羧甲基壳聚糖稳定无定形磷酸钙的低温合成及稳定期

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0893

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文题释义：

稳定无定形磷酸钙：采用钙盐和磷酸盐在液体介质中双降解反应获得无定形磷酸钙沉淀，通过调整钙盐中添加的羧甲基壳聚糖与钙的配比，使羧甲基壳聚糖能够起到稳定无定形磷酸钙的作用，防止无定形磷酸钙发生相位转化，从无定形态变为晶体态。

羧甲基壳聚糖最低阈值：羧甲基壳聚糖作为一种钙螯合剂，加入无定形磷酸钙的反应液中可对无定形磷酸钙的相位转换双向调节，当其与钙离子比例较小时促进无定形磷酸钙结晶成核，当比例较高时可稳定无定形磷酸钙，因此通过调节合成反应液中羧甲基壳聚糖与钙的比例，可获得能稳定无定形磷酸钙的羧甲基壳聚糖最低阈值。

背景：无定形磷酸钙可作为生物矿化过程中纳米羟磷灰石的前导相及钙和磷酸盐的储备库，但其稳定性受合成环境影响，容易发生相变。

目的：采用钙螯合剂羧甲基壳聚糖(carboxymethyl chitosan，CMCS)稳定无定形磷酸钙，分析稳定无定形磷酸钙的羧甲基壳聚糖最低阈值及陈化时间对无定形磷酸钙稳定期的影响。

方法：4 ℃低温下，在含不同CMCS与Ca摩尔比比值(1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5)的溶液中制备CMCS-无定形磷酸钙沉淀，采用扫描电镜观察沉淀的微观结构，X射线衍射和红外光谱检测沉淀的化学成分，求得合成稳定CMCS-无定形磷酸钙的最低CMCS/Ca比值，并用热重量及差热分析得此比值下复合物中的无定形磷酸钙含量。再以此比值经不同陈化时间(10，30，60，90 min)获得CMCS-无定形磷酸钙复合物，将其溶于模拟体液中，采用X射线衍射和扫描电镜监测无定形磷酸钙的相变，探讨陈化时间对无定形磷酸钙稳定期的影响。

结果与结论：①X射线衍射与红外光谱图谱显示，当CMCS/Ca≥1∶3时，CMCS-无定形磷酸钙沉淀物为非晶体相；②扫描电镜显示，当CMCS/Ca≥1∶3时，沉淀物中可见大量分布均匀的无定形磷酸钙颗粒；③通过以上实验得出，低温条件下合成稳定CMCS-无定形磷酸钙复合物的CMCS/Ca最低比值为1∶3，在此比值下复合物中无定形磷酸钙的实际量为63.63%；④X射线衍射与扫描电镜显示，当陈化时间为10-60 min时，CMCS-无定形磷酸钙复合物的模拟体液浸泡产物为非晶体态，相位转化时间分别为2，6，8 h；当陈化时间为90 min时浸泡产物为晶体态；⑤结果表明，低温条件下合成稳定CMCS-无定形磷酸钙复合物的CMCS/Ca最低比值为1∶3，在该比值下复合物的稳定期随陈化时间延长而延长，在2-8 h范围内变化。

ORCID: 0000-0001-8866-3228(王娉婷)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 无定形磷酸钙, 羧甲基壳聚糖, 稳定性, 陈化时间, 相位转化, 混酸回流, 纯化, 杂质颗粒, 分散性, 生物相容性, 生物材料

Abstract:

BACKGROUND: Amorphous calcium phosphate can serve as a precursor phase of nano-hydroxyapatite and the storage source for calcium and phosphate. However, the stability of amorphous calcium phosphate is greatly influenced by synthetic environments, which is easy to trigger a phase transition.

OBJECTIVE: To stabilize amorphous calcium phosphate by carboxymethyl chitosan (CMCS) and to investigate the lowest threshold of CMCS with stabilizing capacity and the effects of aging time on stabilization period.

