软基底介导细胞骨架蛋白与力学特性的改变

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0882

摘要/Abstract

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文题释义：

细胞外基质：是一个复杂的细胞外环境，细胞通过与细胞外基质的相互作用进行物质能量的交换，当细胞与细胞外环境之间的物质交换代谢发生不平衡时，大量大分子物质就会在细胞外进行堆积，使得细胞外环境的力学特性发生改变。

肌球蛋白：是肌原纤维粗丝的组成单位，存在于横纹肌和平滑肌中，在肌肉运动中起重要作用，其分子形状如豆芽状，由2条重链和多条轻链构成。2条重链的大部分相互螺旋形地缠绕为杆状，构成豆芽状的杆；重链的剩余部分与轻链一起，构成豆芽的瓣。

背景：前期研究发现在不同硬度基底上生长的细胞，细胞调控受基底硬度的影响，但抑制肌球蛋白的活性会阻碍基底硬度对细胞的调控作用，然而关于基底硬度对于肌球蛋白的影响及在这个过程中对于肌球蛋白的量化描述较少。

目的：量化肌球蛋白Ⅱ分布及运动速率、肌动蛋白纤维分布与基底硬度的关系。

方法：采用聚丙烯酰胺凝胶制备硬度分别为1，10，150 kPa的基底，将稳定表达转染荧光肌球蛋白Ⅱ的宫颈癌Hela细胞分别接种于不同硬度的基底上12 h，检测不同硬度基底上生长的宫颈癌细胞荧光肌球蛋白Ⅱ沿细胞长轴的荧光分布，利用荧光漂白恢复技术测定荧光肌球蛋白Ⅱ的运动速率，荧光染色观察肌动蛋白纤维的分布，利用微管吸吮技术测定单个宫颈癌细胞在铺展状态下的细胞膜弹性模量。

结果与结论：①硬度为150 kPa基底上细胞的边缘荧光肌球蛋白Ⅱ强度显著高于其他部分；在1 kPa和10 kPa基底上生长的细胞，荧光肌球蛋白Ⅱ在边缘的分布呈现出一定回落现象；②硬度为150 kPa基底上细胞末端荧光肌球蛋白Ⅱ的恢复速率最大，显著快于1 kPa和10 kPa基底上细胞的恢复速率；③3种硬度基底上生长的细胞肌动蛋白纤维整体荧光强度近似；④硬度为150 kPa基底上Hela细胞细胞膜的弹性模量显著高于 1 kPa和10 kPa基底上的细胞；⑤结果表明，基底硬度会明显改变肌球蛋白、肌动蛋白等重要细胞骨架蛋白区域性作用的效果，影响癌细胞在不同微环境下的细胞状态。

ORCID: 0000-0001-9563-6463(侯添)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 细胞骨架, 肌球蛋白, 肌动蛋白纤维, 细胞外基质, 聚丙烯酰胺凝胶, 基底硬度, 弹性模量, 人宫颈癌细胞, 生物材料

Abstract:

BACKGROUND: Preliminary studies have shown that substrate hardness is directly involved in cell regulation, but this effect can be hindered via suppression of myosin expression. Therefore, the effect of substrate hardness on myosin expression needs to be further quantified.

OBJECTIVE: To quantify the effect of substrate hardness on the distribution and movement rate of myosin II as well as on the distribution of actin fibers.

METHODS: Polyacrylamide gels were used to prepare substrates with hardness of 1, 10, 150 kPa. Cervical cancer were Hela cells stably transfected with fluorescent myosin II, and these transfected cells were incubated onto the substrates of different hardness. The fluorescence distribution of fluorescent myosin II along the long axis of Hela cells on the substrates of different hardness was measured. The movement rate of fluorescent myosin II was determined by fluorescence photobleaching recovery technique. F-actin distribution was observed using fluorescent staining. The elastic modulus of single cervical cancer cells spreading on different substrates was determined using micropipette aspiration technique.

