脱细胞软骨基质对巨噬细胞极化的调控

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.3185

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (22): 3545-3550.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.3185

• 材料生物相容性 material biocompatibility • 上一篇下一篇

脱细胞软骨基质对巨噬细胞极化的调控

田广招1，2，3，杨振1，2，3，查康康1，2，3，孙志强1，2，3，李旭2，眭翔2，黄靖香2，郭全义2，
刘舒云2

1解放军医学院，北京市 100853；2中国人民解放军第一医学中心骨科研究所，骨科再生医学北京市重点实验室，全军骨科战创伤重点实验室，北京市 100853；3南开大学医学院，天津市 300071

收稿日期:2020-05-23 修回日期:2020-05-27 接受日期:2020-06-19 出版日期:2021-08-08 发布日期:2021-01-20
通讯作者: 刘舒云，副研究员，中国人民解放军第一医学中心骨科研究所，骨科再生医学北京市重点实验室，全军骨科战创伤重点实验室，北京市100853
作者简介:田广招，男，1994年生，四川省资阳市人，汉族，南开大学医学院在读硕士，主要从事关节软骨再生、生物材料免疫相关方向的研究。
基金资助:
国家重点研发计划课题(2018YFC1105900)，项目参与者：刘舒云

Regulatory effect of decellularized cartilage matrix on macrophage polarization

Tian Guangzhao1, 2, 3, Yang Zhen1, 2, 3, Zha Kangkang1, 2, 3, Sun Zhiqiang1, 2, 3, Li Xu2, Sui Xiang2, Huang Jingxiang2, Guo Quanyi2, Liu Shuyun2

1PLA Medical College, Beijing 100853, China; 2Institute of Orthopedics, First Medical Center, Chinese PLA General Hospital, Beijing Key Laboratory of Regenerative Medicine in Orthopedics, Key Laboratory of Musculoskeletal Trauma & War Injuries, PLA, Beijing 100853, China; 3Medical College of Nankai University, Tianjin 300071, China

Received:2020-05-23 Revised:2020-05-27 Accepted:2020-06-19 Online:2021-08-08 Published:2021-01-20
Contact: Liu Shuyun, Associate researcher, Institute of Orthopedics, First Medical Center, Chinese PLA General Hospital, Beijing Key Laboratory of Regenerative Medicine in Orthopedics, Key Laboratory of Musculoskeletal Trauma & War Injuries, PLA, Beijing 100853, China
About author:Tian Guangzhao, Master candidate, PLA Medical College, Beijing 100853, China; Institute of Orthopedics, First Medical Center, Chinese PLA General Hospital, Beijing Key Laboratory of Regenerative Medicine in Orthopedics, Key Laboratory of Musculoskeletal Trauma & War Injuries, PLA, Beijing 100853, China; Medical College of Nankai University, Tianjin 300071, China
Supported by:
the National Key Research and Development Plan Program, No. 2018YFC1105900 (to LSY)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
脱细胞软骨基质：对新鲜软骨组织进行物理粉碎、反复冻融及差速离心，充分去除天然软骨组织内细胞成分而获得的含有正常软骨组织细胞外基质成分的生物活性材料。
巨噬细胞表型极化：巨噬细胞作为一种具有可塑性和多能性的细胞群体，在体内外不同微环境影响下表现出明显的功能差异。根据活化状态和发挥功能的不同，巨噬细胞主要可分为M1型即经典活化的巨噬细胞，和M2型即替代性活化的巨噬细胞。