METHODS: CMCS-amorphous calcium phosphate precipitates in different CMCS/Ca molar ratios (1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5) were synthesized at 4 ℃. Their microstructures were observed by scanning electron microscopy (SEM) and chemical compositions were analyzed by powder X-ray diffraction (XRD) and Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR). The lowest threshold of CMCS/Ca with stabilizing capacity was thus acquired. The stable complexes at this lowest threshold were investigated by thermogravimetric analysis and differential scanning calorimetry to determine the content of amorphous calcium phosphate. CMCS-amorphous calcium phosphate complexes with the lowest threshold of CMCS/Ca were then synthesized under different aging times (10, 30, 60, 90 minutes) and dissolved in simulated body fluid. Effects of aging time on stabilization period were discussed following the investigation on the phase transition of amorphous calcium phosphate by SEM and XRD.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) According to the results from XRD and FTIR, CMCS-amorphous calcium phosphate precipitates were amorphous when CMCS/Ca ≥ 1:3. (2) According to the findings of SEM, plenty of evenly distributed amorphous calcium phosphate particles were found in the precipitates when CMCS/Ca ≥ 1:3. (3) The lowest threshold of CMCS/Ca used for synthesizing the stable CMCS-amorphous calcium phosphate complexes at 4 ℃ reached to 1:3, and the actual content of amorphous calcium phosphate was 63.63%. (4) According to the results from XRD and SEM, the CMCS-amorphous calcium phosphate complexes dissolved in the simulated body fluid were amorphous under 10, 30, 60 minutes of aging and the corresponding stabilization period was 2, 6, 8 hours, respectively, while the amorphous complexes became crystals under 90 minutes of aging. All these findings indicate that the lowest threshold of CMCS/Ca with the stable CMCS-amorphous calcium phosphate in a low temperature is 1:3. When synthesized with this lowest threshold of CMCS/Ca, the stabilization period of amorphous calcium phosphate is positively correlated with aging time and varies from 2 to 8 hours.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Nanotubes, Carbon, Excipients, Calcium Phosphates, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

王娉婷，祁星颖. 羧甲基壳聚糖稳定无定形磷酸钙的低温合成及稳定期[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0893.

Wang Ping-ting, Qi Xing-ying . Low-temperature synthesis and stabilization of carboxymethyl chitosan stabilized amorphous calcium phosphate[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0893.

图/表（结果） 6

2.1 CMCS-无定形磷酸钙的结构与成分分析 6组冻干沉淀物及CMCS对照的X射线衍射图如图1A所示。CMCS对照组(a)可见2θ在20°附近存在CMCS的典型衍射峰，而在冻干沉淀物组中，随着CMCS/Ca比值降低，由1∶1组至1∶5组CMCS典型衍射峰逐渐降低。同时，1∶1组(b)、1∶2组(c)、1∶3组(d)中在30°左右可见非晶体衍射峰，而当CMCS/Ca比值降至1∶4(e)和1∶5(f)时出现了与无CMCS的CaP组(g)相似的晶体衍射峰。

6组冻干沉淀物及CMCS对照的红外光谱图如图1B所示，CMCS的伸缩振动峰在1 400 cm^-1 和1 650 cm^-1处(a)，而在CMCS-CaP冻干沉淀物中这两个峰值均发生变化；在CMCS/Ca比值≥1∶3时，在550 cm^-1(ν4 PO₄^3-弯模)附近可见单一的光环峰(b-d)；而当CMCS/Ca比值<1∶3或无CMCS时，该单一峰分裂为530 cm^-1 和570 cm^-1附近的两个峰(e-g)。