RESULTS AND CONCLUSION: For the cells growing on the 150 kPa substrate, the highest intensity of fluorescent myosin II was located on the cell edge. For the cells on the substrates of 1 and 10 kPa, there was a reduced distribution of fluorescent myosin II on the cell edge. For the cells on the 150 kPa substrate, the recovery rate of fluorescent myosin II was significantly faster than that on the substrates of 1 and 10 kPa. Actin fibers in the cells growing on the substrates of 1, 10 and 150 kPa shared similarity in the overall fluorescence intensity. The elastic modulus of Hela cells on the substrate of 150 kPa was significantly higher than that on 1 kPa and 10 kPa substrates. Experimental results show that substrate hardness can significantly alter the regional effects of cytoskeletal proteins such as myosin and actin, and affect the cell status of cancer cells in different microenvironments.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Myosins, Actins, Elastic Modulus, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

侯添，安美文，王立. 软基底介导细胞骨架蛋白与力学特性的改变[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0882.

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图/表（结果） 5

2.1 不同硬度基底上Hela细胞铺展状态下肌球蛋白Ⅱ与肌动蛋白纤维的分布特征

2.1.1 细胞转染GFP-Myosin ⅡB获得的细胞株见图1。

2.1.2 肌球蛋白Ⅱ沿细胞长轴的分布曲线肌球蛋白Ⅱ分散于胞浆内，采用共聚焦显微镜测量了Hela细胞核所处层面最低荧光强度的肌球蛋白Ⅱ沿铺展长轴的分布曲线，曲线的纵坐标由荧光强度实测值/荧光强度最小值获得(归一化处理)，横坐标轴长由长度/细胞总长(归一化处理)获得。所得曲线经平滑处理，其中按正弦分布的曲线调整了其取向，使得各曲线波峰与波谷的横坐标对应，得到的结果见图2。

从图2可得到，在实验所用3种硬度的弹性基底上，荧光肌球蛋白Ⅱ沿长轴的分布特征呈现出较大差异，所以在后续的实验中重点关注了细胞边缘荧光肌球蛋白Ⅱ的变化。在分布曲线中，在硬度为150 kPa 聚丙烯酰胺凝胶上生长的细胞，边缘荧光强度显著高于其他部分；在10 kPa与1 kPa基底上生长的细胞，基底硬度导致了荧光肌球蛋白Ⅱ在边缘的分布呈现出一定的回落现象。

实验结果表明，随着基底硬度的降低，细胞边缘的荧光肌球蛋白Ⅱ聚集量有下降趋势，这一现象说明荧光肌球蛋白Ⅱ可能与细胞的黏附程度有关。

2.1.3 不同硬度基底上细胞肌动蛋白的分布特征利用Phalloidin-Tetramethylrhodamine B Isothiocyanate对固定后的细胞肌动蛋白纤维进行荧光染色，见图3。

从这3种硬度凝胶上生长的细胞肌动蛋白纤维整体荧光强度上看来，3者荧光强度在整个细胞区域内的分布较为

近似，随基底硬度的增加，肌动蛋白纤维荧光强度在细胞边缘的聚集状态表现出趋势性变化：边缘的肌动蛋白丝荧光强度呈现出更加明显的聚集趋势特点。

2.2 肌球蛋白Ⅱ在细胞末端的运动速率利用荧光漂白恢复方法测得各组的荧光恢复曲线见图4，可看出，在 150 kPa基底上细胞末端的荧光肌球蛋白Ⅱ恢复速率最大，显著快于1 kPa和10 kPa这两组细胞的恢复速率。

2.3 细胞的弹性模量利用微管吸吮，结合半无限体模型，实验测定了3组基底上Hela细胞的弹性模量，如图5所示。从实验结果对比可看出在硬度为150 kPa基底上生长的Hela细胞，细胞膜弹性模量显著高于在1 kPa和10 kPa硬度基底上生长的Hela细胞弹性模量。

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引言

研究发现肿瘤发生局部侵袭时有3个重要的过程，包括瘤实质细胞黏着性的改变、瘤间质细胞外基质(extracellular matrixc，ECM)的重构与瘤细胞获得运动性^[1]。发生恶变组织的细胞比邻近正常细胞大约软70%。肿瘤细胞呈现普遍变软的状态^[2]，这一现象与其骨架结构和细胞功能活动的异常有着密切联系^[3]。癌细胞的失控生长和恶化转移成为癌症高致死率的主要原因^[4]，癌细胞的这种行为依赖于癌细胞和细胞外基质之间特殊的理化作用^[5]。对于细胞外基质，它是一个复杂的大分子网络，在这个复杂大分子网络中包括了各种蛋白质、糖蛋白、蛋白聚糖和多糖等成分^[6]。这些大分子让这个网络具有独特的物理特性、生物化学特性和生物力学特性。正是因素的存在，使得细胞外基质能够直接或间接地影响细胞生物学行为，成为正常组织发育必不可少的因素。

