威灵仙提取物可促进体外牵张应力环境下软骨细胞表型的维持

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1857

中国组织工程研究 ›› 2020, Vol. 24 ›› Issue (8): 1182-1187.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1857

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威灵仙提取物可促进体外牵张应力环境下软骨细胞表型的维持

涂鹏程¹，郭杨^1，2，马勇^1，2，潘娅岚¹，郑苏阳¹，王礼宁¹，吴承杰¹，过俊杰¹

¹南京中医药大学骨伤研究所骨伤修复与重建新技术实验室，江苏省南京市 210023；²南京中医药大学附属医院骨伤科，江苏省南京市 210029

收稿日期:2019-02-23 修回日期:2019-04-02 接受日期:2019-05-23 出版日期:2020-03-18 发布日期:2020-01-20
通讯作者: 马勇，博士，教授，主任医师，南京中医药大学骨伤研究所骨伤修复与重建新技术实验室，江苏省南京市 210023；南京中医药大学附属医院骨伤科，江苏省南京市 210029
作者简介:涂鹏程，男，1994年生，安徽省宣城市人，汉族，在读硕士，主要从事中医药治疗骨伤科疾病的研究。
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(81673995)；江苏省自然科学基金青年基金项目(BK20151007)；江苏省研究生科研创新计划(KYCX17_1308)；2018年地方高校国家级大学生创新训练计划(201810315008)

Phenotypic maintenance of chondrocytes in vitro under tensile stress enhanced by the extract of Clematis chinensis

Tu Pengcheng¹, Guo Yang^{1, 2}, Ma Yong^{1, 2}, Pan Yalan¹, Zheng Suyang¹, Wang Lining¹, Wu Chengjie¹, Guo Junjie¹

¹Institute of Traumatology & Orthopedics and Laboratory of New Techniques of Restoration & Reconstruction of Orthopedics and Traumatology, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, Jiangsu Province, China; ²Department of Traumatology & Orthopedics, Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210029, Jiangsu Province, China

Received:2019-02-23 Revised:2019-04-02 Accepted:2019-05-23 Online:2020-03-18 Published:2020-01-20
Contact: Ma Yong, MD, Professor, Chief physician, Institute of Traumatology & Orthopedics and Laboratory of New Techniques of Restoration & Reconstruction of Orthopedics and Traumatology, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, Jiangsu Province, China; Department of Traumatology & Orthopedics, Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210029, Jiangsu Province, China
About author:Tu Pengcheng, Master’s candidate, Institute of Traumatology & Orthopedics and Laboratory of New Techniques of Restoration & Reconstruction of Orthopedics and Traumatology, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, Jiangsu Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81673995; the Natural Science Foundation of Jiangsu Province (Youth Program), No. BK20151007; Jiangsu Provincial Graduate Research Innovation Program, No. KYCX17_1308; National Students’ Innovation Training Program for Local Universities in 2018, No. 201810315008

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

牵张应力环境：即向各个方向拉伸的受力环境。通过FLEXCELL-5000拉力培养系统给予软骨细胞稳定、间歇性的平面拉伸运动，使细胞处在受力环境中生长，模拟拉力、剪切力等软骨细胞所受的生物力学刺激。

软骨细胞表型：正常软骨细胞以基质蛋白Ⅱ型胶原的分泌为标志，处在基质合成分解相对平衡的稳定状态，软骨细胞发生退行性病变时，其Ⅱ型胶原分泌降低，而基质金属蛋白酶等表达上调，代谢平衡打破，分解代谢上调。

背景：机械负荷是软骨细胞退行性改变及骨关节炎发展过程中的重要因素，威灵仙能够改善骨关节炎炎性微环境，但其对机械负荷诱导的软骨细胞退行性改变的作用尚未阐明。

目的：探讨威灵仙提取物对体外间歇性循环牵张拉伸诱导的软骨细胞退行性改变的影响及机制。

方法：Ⅱ型胶原酶消化法分离兔膝关节软骨细胞并通过阿利新蓝染色鉴定；实验将软骨细胞分为5组：空白组、间歇性循环牵张拉伸组、威灵仙低、中、高质量浓度组。空白组无任何干预，其他4组利用FLEXCELL-5000T牵张拉伸系统对软骨细胞施加间歇性循环牵张拉伸(10%拉伸强度、8 h/d、0.5 Hz、2 d)刺激，诱导软骨细胞退行性改变，威灵仙各组在施加相同的刺激同时添加0.5，1，2 g/L威灵仙提取物，干预48 h；CCK-8法检测各组软骨细胞增殖活性；FITC-鬼笔环肽染色观察各组细胞骨架形态；实时定量PCR和蛋白免疫印迹法检测各组细胞Ⅱ型胶原、基质金属蛋白酶13、转化生长因子β的表达。