图2显示了6组冻干沉淀物在扫描电镜下的显微结构，无CMCS辅助合成的CaP呈薄片状晶体结构，片状晶体间无泥雪样物质存在(图2F)；而CMCS-CaP冻干沉淀物各组均可见CaP以大量不规则形状的颗粒形式存在，颗粒间存在泥雪样物质(CMCS)；CaP颗粒尺寸不随CMCS/Ca比值改变而发生可见变化，但随着CMCS/Ca比值降低，颗粒间的泥雪样物质逐渐减少至消失(图2A-E)；当CMCS/Ca比值降低至1∶3时，CaP颗粒的轮廓变得模糊，同时可见少量晶体结构出现(图2C)；当CMCS/Ca比值降低至1∶4时这一趋势更为明显(图2D)；当CMCS/Ca比值进一步降低至1∶5时，可见大量晶体结构生成，不规则CaP颗粒及泥雪样物质显著减少(图2E)。

对于CMCS进行热重量及差热分析，在60 ℃附近观察到放热峰值，相应有19.17%的质量降低；加热到280 ℃时再次出现放热峰，同时重量也急剧减少(图3A)；当温度升至1 000 ℃时剩余量降至为7.04%。显示了CMCS/Ca比为1∶3的CMCS-无定形磷酸钙复合物的热重量分析及差热分析结果，放热初期即有16.22%的质量丢失，放热峰值也降低到260 ℃附近；当加热到1000 ℃时CMCS-无定形磷酸钙复合物剩余量为53.31%(图3B)。根据以上提及的数据计算可得CMCS-无定形磷酸钙复合物中无定形磷酸钙的实际量为63.63%。

2.2 CMCS-无定形磷酸钙复合物相位转化分析在CMCS/Ca比值为1∶3条件下，采用不同陈化时间制备的CMCS-CaP冻干沉淀物X射线衍射结果如图4所示，当陈化时间为10-60 min时产物为非晶体态，而当陈化期为90 min时复合物为晶体态。

陈化时间分别为10，30，60 min的3个实验组所得CMCS-无定形磷酸钙复合物的相位转化时间分别为2，6，8 h。各组复合物浸泡于模拟体液后测得的X射线衍射图谱见图5，陈化10 min组，复合物浸泡不超过2 h则能维持非晶体态；陈化30 min组，浸泡不超过6 h则能维持非晶体态；陈化60 min组，浸泡超过8 h后可检测到晶体峰。

图6显示了陈化30 min组CMCS-无定形磷酸钙复合物随浸泡时间延长而发生的显微结构变化：6 h后仍可见清晰的不规则颗粒形态；8 h后不规则颗粒消失，代之以颗粒融合形成的指状结构；12 h后指状结构进一步融合，转变为片状晶体形态；24 h后片状晶体进一步融合。另外两陈化时间组的CMCS-无定形磷酸钙复合物显微结构与陈化 30 min组类似。

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引言

无定形磷酸钙自问世以来由于其独特性质而日益受到生物材料界关注^[1-2]。无定形磷酸钙可作为人体内骨和牙齿矿化过程中纳米羟磷灰石的前导相^[3]，也可作为合成磷酸钙晶体材料过程中钙及磷酸盐的储备库^[4-6]，同时因其各向同性特质可用于提高材料的机械性能^[7]。此外，无定形磷酸钙生物可降解性优于磷酸三钙^[8]，骨引导作用优于羟磷灰石^[9]，因而作为生物功能性材料在医用涂层、医用水门汀、陶瓷材料、医用复合材料等领域具有良好的应用前景^[10-15]。无定形磷酸钙主要通过在液体介质中进行钙盐和磷酸盐的双降解反应获得^[10]，其核心问题是在合成环境中如何使反应生成的无定形磷酸钙沉淀物具有稳定性，避免其在短时间内发生相位转化。具有稳定新生无定形磷酸钙功能的添加剂可分为有机和无机两大类，其中无机稳定剂会改变无定形磷酸钙的化学成分，还可能降低其生物安全性^[16]，因此无定形磷酸钙稳定剂的研究重点集中于有机物范围，主要包括酪蛋白磷酸肽、核苷、多聚氨基酸、聚乙二醇、磷酸化壳聚糖等^[10^，^16-18]。这些有机稳定剂可赋予无定形磷酸钙多重生物活性，修饰无定形磷酸钙颗粒和基质的交界面，具有较为可靠的稳定作用^[19-20]。