当细胞外基质的代谢发生异常时，如细胞外基质的异常沉积和组织刚度的增加^[7]，这些特性的改变常常会伴随着一些疾病的发生，例如组织纤维化、癌症和瘤细胞的增殖^[8]、迁移^[9]、上皮间质转换等^[10]。Paszek等^[11]研究发现，仅通过对细胞外基质硬度的调整就可诱导出乳腺上皮细胞恶性转化的特征。Wang等^[12]的实验发现，培养在软、硬不同基底上的细胞其形态特征和运动能力明显不同。这些实验证明细胞外基质硬度发生改变时对细胞生物及生物力学特性可造成影响。细胞外基质的力学特性中，特别是细胞外基质的硬度已成为影肿瘤细胞的一个重要调节因子^[13]。由此，研究基质力学对肿瘤发生发展的影响不仅可深化对肿瘤发展的认识，也可为研制新的肿瘤诊治方法提供理论基础。

细胞外基质硬度的改变会对细胞的细胞骨架生物力学特性造成影响^[14-15]。贴壁细胞依赖于它们所贴附的支持物表面生化成分和物理性质及结构来决定它们的物理特征和生理活动，而贴壁细胞的形状和弹性与细胞骨架网络的形态及纤维的交联方式密切相关，其中肌动蛋白纤维和肌球蛋白是调节细胞骨架网络张力的主要介质，细胞通过与其外部环境(细胞外基质的刚度)的机械传感(mechanosensing)来调节肌球蛋白Ⅱ的活动，从而实现对细胞骨架网络重组(remodeling)的控制^[16]。而这种细胞骨架网络上的张力反过来也决定了细胞的形状和弹性模量^[17-19]。细胞骨架蛋白在细胞增殖、迁移等过程扮演重要角色^[20]，直接决定了细胞力学特性的量级，以肌球蛋白(Myosin)和肌动蛋白纤维(F-actin)为代表的细胞骨架作用尤为重要^[21]。

根据以往的实验发现：①在不同硬度基质上生长的细胞，细胞调控会受到基质硬度的影响，抑制肌球蛋白的活性会阻碍基质硬度对细胞的调控作用^[22]；②关于基质硬度对于肌球蛋白的影响及在这个过程中对于肌球蛋白的量化描述较少。

实验设计从肌球蛋白Ⅱ与肌动蛋白纤维的分布特征、肌球蛋白Ⅱ的速率及相关的细胞力学特性方面去量化细胞骨架蛋白与基底硬度之间的关系，实验制备硬度为1， 10 kPa的基底，作为典型软组织的代表；硬度为150 kPa的基底，作为硬组织的代表，以这3种硬度的基底模拟3种不同硬度的细胞外基质环境进行实验，实验数据及结果为进一步研究软组织中细胞与基质的相互作用奠定基础。

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材料方法

1.1 设计分组对照观察实验。

1.2 时间及地点实验于2016年3至12月在太原理工大学完成。

1.3 材料 Hela细胞株(中科院细胞库，中国)；RMPI培养液(Hyclone，美国)；胎牛血清(Gibico，美国)；CMV-GFP- Myosin Ⅱ B质粒(Addgene，美国)；3-氨丙基三甲氧基硅烷、四甲基乙二胺（EDTA）、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、多聚赖氨酸、Phalloidin-Tetramethylrhodamine B isothiocyanate(Sigma，美国)；Sulfo-SANPAH(Pierce，美国)；Lipofectamine 2000 Transfection Reagent (Invitrogen)；细胞微管吸吮系统(自制，太原)；FV1000激光共聚焦显微镜(Olympus，日本)。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞株处理利用CMV-GFP-Myosin ⅡB按照Invitrogen公司产品说明书转染，经多次转染筛选后得到能稳定表达荧光肌球蛋白Ⅱ的Hela细胞株^[23]。将此Hela细胞株，经传代后，接种于3种硬度的弹性基底上，培养12 h后进行实验。每项实验进行10组。