背景：细胞外基质来源的生物材料在组织工程再生领域应用广泛，近年来生物材料对巨噬细胞表型极化作用受到极大关注。
目的：探究脱细胞软骨基质(decellularized cartilage extracellular matrix，DCM)及胃蛋白酶处理脱细胞软骨基质(pepsin treated decellularized cartilage extracellular matrix，PDCM)对巨噬细胞表型极化的调控作用。
方法：采用物理粉碎、反复冻融及差速离心方法制备猪关节软骨脱细胞软骨基质(DCM)，溶解于胃蛋白酶溶液内得到其生物降解产物(PDCM)。将小鼠巨噬细胞系RAW264.7分5组培养：对照组加入巨噬细胞完全培养基，M1型阳性对照组加入含脂多糖+干扰素γ的完全培养基，M2型阳性对照组加入含白细胞介素4的完全培养基，PDCM组加入含PDCM的完全培养基，胃蛋白酶组加入含胃蛋白酶的完全培养基，培养18 h后进行CD86(M1型巨噬细胞)、CD206(M2型巨噬细胞)免疫荧光染色鉴定。另外将小鼠巨噬细胞系RAW264.7分6组培养：对照组、M1型阳性对照组、M2型阳性对照组、胃蛋白酶组、DCM涂布组与PDCM涂布组，培养24 h后进行CD86、CD206流式细胞术检测。
结果与结论：①免疫荧光结果显示，PDCM组诱导巨噬细胞CD86表达阳性比约为0.13，诱导巨噬细胞CD206表达阳性比约为0.5；②流式细胞术检测结果显示，DCM诱导巨噬细胞表达CD86(20.1%)及CD206(28.8% )，PDCM只诱导巨噬细胞表达CD206(23.2%)；③结果表明，DCM及其生物降解产物PDCM具有促进巨噬细胞M2型极化的作用。
https://orcid.org/0000-0002-7259-0551 (田广招)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 软骨, 材料, 组织工程, 脱细胞, 软骨基质, 巨噬细胞极化, 巨噬细胞表型

Abstract: BACKGROUND: Biomaterials derived from extracellular matrix have been successfully applied in the field of tissue engineering regeneration. In recent years, great attention has been paid to the effect of biomaterials on the phenotypic polarization of macrophages.
OBJECTIVE: To investigate the regulatory effects of decellularized cartilage extracellular matrix (DCM) and pepsin-treated decellularized cartilage extracellular matrix (PDCM) on phenotypic polarization of macrophages.
METHODS: The DCM of the pig was prepared by physical comminution, repeated freeze-thaw and differential centrifugation. The biodegradation product (PDCM) was obtained by dissolving it in pepsin solution. Mouse macrophage cell line RAW264.7 was divided into five groups. In the control group, complete macrophage culture medium was added. In the M1 positive control group, lipopolysaccharide + interferon γ solution was added. In the M2 positive control group, interleukin 4 solution was added. In the PDCM group, PDCM solution was added. In the pepsin group, pepsin solution was added. After 18 hours of culture, immunofluorescence staining for CD86 (M1 type macrophages) and CD206 (M2 type macrophages) was performed. In addition, mouse macrophage cell line RAW264.7 was divided into six groups: control group, M1 positive control group, M2 positive control group, pepsin group, DCM coating group and PDCM coating group. After 24 hours of culture, CD86 and CD206 were detected by flow cytometry.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Immunofluorescence results showed that in the PDCM group, induced CD86 expression ratio was approximately 0.13; induced CD206 expression ratio was approximately 0.5. (2) Flow cytometry results showed that DCM induced CD86 (20.1%) and CD206 (28.8%) expression in macrophages; PDCM only induced CD206 expression (23.2%). (3) The results showed that DCM and its biodegradation products could promote M2 polarization of macrophages.

Key words: cartilage, materials, tissue engineering, decellularized, cartilage matrix, macrophage polarization, macrophage phenotype

中图分类号:

田广招, 杨振, 查康康, 孙志强, 李旭, 眭翔, 黄靖香, 郭全义, 刘舒云. 脱细胞软骨基质对巨噬细胞极化的调控[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3545-3550.

Tian Guangzhao, Yang Zhen, Zha Kangkang, Sun Zhiqiang, Li Xu, Sui Xiang, Huang Jingxiang, Guo Quanyi, Liu Shuyun. Regulatory effect of decellularized cartilage matrix on macrophage polarization[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(22): 3545-3550.

