDR< 0.01 的标准对数据进行筛选，获得高度可信的定性结果。
1.6 主要观察指标差异蛋白鉴定结果，生物信息学分析结果。

讨论

胸椎黄韧带骨化是一种脊柱韧带异位骨化性疾病，其发病隐匿[3]，早期无明显的临床症状，患者就诊时往往已出现严重症状，严重影响患者的生活质量。目前体格检查结合CT和MRI等检查方法是确诊胸椎黄韧带骨化的主要方法，但因胸椎黄韧带骨化的病因及发病机制仍不清楚，治疗上除了脊柱外科手术外，并无其他有效的治疗方法，所以寻找胸椎黄韧带骨化发病的靶点蛋白对于胸椎黄韧带骨化辅助诊治尤为重要。
蛋白质组学的重要作用就是可寻找和发现疾病的差异表达蛋白质，有助于解析疾病的发病机制及疾病的诊治。相关研究表明炎性蛋白能促进黄韧带细胞成骨分化，并引起黄韧带骨化[2，8]，提示炎性蛋白在胸椎黄韧带骨化中具有重要作用，但具体机制尚不清楚。此次研究通过TMT联合LC-MS/MS技术及GO分析鉴定出23种炎性相关差异蛋白，进一步分析与胸椎黄韧带骨化发生发展相关因素后发现，钙结合蛋白A10(protein S100-A10，S100A10)、叶酸受体β、钙结合蛋白A12(protein S100-A12，S100A12)、高迁移率族蛋白B1
(high mobility group protein B1，HMGB1)不仅参与炎性过程而且与成骨分化、骨形成及血管钙化形成有关，可能作为靶点蛋白在胸椎黄韧带骨化中发挥作用。
S100A10属于S100蛋白家族之一，也称为p11或膜联蛋白轻链，S100A10与膜联蛋白A2结合形成异四聚体复合物在膜结构中发挥作用[17-18]。有研究表明S100A10在矿化鹿角软骨区域表达且在储备间质细胞成骨分化过程中上调，在小鼠C3H10T1/2细胞系中S100A10的过表达增加了成骨基因表达、碱性磷酸酶活性及钙矿化作用[19]。LI等[20]研究表明，Cu-BG/PET移植物在体外显著促进了成骨分化，促进了成骨骨相关基因表达以及蛋白质分泌(骨形态发生蛋白2，骨钙素，S100A10)，表明S100A10可能参与了成骨分化。CMOCH等[21]研究结果表明，S100A10可能与基质囊泡引发矿化基质形成有关，在矿化的基质囊泡中发现了S100A10，而未矿化的基质囊泡未发现。此次研究发现S100A10在胸椎黄韧带骨化中表达上调，提示S100A10在胸椎黄韧带骨化发病中发挥重要作用，其机制可能与促进成骨分化有关，这可能为S100A10在胸椎黄韧带骨化中的靶向诊治提供新思路。
叶酸受体是一种细胞表面糖基化磷脂酰肌醇连接的膜糖蛋白，已知至少存在3种主要亚型：叶酸受体α、叶酸受体β和叶酸受体γ[22-23]。在炎性疾病中叶酸受体β主要在活化的巨噬细胞上高表达，而在正常和静息性巨噬细胞未见高表达，活化的巨噬细胞会引起或促进类风湿性关节炎、骨性关节炎及动脉粥样硬化等炎性疾病发生[24]。已有研究证实类风湿性关节炎中活化的巨噬细胞特异性表达叶酸受体β，在类风湿性关节炎的发病机制中活化的巨噬细胞起着至关重要的作用，并将叶酸受体β作为叶酸-纳米粒子药物作用的靶点对类风湿性关节炎进行靶向治疗[25]。功能性叶酸受体β在骨性关节炎的滑膜活化巨噬细胞上表达，因此叶酸受体β可能在骨性关节炎的诊断和治疗中具有重要的作用，可能是骨性关节炎诊治的潜在靶点[26]。WINKEL等[27]研究发现叶酸受体β在活化的巨噬细胞上表达，且对动脉粥样硬化中活化的巨噬细胞起重要作用；如MÜLLER等[28]研究证实相较于正常动脉壁在动脉粥样硬化斑块中叶酸受体β表达水平升高。这些研究表明叶酸受体β在炎症反应及钙化的过程中具有重要作用。此次研究结果显示，叶酸受体β蛋白在胸椎黄韧带骨化中表达上调，推测叶酸受体β可能通过参与炎症过程而促进胸椎黄韧带骨化发生发展。
S100A12是钙结合蛋白(S100)，在调节炎症过程和免疫反应中发挥重要作用[29-30]，有研究发现S100A12与Toll样受体4和晚期糖基化终产物的受体结合后激活细胞外调节激酶1/2(ERK1/2)、核因子κB等信号通路并促进肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β及白细胞介素8等促炎细胞因子的释放，从而促进炎症的发生发展[1， 31-32]。HOFMANN等[33]通过对血管平滑肌细胞分泌的S100A12进行研究发现，在炎性环境条件下S100A12的表达促进并增加了成骨细胞基因的表达，且表达S100A12的小鼠主动脉粥样硬化斑块钙化明显增加，这说明S100A12能促进动脉粥样硬化诱导骨的形成，并加速血管钙化。有研究报道细胞外晚期糖基化终产物结合蛋白S100A12(EN-RAGE)和晚期糖基化终产物的可溶性受体结合参与了血管钙化的过程[34]。此次研究发现，胸椎黄韧带骨化患者S100A12表达上调，提示S100A12在胸椎黄韧带骨化发病中可能是通过促炎作用，促进成骨形成，参与胸椎黄韧带骨化发生发展。
HMGB1是一种高度保守的核蛋白，诱导炎性反应是HMGB1的一个生物学效应。HMGB1通过激活嗜中性粒细胞白细胞介素1、白细胞介素8和肿瘤坏死因子α等促炎性细胞因子的产生而参与炎症和相关疾病发生发展过程[35]。PARK等[8]研究发现白细胞介素1α、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、前列腺素2和一氧化氮在内的炎性细胞因子会影响黄韧带代谢，从而引起骨化。另有研究表明在胸椎黄韧带骨化患者中肿瘤坏死因子α的蛋白水平增加，且肿瘤坏死因子α能诱导胸椎黄韧带骨化患者原代韧带细胞中成骨细胞基因的表达[2]。在LIN等[36]研究中发现HMGB1与晚期糖基化终产物和Toll样受体2/4结合，激活p38丝裂原活化蛋白激酶
(p38-MAPK)和核因子κB信号通路促进骨髓间充质干细胞的成骨分化。CHEN等[37]研究表明HMGB1通过激活ERK信号通路促进成骨相关基因的表达促进成骨并加速骨折愈合。上述研究说明HMGB1在成骨或者骨化过程中发挥着重要作用。此次研究结果中发现，胸椎黄韧带骨化患者HMGB1蛋白表达上调，推测HMGB1可能与胸椎黄韧带骨化疾病的发生发展相关。
综上所述，此次研究通过运用TMT联合 LC-MS/MS 的蛋白组学方法并进行GO分析筛选出胸椎黄韧带骨化差异蛋白，通过对S100A10、FOLR2、S100A12、HMGB1等4种炎性相关的差异蛋白质的进一步分析，发现与胸椎黄韧带骨化发生发展过程之间可能具有潜在的联系，推测可能是胸椎黄韧带骨化的分子机制的重要作用靶点。然而，目前这4种蛋白在胸椎黄韧带骨化疾病中未见相关报道，因此，进一步研究这4种蛋白在胸椎黄韧带骨化中的可能作用及机制对于探索胸椎黄韧带骨化病因、发病机制具有重要的意义，可能为胸椎黄韧带骨化的诊治提供新思路。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