1.4.2 聚丙烯酰胺凝胶软基质的配制聚丙烯酰胺凝胶软基质的配制参照文献[24-25]的配制方法并加以改进。简单步骤如下：①取200 μL 0.1 mol/L NaOH溶液于盖玻片上涂抹均匀，使NaoH溶液与盖玻片的作用时间为5 min； ②吸干NaOH溶液，用200 μL 3-氨丙基三甲氧基硅烷溶液涂抹于NaoH作用区域，3-氨丙基三甲氧基硅烷溶液作用时间为3 min。用无菌纯水冲洗3次，去除残留的3-氨丙基三甲氧基硅烷溶液；③将200 μL 0.5%戊二醛水溶液加到盖玻片上作用20 min，按表1的配方配制不同弹性模量的聚丙烯酰胺凝胶；④取120 μL聚丙烯酰胺溶液立即加到直径为 30 mm玻片的中央，再将直径为24 mm玻片小心地盖在聚丙烯酰胺溶液上。聚合10 min后，小心地去除上面的盖玻片；⑤在每块胶的表面上滴加约200 μL 1 g/L sulfo- SANPAH溶液；⑥将凝胶置于紫外灯下聚合10 min；⑦用pH 8.6 200 mmol/L HEPES冲洗3次，每次使用冲洗液量为3 mL；⑧吸净后在胶表面滴加200 μL多聚赖氨酸溶液， 4 ℃冰箱过夜；⑨取出胶板用HEPES洗3次，加无血清RMPI，放入细胞培养箱中过夜，待接种细胞使用。

1.4.3 肌球蛋白Ⅱ量化实验

肌球蛋白Ⅱ沿细胞长轴分布的测定：转染荧光肌球蛋白Ⅱ的Hela细胞，采用荧光共聚焦显微镜激发细胞使其呈现绿色荧光，并对这3种硬度基底上生长24 h的细胞进行单细胞拍照。每种基底上选取10个单细胞进行拍照。使用Imagine Pro对拍照所得细胞进行绘图，测量荧光肌球蛋白Ⅱ沿细胞长轴的分布。

荧光漂白恢复实验：利用3 mW紫外照射分别照射3种基底上生长24 h的Hela细胞长轴末端直径为1 μm的区域，照射时长持续200 ms，测量肌球蛋白Ⅱ荧光恢复曲线，计算恢复最大荧光强度一半所需的时间t_1/2。

1.4.4 贴壁细胞弹性模量测定用微管吸吮技术测量3种硬度凝胶上生长24 h的单个Hela细胞膜弹性模量^[26]。单个实验细胞的测量在4 min内完成，每一批实验细胞的测量总时间在1 h内。测量弹性模量实验中，先给单个稳定转染荧光肌球蛋白的细胞施加约0.01 kPa的负压，使细胞发生弹性响应产生微小位移达到细胞膜与管口密封后(此过程用时20 s)，以细胞此时的状态做为初始状态。随后，调节压力装置逐步施加幅值为0.02 kPa的阶跃负压，每次经20 s的时长用于细胞平衡达到稳态后，记录细胞被吸入长度和相应的负压。依细胞个体的差异调节施加负压范围，每次的调节必须使微管吸入细胞的深度小于微管内径，以保证细胞变形在弹性范围内。根据半无限体模型可推导出细胞弹性模量 ^[27]，其中?P是吸入负压，a是微管内径，L是吸入长度。各组细胞的弹性模量E经过Origin Pro 8.0统计，结果以x(_)±s表示。

1.5 主要观察指标不同硬度基底上生长的宫颈癌细胞荧光肌球蛋白Ⅱ沿细胞长轴的荧光分布及运动速率，肌动蛋白纤维的分布，以及细胞膜弹性模量。

1.6 统计学分析采用SPSS 16.0统计软件进行统计分析，Origin 8.0绘图。数据以x(_)±s表示，组间比较采用两因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