图/表（结果） 6

2.1 DCM及PDCM成分表征及定量为检测制备出DCM及PDCM脱细胞程度与成分保留情况，使用细胞核特异性染料DPAI对涂片进行染色分析，可见材料内无明显细胞成分残留(图1A)，说明脱细胞完全。甲苯胺蓝染色(图1B)及蕃红O染色(图1C)阳性，表明DCM及PDCM内含有糖胺多糖成分，且PDCM内无粗纤维成分，证明胃蛋白酶消化处理彻底。天狼星红染色(图1D)可检测胶原蛋白，结果表明DCM存在较粗胶原纤维，PDCM内胶原纤维长度及直径均降低。DCM冻干粉糖胺多糖定量及羟脯氨酸定量结果表明，DCM冻干粉内含有糖胺多糖11.86 mg/g，换算为含有胶原蛋白为359.07 mg/g(图2)。

2.2 PDCM对巨噬细胞表型极化调控免疫荧光染色鉴定免疫荧光染色结果示，M1型巨噬细胞阳性对照组CD86表达阳性比约为0.55，无CD206阳性细胞，表现为M1型极化；M2型巨噬细胞阳性对照组CD86表达阳性比0.16，CD206表达阳性比约为0.82，表现为M2型极化；PDCM组CD86表达阳性比为0.13，CD206表达阳性表达比约为0.5，表现为以M2型极化为主(图3)。以上结果证明，PDCM以可溶介质形式与未极化M0巨噬细胞培养可以诱导出与白细胞介素4阳性对照组类似的M2型巨噬细胞。

2.3 DCM及PDCM对巨噬细胞表型极化调控流式细胞术检测鉴定为了对比DCM与PDCM对巨噬细胞表型极化调控作用的差异，将DCM匀浆料及PDCM溶液涂布至6孔板内(图4A，B)，相差显微镜观察可见两组材料存在较大差异，DCM含有较粗纤维成分，PDCM组则更加均质；接种细胞培养24 h后，可见不同组间细胞形态发生变化(图5)，M1型阳性对照组细胞呈长梭形，细胞内存在空泡，DCM组巨噬细胞成团生长；收集细胞后涂布表面未发生明显变化(图4C，D)。

流式细胞术检测结果(图6)显示，M1型阳性对照组以CD86阳性(45.3%)M1型巨噬细胞为主；M2型阳性对照组以CD206阳性(64.3%)M2型巨噬细胞为主；DCM与PDCM涂布情况下对巨噬细胞细胞表型极化调控作用存在差异，DCM组分别存在平均20.1%CD86阳性的 M1型巨噬细胞及28.8%CD206阳性的M2型巨噬细胞，而PDCM组CD86阳性近乎为0，含有平均23.2%CD206阳性的M2型巨噬细胞。