结果与结论：①与空白组相比，间歇性循环牵张拉伸刺激后软骨细胞骨架呈长条状拉伸状态，细胞增殖活性降低，转化生长因子β、Ⅱ型胶原表达均下调，而基质金属蛋白酶13表达上调；②与间歇性循环牵张拉伸组相比，威灵仙提取物能够促进软骨细胞增殖，上调转化生长因子β、Ⅱ型胶原表达，下调基质金属蛋白酶13表达，且效果与质量浓度相关；③结果表明，威灵仙提取物能够通过调控转化生长因子β表达抑制间歇性循环牵张拉伸诱导的软骨细胞分解代谢，促进软骨细胞外基质的合成，维持软骨细胞表型稳定。

ORCID: 0000-0003-0930-0467(涂鹏程)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 威灵仙, 软骨细胞, 牵张拉伸, 机械力, 基质金属蛋白酶, Ⅱ型胶原, 转化生长因子β, 细胞表型, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Mechanical load is crucial for the degeneration of chondrocytes and the development of osteoarthritis. Clematis chinensis can improve the inflammatory microenvironment of osteoarthritis, but its effect on mechanical load-induced degeneration of chondrocytes has not been elucidated.

OBJECTIVE: To study the effect and mechanism of the extracts of Clematis chinensis on the degenerative changes of chondrocytes induced by intermittent cyclic mechanical tension (ICMT) in vitro.

METHODS: Chondrocytes of the rabbit knee joint were isolated by type II collagenase digestion method and identified by Alcian blue staining. There were five groups in the experiment: blank group, ICMT group, high-, medium- and low-dose Clematis chinensis groups. There was no intervention in the blank group, and the other groups were subjected to ICMT (10% tensile strength, 0.5 Hz, 8 hours per day, for a total of 2 days) for inducing chondrocyte degeneration. Three Clematis chinensis groups were concurrently given 0.5, 1, 2 g/L extracts of Clematis chinensis, respectively. The intervention time was 48 hours. Cell counting kit-8 assay was used for detection of chondrocyte proliferation. FITC-phalloidin staining was used for observation of cytoskeleton morphology. Real-time quantitative PCR and western blot assay were used for determination of collagen type II, matrix metalloproteinase 13, and transforming growth factor β at protein and gene levels, respectively.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) Compared with the blank group, the cytoskeleton of chondrocytes stimulated by ICMT was long- stretched, the proliferation activity of chondrocytes decreased, and the expressions of collagen type II and transforming growth factor β were down-regulated, while the expression of matrix metalloproteinase 13 was up-regulated. (2) Compared with the ICMT group, the extract of Clematis chinensis could promote the proliferation of chondrocytes, up-regulate the expressions of transforming growth factor β and collagen II, and down-regulate the expression of matrix metalloproteinase 13 in a concentration-dependent manner. To conclude, the extract of Clematis chinensis can inhibit the catabolism of chondrocyte induced by ICMT through regulating the expression of transforming growth factor β, promote the synthesis of extracellular matrix of chondrocytes, and maintain the phenotypic stability of chondrocytes.

Key words: Clematis chinensis, chondrocyte, stretching, mechanical force, matrix metalloproteinase, type II collagen, transforming growth factorβ, cell phenotype, National Natural Science Foundation of China

中图分类号:

涂鹏程, 郭杨, 马勇, 潘娅岚, 郑苏阳, 王礼宁, 吴承杰, 过俊杰. 威灵仙提取物可促进体外牵张应力环境下软骨细胞表型的维持[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1182-1187.

Tu Pengcheng, Guo Yang, Ma Yong, Pan Yalan, Zheng Suyang, Wang Lining, Wu Chengjie, Guo Junjie. Phenotypic maintenance of chondrocytes in vitro under tensile stress enhanced by the extract of Clematis chinensis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2020, 24(8): 1182-1187.