生物组织由细胞和细胞外基质构成，对于动物组织中的细胞，它不仅与相邻的细胞发生接触和作用，同时也与细胞外基质相接触和作用，由此细胞生长的力学环境对其生物学及生物力学行为的影响是不容忽视的^[28-29]。大量实验发现，细胞外基质的物理机械强度是调控细胞行为的重要因素^[30-32]。细胞外基质是一个复杂的细胞外环境，细胞通过与细胞外基质的相互作用进行物质能量的交换，当细胞与细胞细胞外环境之间的物质交换代谢发生不平衡时，大量大分子物质就会在细胞外进行堆积，使得细胞外环境的力学特性发生改变。细胞外环境力学特性的改变就会对细胞的力学造成影响。

细胞外环境的力学特性在调控细胞生理活动的过程中是一个复杂的过程，首先，细胞的形态和迁移运动过程在很大程度上受到基底力学特性的影响，例如有报道发现：与较软基底(0.8 kPa)相比，胶质瘤细胞在相对较硬 (119 kPa)基底上铺展的面积更大，并形成明显的应力纤维丝，迁移的速度更快。然而在比正常脑组织更软的基质上(0.08 kPa)生长时，胶质瘤细胞呈圆形，几乎不铺展，也不迁移^[33]。相比硬基质(>10 kPa)，软基质(0.15-0.3 kPa)上的乳腺肿瘤细胞展现较长的细胞周期，蛋白质合成下降，尤其是一些结构蛋白如微管蛋白、肌动蛋白等^[34]。其次，细胞外环境力学特性发生改变时会引起疾病^[35]。通过改变细胞外基质的刚度，可诱导乳腺上皮细胞向癌细胞转化^[36]。基底刚度的增加会促进细胞黏着，提高细胞内的生长因子信号之间的传导，增加肿瘤细胞的转化率和生长率^[37-38]，例如一些肺癌细胞系在较硬的基质上能更好地生长^[39]，微环境的刚度在癌症的发生和发展中起着关键作用^[40]。降低的骨架蛋白水平会阻碍细胞分裂^[41]。肿瘤细胞与正常细胞的细胞骨架有明显差异，异常的细胞骨架结构对肿瘤细胞浸润转移过程产生了影响^[42]。细胞骨架异常已成为反映肿瘤细胞恶性程度的生物学行为特征之一^[43-44]。

此次实验得出的结果可描述为以下：①在不同硬度基底上生长的Hela细胞弹性模量呈现出差异性，1，10， 150 kPa这3种基底上生长的Hela细胞弹性模量表现出两两互不相同的状态，1 kPa和10 kPa硬度的弹性基底上生长的Hela细胞弹性模量明显低于150 kPa硬度基底上生长的Hela细胞弹性模量；②肌球蛋白Ⅱ沿细胞长轴的分布无较大明显差异，但肌球蛋白Ⅱ在细胞边缘的分布却呈现出较明显的不同，在硬度为150 kPa聚丙烯酰胺凝胶基底上生长细胞，其肌球蛋白Ⅱ在细胞边缘的分布明显强于剩下两组硬度基底上生长的细胞；③在150 kPa基底上生长的Hela细胞肌球蛋白Ⅱ恢复时间明显短于1 kPa和10 kPa基底上生长的细胞，说明在150 kPa基底上生长的Hela细胞肌球蛋白Ⅱ的运动速率较剩余两种硬度上生长的Hela肌球蛋白Ⅱ运动速率慢；④在不同硬度基底上生长细胞的肌动蛋白纤维分布无较大差异性，但从细胞边缘肌动蛋白纤维的分布来看，在150 kPa的基底上生长的细胞呈现了较为明显的聚集。

综合实验现象可得出，较大硬度的基底环境会对细胞骨架力学特性造成影响，使细胞弹性模量和肌球蛋白Ⅱ运动速率明显增大，使肌球蛋白Ⅱ和激动蛋白纤维在细胞边缘出现了较为明显的聚集，在软基底上，这几类细胞边缘辅助细胞铺展、运动的肌球蛋白Ⅱ，无论是在数量上还是在运动速率方面都大于其处于较软基底环境中的细胞^[43-46]。所以，细胞外环境硬度的改变对细胞骨架力学特性和分布产生了影响。实验室给出的Hela细胞荧光肌球蛋白Ⅱ在1，10，150 kPa基底上的分布与速率特征，同时得到的细胞骨架相关的F-actin、细胞弹性模量等量化的数据，为认识软基底对细胞调控研究方向上提供了有力支持。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程