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引言

细胞外基质是组织内细胞的复杂动态结构支持，由蛋白质、糖蛋白和多糖组成。人体中的每种组织都具有独特且蛋白质含量多样的细胞外基质，不仅为细胞黏附和组织提供适当的结构支架，而且还调节许多不同的细胞功能，以维持体内平衡[1]。细胞外基质包含生物活性序列，这些序列通常被在多种细胞类型上表达的特定细胞表面受体所识别，从而促进了广泛的细胞活性[2]。细胞外基质重塑可以暴露先前隐藏的生物活性序列，或降解完整的生物活性序列[3]。此外，消化后的可溶性细胞外基质片段通常以不同于不溶性支架的方式调节细胞行为。
考虑到细胞外基质在组织结构支持中的作用，在开发基于细胞外基质的组织工程支架方面已进行了大量研究[4-8]，在这些研究中，支架通常被用来促进细胞黏附和浸润，继而促进细胞分化为功能性的组织。但所有再生过程都有一个共同的步骤：炎症[4，9]，由于它是愈合过程的第一步，因此炎症反应会触发一系列连续的事件，从而导致组织体内稳态的恢复。但当这种炎症失调时会导致纤维化，从而导致组织功能丧失，并最终导致器官衰竭[10]。因此，再生策略必须考虑炎症的重要性，并最终针对炎症以改善最终的再生结果。
最初，对植入的炎症反应主要是先天性免疫细胞(包括嗜中性粒细胞和巨噬细胞)的激活，随后是树突状细胞的浸润，然后这些髓样效应子通过巨噬细胞和树突状细胞将抗原呈递给次级淋巴器官中的T和B细胞，从而桥接到适应性免疫系统，介导植入材料的长期免疫识别[4]。损伤和植入材料的初始炎症反应阶段以动态巨噬细胞反应为标志，巨噬细胞是极具可塑性的细胞，具有根据环境和生物活性信号分子改变其表型(极化)的能力。实际上，这些细胞可以从炎性(M1型)极化为抗炎(M2型)表型，M1型巨噬细胞在小鼠中以肿瘤坏死因子α或其他炎性细胞因子的分泌、诱导型一氧化氮合酶和CD86的表达为特征。紧随其后的是促进愈合阶段，其特征在于M2型巨噬细胞分泌白细胞介素10及精氨酸酶和CD206的表达[11-12]；转化生长因子β、血管内皮生长因子及其他细胞因子也可被分泌，巨噬细胞表型的几种亚型在伤口愈合过程已经被表征[13]。因此，组织工程学中的一种新兴策略是设计可以直接控制宿主免疫反应的材料[2]。已有研究证明，细胞外基质生物支架不仅会引起良好的宿主先天免疫应答，特别是巨噬细胞应答，而且这种应答是重建性细胞外基质介导组织重塑所必需的[14]，组织工程领域已经开始探索不同方法来改善受损组织中M2巨噬细胞的存在，但在软骨组织工程领域鲜有相关研究结果报道。解放军总医院骨科研究所开发的第4代软骨组织工程技术，基于同种异体脱细胞软骨基质(decellularized cartilage extracellular matrix，DCM)多孔支架，并成功应用于临床[15]。课题组基于软骨脱细胞技术成功制备猪来源 DCM，经过冻干交联制备出取向性多孔软骨组织工程支架，并进行了大量基础及临床前研究，证明了其作为软骨组织工程支架的良好应用前景[16-17]。实验制备了DCM并对其进行胃蛋白酶促溶解处理，经过组织学及定量表征，同时探究其胃蛋白酶消化前后对小鼠巨噬细胞系表型极化的调控作用，初步证明了DCM的免疫调节作用，为改进软骨组织工程材料提供了新的思路。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计体外观察实验。
1.2 时间及地点实验于2018年12月至2019年7月在解放军总医院骨科研究所完成。
1.3 材料新鲜猪关节软骨购买于北京屠宰场。
1.3.1 实验用主要细胞及试剂小鼠巨噬细胞系RAW264.7(ATCC TIB-71，上海奥陆生物)；甲苯胺蓝、蕃红O染色及天狼星红染色试剂(北京索莱宝科技有限公司)；糖胺多糖定量试剂盒(中国，杰美基因)；羟脯氨酸定量试剂盒(南京建成)；DMEM高糖细胞培养基(美国Corning公司)；脂多糖、猪来源胃蛋白酶、胎牛血清白蛋白BSA(美国Sigma公司)；胎牛血清(元亨金马生物科技有限公司)；小鼠干扰素γ、白细胞介素4(美国Peprotech公司)；小鼠CD86抗体、小鼠CD206抗体(美国Abcam公司)；DAPI试剂，荧光二抗(中杉金桥公司)；PE-CD86、APC-CD206流式抗体(美国 Biolegend公司)。