图/表（结果） 5

2.1 软骨细胞阿利新蓝染色鉴定结果镜下观察，分离的软骨细胞单层生长，呈典型的铺路石样，细胞外观为多角形，胞核明显，胞浆内可见折光的颗粒，见图1A，B；阿利新蓝染色阳性，可见软骨细胞呈蓝色，胞内及细胞周围可见深蓝色异染颗粒，见图1C，D。

2.2 各组软骨细胞的骨架形态学变化 FITC-鬼笔环肽染色显示：空白组软骨细胞密集，界限不明显，细胞骨架紊乱交错；间歇性循环牵张拉伸组软骨细胞形态完整明显，细胞连接紧密整齐，细胞骨架沿着力的方向被显著拉伸变长；低、中、高质量浓度威灵仙组与间歇性循环牵张拉伸组软骨细胞形态类似，连接紧密明显而伸长，见图2。威灵仙各组细胞骨架形态并无明显区别。

2.3 各组软骨细胞细胞增殖活力的改变 CCK-8检测结果显示：与空白组相比，间歇性循环牵张拉伸组软骨细胞增殖活力明显降低(P < 0.05)；与间歇性循环牵张拉伸组相比，低、中、高质量浓度威灵仙组均能改善牵张拉伸刺激造成的增殖活力降低，且与质量浓度呈负相关，低质量浓度威灵仙(0.5 g/L)效果最好(P < 0.05)，见图3。

2.4 各组软骨细胞Ⅱ型胶原、转化生长因子β、基质金属蛋白酶13的mRNA表达实时定量PCR结果显示：与空白组比较，间歇性循环牵张拉伸组Ⅱ型胶原、转化生长因子β的mRNA表达均显著降低(P < 0.05)，而基质金属蛋白酶13的mRNA表达明显升高，差异有显著性意义(P < 0.05)；与间歇性循环牵张拉伸组相比，低质量浓度威灵仙组(0.5 g/L)Ⅱ型胶原、转化生长因子β的mRNA表达均明显升高(P < 0.05)，而基质金属蛋白酶13 mRNA表达显著降低(P < 0.05)，见图4。

2.5 各组软骨细胞Ⅱ型胶原、转化生长因子β、基质金属蛋白酶13的蛋白表达 Western blot结果显示：与空白组比较，间歇性循环牵张拉伸组Ⅱ型胶原、转化生长因子β蛋白表达均显著降低(P < 0.05)，而基质金属蛋白酶13蛋白表达明显升高(P < 0.05)，差异有显著性意义；与间歇性循环牵张拉伸组相比，高、中、低质量浓度威灵仙组Ⅱ型胶原、转化生长因子β蛋白表达均有上调，基质金属蛋白酶13蛋白表达均有降低，尤其低质量浓度威灵仙组变化显著 (P < 0.05)，见图5。

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引言

材料方法

1.1 设计细胞学体外实验。

1.2 时间及地点实验于2018年10月至2019年2月在南京中医药大学骨伤修复与重建新技术实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 4周龄健康清洁级雄性新西兰大白兔1只，体质量400 g左右，由南京青龙山动物中心提供，动物许可证号SYXK(苏)2018-0011。

1.3.2 实验试剂威灵仙提取物(奥晶，中国)；Ⅱ型胶原酶(美仑，中国)；阿利新蓝染色液(雷根，中国)；低糖DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶(BioInd，以色列)；鬼笔环肽- FITC荧光抗体(翊圣，中国)；Cell Counting Kit-8试剂盒、RNA提取试剂盒(诺韦赞，美国)；ReverTraAce qPCR反转录试剂盒、SYBR Green Realtime PCR Master Mix定量试剂盒(TaKaRa, 日本)；引物合成(上海生工，中国)；小鼠Ⅱ型胶原(Novus，美国)；小鼠基质金属蛋白酶13、转化生长因子β抗体(Abcam，美国)；小鼠GAPDH抗体(Proteintech，中国)；羊抗小鼠二抗(Abcam，美国)。