羧甲基壳聚糖(carboxymethyl chitosan，CMCS)作为一种壳聚糖衍生物^[21-23]，是水溶性多聚电解质^[24-25]，其多肽链上有大量的羧基^[26-27]，具有强大的钙螯合功能^[28]。鉴于L-聚谷氨酸等钙螯合剂可通过形成钙的二羧基复合物稳定无定形磷酸钙^[29-30]，因此推测CMCS也可通过类似机制实现无定形磷酸钙稳定剂作用。然而，此类钙螯合剂对无定形磷酸钙的相位转化具有双相影响：当其与水溶液中的钙离子比值较高时，其存在有利于无定形磷酸钙的稳定；而当其与钙离子比例较低时，转而促进钙磷晶体成核过程，即加速无定形磷酸钙发生相位转化^[31]。因此欲以CMCS稳定无定形磷酸钙、获得无定形磷酸钙含量较高的CMCS-无定形磷酸钙复合物，则应深入探讨其合成过程中CMCS的用量，力求以最小CMCS添加量获得稳定的CMCS-无定形磷酸钙复合物。此外，反应时的环境温度也对CMCS稳定无定形磷酸钙的能力存在影响。此次实验旨在研究低温条件下不同CMCS添加量稳定无定形磷酸钙的能力，确定低温合成时CMCS的用量阈值，并检测在此阈值下合成CMCS-无定形磷酸钙复合物的微观结构及无定形磷酸钙含量，进而探讨陈化时间对复合物中无定形磷酸钙稳定期的影响，以期为材料应用中根据需要合理选择陈化时间提供理论依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计观察实验。

1.2 时间及地点实验于2016年3至10月在天津医科大学口腔医院中心实验室完成。

1.3 材料

实验用主要试剂和材料：CMCS(成都西亚试剂有限公司，中国)，黏均分子质量，50 000-100 000；0.1 μm孔径的聚四氟乙烯膜(Milipore，Bedford，美国)。

实验用主要仪器：冷冻干燥机(LGJ-0D，北京四环科学仪器厂，中国)；X射线粉末衍射仪(D8 Advance, Bruker，德国)；傅里叶变换红外光谱扫描仪(Nicolet 6700，Thermo Nicolet，美国)；扫描电镜(Inspect F50，FEI，美国)；热重量分析仪及差热分析仪(STA 449/C Jupiter，Netzsch，德国)。

1.4 实验方法

1.4.1 CMCS-无定形磷酸钙复合物的低温制备将一定量黏均分子质量为50 000-100 000的CMCS溶解在含 100 mg CaCl₂的Tris-HCl缓冲液中，制备CMCS与Ca摩尔比分别为1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5的一系列CMCS-Ca溶液。4 ℃低温搅拌过夜并使其pH值保持在8.0。后将137.1 mg的K₂HPO₄完全溶解在Tris-HCl缓冲液中，再将K₂HPO₄溶液逐滴加入CMCS-Ca溶液中使Ca/P比例为1.5。4 ℃下搅拌反应液使之陈化30 min并保持pH在8.0。以孔径为0.1 μm的聚四氟乙烯膜过滤反应液，弃去上清，收集CMCS-CaP沉淀物(包含CMCS-无定形磷酸钙复合物)，依次使用大量的超纯水及乙醇冲洗以除去多余离子，其后置于冷冻干燥机中冻干备用。无CMCS的CaP沉淀物也用相似方法在低温条件下制取，不同之处仅在于CaCl₂的Tris-HCl缓冲液中不加入CMCS，后续合成过程与前述步骤完全相同，所得CaP沉淀物同样冻干备用。

1.4.2 CMCS-无定形磷酸钙复合物化学成分及微观结构检测采用X射线粉末衍射及红外光谱分别检测实验制备的6组冻干沉淀物，并以纯CMCS为对照，分析各组冻干沉淀物各自的化学成分。采用扫描电镜观察6组冻干沉淀物的微观结构。

1.4.3 无定形磷酸钙含量测定通过上述实验分析确定能够获得稳定CMCS-无定形磷酸钙复合物的最低CMCS/Ca比值(1∶3)。采用热重量分析及差热分析检测在此阈值下CMCS-CaP沉淀物(即CMCS-无定形磷酸钙复合物)中无定形磷酸钙的含量。