1.3.2 实验用主要仪器 CO2培养箱Hereus BB5060型(德国Hereus公司)；OlympusIX70型倒置显微镜、BH-2型Olympus生物显微镜、IX70型荧光显微镜(日本东京Olympus公司)；超净工作台月坛双人水平层流型(北京半导体元件一厂)；冷冻干燥机(北京博医康技术有限公司)；Beckman Allegra X-22R离心机；Celesta型流式细胞仪(美国BD公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 猪来源DCM及酶消化产物制备参考以往人来源DCM制备方法[18]，简而言之，新鲜猪关节软骨经物理粉碎、反复冻融及差速离心后获得纳米级DCM匀浆料。经冷冻干澡后称量得到质量分数。匀浆料经冻干可得到DCM冻干粉，按照实验需求称取所需质量的DCM冻干粉，按照冻干粉∶猪胃蛋白酶质量比为10∶1将其溶解在0.01 mol/L盐酸溶液中，并在室温下持续搅拌48 h，以1 mol/L NaOH溶液调整溶液pH值至7.0-7.3，得到10 g/L溶液，通过60Co辐照灭菌，即胃蛋白酶处理脱细胞软骨基质(pepsin treated decellularized cartilage extracellular matrix，PDCM)，放置4 ℃冰箱冷藏备用。
1.4.2 组织学染色将DCM及PDCM 以2.5 g/L的质量浓度涂布至洁净盖玻片，超净工作台内风干过夜，涂片通过DAPI染色，水性封固后荧光显微镜下观察；通过甲苯胺蓝、蕃红O及天狼星红染色后梯度脱水，封固后倒置显微镜下观察。
1.4.3 DCM冻干粉糖胺聚糖及胶原定量检测分别称取5 mg DCM冻干粉，按照糖胺多糖定量试剂盒及羟脯氨酸定量试剂盒检测说明进行定量检测。
1.4.4 PDCM对巨噬细胞表型极化调控的免疫荧光染色鉴定 RAW264.7细胞培养于含体积分数10%胎牛血清的高糖型DMEM完全培养基内，一两天传代。细胞70%-80%融合时0.25%胰酶消化计数，按1.5×105/孔接种至放置有盖玻片的6孔板内，细胞贴附3-5 h后更换为以下培养基分组培养：①对照组：巨噬细胞完全培养基诱导M0巨噬细胞；②M1型巨噬细胞阳性对照：含100 µg/L 脂多糖+20 µg/L 干扰素γ的完全培养基；③M2型巨噬细胞阳性对照：含20 µg/L 白细胞介素4的完全培养基；④PDCM组：含0.5 g/L PDCM的完全培养基；⑤胃蛋白酶组：含0.05 g/L胃蛋白酶的完全培养基。每孔添加溶液体积2 mL。37 ℃、体积分数5%CO2静置培养18 h后，PBS洗涤2遍，40 g/L多聚甲醛固定15 min。
免疫荧光染色：固定后的细胞爬片以含体积分数10%山羊血清的PBS孵育30 min，CD86及CD206(分别以1∶500溶于封闭液中)在湿盒中孵育细胞4 ℃过夜孵育。PBS洗涤细3次，每次5 min。加入荧光二抗(1∶100)于37 ℃避光孵育1 h。避光PBS洗涤3次，每次5 min。DAPI(1∶500)孵育细胞5 min，避光PBS洗涤3次，每次5 min，水性封固后荧光显微镜下观察。每张载玻片拍摄5个视野，用Image J软件进行图像定量。
1.4.5 DCM及PDCM涂片对巨噬细胞表型极化调控的流式细胞术鉴定将DCM匀浆料及PDCM溶液于超净工作台内，分别以 2.5 g/L的质量浓度加入6孔板内，每孔1 mL，风干过夜。
将RAW264.7巨噬细胞系以5×105/孔加入6孔板，分组如下：①对照组：巨噬细胞完全培养基诱导M0巨噬细胞；②M1型巨噬细胞阳性对照：含100 µg/L脂多糖+
20 µg/L干扰素γ的完全培养基；③M2型巨噬细胞阳性对照：含20 µg/L白细胞介素4的完全培养基；④DCM组：DCM浆料涂布6孔板；⑤PDCM组：PDCM溶液涂布6孔板；⑥胃蛋白酶组：含0.25 g/L胃蛋白酶的完全培养基。培养
24 h后收集细胞进行流式细胞检测：1%BSA洗涤细胞1次，每管加入1%BSA 100 μL，冰上孵育30 min，以预定的最佳浓度(APC-CD86: 2.5 mg/L，PE-CD206: 5 mg/L)添加荧光一抗，并在黑暗中在冰上孵育15-20 min，PBS洗涤3次，低温离心机600×g离心5 min，将细胞沉淀重悬于300-500 μL PBS内，进行流式细胞仪检测。
1.5 主要观察指标 DCM及PDCM干预后巨噬细胞分型特征性表面标记物CD86及CD206表达情况。