1.3.3 实验仪器 FE5000细胞牵张拉伸培养系统(FLEXCELL，美国)；EnSpire酶标仪(PerkinElmer，美国)；IX73倒置式荧光显微镜(Olympus，日本)；PCR自动系列化分析仪(ABI，美国)。

1.4 实验方法

1.4.1 软骨细胞的分离培养与鉴定耳缘静脉空气栓塞法处死新西兰大白兔，局部备皮消毒，无菌分离兔膝关节，削下关节透明软骨薄片，剪碎至<1 mm³，含3%双抗的PBS漂洗2遍后，使用0.2%Ⅱ型胶原酶消化6-8 h，消化后的细胞悬液经100 μm滤网滤过，离心，以含体积分数为10%胎牛血清的低糖DMEM培养基重悬，接种至10 cm培养皿，隔天换液，长满80%即可传代，第3代软骨细胞用于细胞实验。

阿利新蓝染色鉴定：第3代软骨细胞接种至含多聚赖氨酸包被玻片的6孔板内，细胞贴壁生长至50%左右，取出爬片，PBS漂洗2次，40 g/L多聚甲醛固定15 min，PBS漂洗2遍，每遍5 min，阿利新蓝浸染10 min，将残余染液洗尽后，倒置显微镜下拍照。

1.4.2 软骨细胞分组取第3代软骨细胞，以5×10⁵接种于牵张拉伸6孔板，威灵仙提取物经含体积分数为10%胎牛血清、1%双抗的低糖DMEM溶解滤过后使用，随机分为5组：空白组(无任何干预)，间歇性循环牵张拉伸组(10%拉伸强度，8 h/d，0.5 Hz，2 d)，威灵仙低、中、高质量浓度组(在施加相同的间歇性循环牵张拉伸刺激同时添加0.5，1，2 g/L威灵仙提取物)，干预48 h。

1.4.3 CCK-8法检测软骨细胞的增殖活力收集各组细胞，以4×10⁴/孔接种至96孔板，加入空白完全培养基，每组设5个复孔，37 ℃、体积分数为5%CO₂培养24 h后，吸弃原培养基，加入新鲜完全培养基100 μL，每孔加入CCK-8溶液10 μL，静置于37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱内孵育4 h，酶标仪测定450 nm处吸光度值。

1.4.4 鬼笔环肽荧光染色观察软骨细胞的骨架形态第3代软骨细胞，以2×10⁵/孔接种至牵张拉伸6孔板，37 ℃、体积分数为5%CO₂条件下各组分别干预48 h后，吸弃培养基，以PBS漂洗(2×5 min)，多聚甲醛固定15 min，加入0.2%Triton X-100破膜处理15 min，FITC-鬼笔环肽抗体(1∶500)室温避光孵育1 h后，DAPI(1∶1 000)室温避光复染细胞核10 min，PBS洗涤(2×5 min)，置于倒置免疫荧光显微镜下观察，分别选取上、下、左、右、中间5个视野拍照。

1.4.5 实时定量PCR检测Ⅱ型胶原、基质金属蛋白酶13、转化生长因子β的mRNA表达取各组干预48 h细胞，柱提法提取总RNA，使用ReverTra Ace qPCR反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，反应条件为37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。利用SYBR Green Realtime PCR Master Mix定量试剂盒配制20 μL体系进样，反应条件为95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s。以GAPDH作为内参，根据公式2^-^∆∆Ct进行半定量分析，引物序列见表1。

1.4.6 Western blot检测Ⅱ型胶原、转化生长因子β、基质金属蛋白酶13蛋白表达水平取各组干预48 h细胞，加入裂解液充分裂解，离心收集总蛋白，经BCA法定量后，取等量蛋白样品加入等体积loading buffer，煮沸10 min后，进行SDS-PAGE凝胶电泳(90 min)，再经转膜60 min，5%奶粉室温封闭2 h，一抗(1∶1 000)4 ℃过夜孵育，二抗(1∶5 000)室温孵育2 h，ECL发光液显色，于凝胶成像系统成像检测Ⅱ型胶原、基质金属蛋白酶13、转化生长因子β蛋白表达，用Image J软件进行蛋白条带灰度分析。

1.5 主要观察指标各组软骨细胞增殖活性、骨架形态以及Ⅱ型胶原、转化生长因子β、基质金属蛋白酶13的表达。

1.6 统计学分析实验数据计量资料以x(_)±s表示，使用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析和SNK-q检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