胸椎黄韧带骨化患者的差异蛋白组学研究

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[1]	张同同, 王中华, 文杰, 宋玉鑫, 刘林. 3D打印模型在颈椎肿瘤手术切除与重建中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1335-1339.
[2]	张超, 吕欣. 髋臼骨折固定后的异位骨化：危险因素、预防及其治疗进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1434-1439.
[3]	申晋波, 张林. 急性力竭运动导致大鼠跟腱微损伤的超微结构变化及机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1190-1195.
[4]	李静, 谢建山, 崔慧林, 曹锡梅, 杨艳萍, 李海荣. 不同毛色小鼠背部皮肤中甘油二酯激酶ζ和蛋白激酶CβⅡ的表达和定位[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1196-1200.
[5]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.
[6]	徐东紫, 张婷, 欧阳昭连. 心脏组织工程领域全球专利竞争态势分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 807-812.
[7]	吴子健, 胡昭端, 谢有琼, 王峰, 李佳, 李柏村, 蔡国伟, 彭锐. 3D打印技术与骨组织工程研究文献计量及研究热点可视化分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 564-569.
[8]	常文辽, 赵杰, 孙晓亮, 王锟, 吴国锋, 周剑, 李树祥, 孙晗. 人工骨膜的材料选择、理论设计及生物仿生功能[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 600-606.
[9]	刘旒, 周箐竹, 龚桌, 刘博言, 杨斌, 赵娴. 胶原/无机材料构建组织工程骨的特点及制造技术[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 607-613.
[10]	刘飞, 崔宇韬, 刘贺. 局部抗生素递送系统治疗骨髓炎的优势与问题[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 614-620.
[11]	叶海民, 丁凌华, 孔维豪, 黄祖泰, 熊龙. 多级微管结构骨支架载体促进成骨成血管作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 621-625.
[12]	李晓壮, 段浩, 王伟舟, 唐志宏, 王旸昊, 何飞. 骨组织工程材料治疗骨缺损疾病在体内实验中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 626-631.
[13]	张振坤, 李喆, 李亚, 王莹莹, 王亚苹, 周馨魁, 马珊珊, 关方霞. 海藻酸盐基水凝胶/敷料在创面愈合中的应用：持续、动态与顺序释放[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 638-643.
[14]	陈佳娜, 邱燕玲, 聂敏海, 刘旭倩. 组织工程支架材料修复口腔颌面部软组织缺损[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 644-650.
[15]	邢浩, 张永红, 王栋. 长骨大段骨缺损修复方法的优势与不足[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(3): 426-430.