讨论

实验通过脱细胞技术在去除软骨内细胞成分的同时保留了软骨细胞外基质的天然成分，通过组织染色证实无细胞核残留，满足了脱细胞成功的基本条件[19]。定量分析结果表明，DCM中超过50%质量分数的成分为胶原，同时还保留了糖胺多糖。DAI等[20-21]的研究显示，生物来源的Ⅱ型胶原促进抗炎型巨噬细胞表达，并对骨关节炎具有潜在治疗作用。透明质酸是天然细胞外基质中最重要的糖胺聚糖之一，根据其分子质量被认为具有双重免疫调节作用。完整的高分子质量透明质酸具有显著的抗炎作用，可诱导巨噬细胞产生白细胞介素10，损伤的低分子质量透明质酸可促进炎性因子肿瘤坏死因子α的表达[22]。此次实验免疫荧光结果证明，DCM的胃蛋白酶降解产物可增加抗炎型巨噬细胞表面标志物CD206的表达，这与脱细胞小肠黏膜下层降解产物对巨噬细胞的作用结果相似[23]。巨噬细胞具有显著的可塑性，并通过在M1和M2功能表型改变来对环境信号作出反应[24]。M1巨噬细胞表达和/或分泌多种促炎标志物，包括CD86、肿瘤坏死因子α、白细胞介素1b、诱导型一氧化氮合酶和Toll样受体；而M2巨噬细胞则表达和/或分泌白细胞介素10、白细胞介素1RA、CD206和转化生长因子β等抗炎标志物[25]。巨噬细胞一直被认为是生物材料-组织交界的主要细胞，主要负责调节损伤部位的炎症反应和随后的组织再生，随着生物材料的降解，巨噬细胞表型及时转变为抗炎型M2巨噬细胞，发挥抗炎促再生过程[26-28]。为了模拟体内材料降解前后对巨噬细胞的作用，分别将DCM匀浆料及PDCM溶液涂布至6孔板内，通过流式细胞术鉴定接种24 h后巨噬细胞分型标志物的表达情况，结果显示DCM能够使巨噬细胞极化为M1型(CD86)和M2型(CD206)，但PDCM则只表现为促进M2型巨噬细胞极化，猜测这与涂布后孔板表面影响了巨噬细胞的黏附和形态变化[29]，以及胃蛋白酶使胶原肽键断裂暴露出隐藏结构域有关[28，30]。
最近，相比于不可降解高分子植入材料引起的慢性异物反应，越来越多的证据表明细胞外基质来源生物材料能够通过M2巨噬细胞极化来减轻炎症[31]。BROWN等[32]研究表明，商业化细胞外基质材料植入后第1周巨噬细胞的早期表型可以预测后续重构结果。此外，HULEIHEL等[33]对暴露于细胞外基质降解产物后的巨噬细胞表型进行了详尽分析，显示细胞外基质与炎性基因和蛋白质的下调始终相关。DZIKI等[34]对8种不同组织来源细胞外基质降解产物对巨噬细胞表型极化作用进行了对比研究，结果表明细胞外基质均能诱导巨噬细胞表型和功能的改变，但不尽相同。细胞外基质生物支架激活巨噬细胞的能力已得到充分确认，但是细胞外基质促进这种反应的确切机制只是部分阐明。不同组织来源的细胞外基质对巨噬细胞的调控作用存在差异，而由于软骨组织致密，国际上其脱细胞方法尚无统一标准，鲜有软骨细胞外基质对巨噬细胞表型极化调控作用的相关研究结果报道。此次实验基于中国人民解放军骨科研究所20余年对软骨脱细胞方法建立的基础得到DCM，并进行生物降解处理，对比了其对巨噬细胞表型极化的调控作用。实验中对巨噬细胞分型的特异性表面标志物进行了鉴定，今后对其分泌因子及基因表达差异、脱细胞软骨基质支架体内植入的免疫反应、细胞外基质介导的巨噬细胞表型改变机制将深入研究。
综上所述，实验成功对软骨组织进行脱细胞处理，首次证明了DCM及其生物降解产物具有促进M2型巨噬细胞极化的能力，相信经过合适的方式构建为组织工程软骨支架，这种本身具有免疫调节特性的组织工程材料将为软骨组织工程领域提供新的研究方向。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

脱细胞软骨基质对巨噬细胞极化的调控

Regulatory effect of decellularized cartilage matrix on macrophage polarization

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