关节软骨由软骨细胞与大量细胞外基质组成，覆盖在骨关节端，在力的传导、缓冲等方面起到重要作用^[12]。适宜力学负荷能够促进关节软骨基质代谢平衡、刺激软骨生成、改善软骨的生物力学刚度^[13-15]；而高强度力学负荷则是加重或引起骨关节炎的重要因素^[11^，^14]。研究表明，机械负荷过重会刺激软骨细胞分泌多种炎性因子(白细胞介素1、肿瘤坏死因子α等)，同时还能诱导软骨细胞发生表型改变，导致基质成分(Ⅱ型胶原、Aggrecan等)合成降低，基质降解酶分泌增加，造成关节软骨中胶原网络组织的破坏和细胞的衰老凋亡^[16-19]；XU等^[20-22]利用FLEXCELL5000系统对软骨细胞施加超负荷机械刺激(10%拉伸强度、 0.5 Hz、8 h/d、2 d)，显示软骨细胞会发生退行性病变，表现为炎性因子基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶9、基质金属蛋白酶13、诱导型一氧化氮合酶、环氧化酶2的表达上调，Ⅱ型胶原合成减少，且软骨细胞发生矿化改变。

机械负荷对关节软骨细胞的作用过程受多种复杂物理化学信号分子如Wnt、转化生长因子β、Ca²⁺等相互作用调节^[22-24]，但具体机制尚不清晰。转化生长因子β1是转化生长因子β超家族的一员，能够刺激软骨细胞增殖和软骨基质的生成，促进软骨细胞合成代谢，维持其细胞表型稳定^[25-26]。Xiao等^[23]研究发现转化生长因子β能够通过调节压力感受相关分子miR-455-5p阻滞RUNX2基因转录，从而抑制间歇性循环牵张拉伸诱导的软骨细胞退行性改变。因此推测可以利用类似生长因子的作用，增强软骨细胞对力学负荷的抵抗阈值，维持其表型稳定，改善骨关节炎的进展。

威灵仙是重要的祛风胜湿中药，其成分主要为齐墩果酸、常春藤皂苷元等三萜皂苷，能够发挥类生长因子作用^[9-11]，抑制促炎因子一氧化氮、肿瘤坏死因子α、前列腺素E2的释放，增强超氧化物歧化酶的活性，减轻软骨细胞及胶原网络的损伤程度，改善关节软骨修复的微环境^[27-29]，作者前期研究显示1 g/L威灵仙提取物能促进兔膝关节软骨细胞增殖^[30]，威灵仙关节腔注射联合壳聚糖/β-甘油磷酸二钠凝胶复合软骨细胞移植相比空白凝胶复合软骨细胞移植能更好地修复关节软骨缺损^[31]。基于此，该实验研究进一步设计并观察威灵仙提取物(3种质量浓度0.5，1，2 g/L)对机械负荷刺激诱导的软骨细胞退行性改变的改善作用。结果显示威灵仙提取物能促进其基质代谢平衡，维持软骨细胞表型的改善，形态表现与间歇性循环牵张拉伸组类似但排列稍松散；低、中质量浓度威灵仙提取物能显著改善间歇性循环牵张拉伸刺激后软骨细胞增殖活性；低质量浓度(0.5 g/L)威灵仙提取物能显著促进软骨细胞Ⅱ型胶原的分泌，降低基质金属蛋白酶13的表达(P < 0.05)，且还能显著上调转化生长因子β的表达(P < 0.05)。

综上所述，体外实验研究证明：中药威灵仙(0.5 g/L)能够显著改善间歇性循环牵张拉伸刺激(10%、0.5 Hz、 8 h/d、2 d)诱导的软骨细胞表型退变，抑制基质金属蛋白酶13表达，促进软骨基质Ⅱ型胶原生成，提高软骨细胞增殖活力，这种保护作用可能与其上调信号分子转化生长因子β有关。但这种牵张机械力诱导软骨细胞退行性改变的具体机制及中药威灵仙是否还能通过其他途径促进软骨细胞表型维持，这些问题还需要进一步实验探究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

威灵仙提取物可促进体外牵张应力环境下软骨细胞表型的维持

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