1.4.4 CMCS-无定形磷酸钙复合物陈化时间及相变测定以上述实验获得的最低CMCS/Ca阈值再次制备4组CMCS-CaP沉淀物，制备过程中控制各组陈化时间分别为10，30，60，90 min。采用X射线衍射检测所得沉淀物结晶状态，弃去沉淀物中出现晶体态的陈化时间实验组，对其余实验组的CMCS-CaP沉淀物(即CMCS-无定形磷酸钙复合物)进行相位转化时间测量：从每个实验组的CMCS-无定形磷酸钙复合物中取8个平行试样，分别浸入37 ℃的50 mL模拟体液中(含Na⁺142.0 mmol/L、K⁺5.0 mmol/L、Mg²⁺1.5 mmol/L、Ca²⁺2.5 mmol/L、Cl^-147.8 mmol/L、HCO^3-4.2 mmol/L、HPO₄^2-1.0 mmol/L、SO₄^2-0.5 mmol/L，pH值均保持在7.4)；在不同时间间隔内，取每种陈化时间组中的一个平行试样，进行过滤、冲洗、冻干，采用X射线衍射再次检测其结晶状态，同时采用扫描电镜观察典型实验组随浸泡时间延长而发生的显微结构变化，以验证X射线衍射检测结果。

1.5 主要观察指标 ①CMCS-无定形磷酸钙复合物的显微结构；②CMCS-无定形磷酸钙复合物的化学成分、晶相结构；③CMCS-无定形磷酸钙复合物中无定形磷酸钙的含量；④不同陈化时间下各组CMCS-无定形磷酸钙复合物的相位转化时间(无定形磷酸钙稳定期)。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

无定形磷酸钙作为体内矿化过程中纳米羟磷灰石的前导相及钙和磷酸盐的储备库，在牙体硬组织矿化、植入物表面涂层、拔牙位点保存等领域均有良好的应用前景^[21^，^32-34]。而采用CMCS稳定无定形磷酸钙相比以往方法具有多方面优势^[10]，如可以避免酪蛋白磷酸肽等稳定剂造成的乳糖不耐受问题^[35-36]、CMCS成品可直接购买，因而使CMCS-无定形磷酸钙复合物量产成为可能等，此外CMCS还具有抗菌性能^[37-39]，有助于抑制接触组织表面的病原菌生长^[40]；故CMCS-无定形磷酸钙复合物的合成及其稳定期研究具有较显著的理论及临床意义^[41]。

CMCS稳定无定形磷酸钙的作用机制在于：其通过钙螯合对无定形磷酸钙颗粒基本结构Posner's团簇Ca₉(PO₄)₆形成包裹。未添加稳定剂时，无定形磷酸钙颗粒是由其基本结构Posner's团簇及团簇间的结合水构成^[42]；由于水分子的结合力极为有限^[4]，故无定形磷酸钙颗粒易通过溶解-再沉积过程或重组过程转化为磷灰石晶体^[42-44]。当CMCS存在时，CMCS分子链可通过钙离子的螯合作用与Posner's团簇发生结合，代替水分子将Posner's团簇结合在一起，如果CMCS/Ca比值较高，CMCS较长的分子链可缠绕包裹无定形磷酸钙颗粒中的所有Posner's团簇，使Posner's团簇溶解延迟、重组受限，抑制了无定形磷酸钙向晶体相转化，稳定了无定形磷酸钙的无定形状态。相反如果CMCS/Ca比值较低，CMCS分子链不足以缠绕包裹所有Posner's团簇，则其对无定形磷酸钙向结晶相转化的抑制效应就会降低；当CMCS/Ca比值过低时，体系中仅有一小部分的Posner's团簇会被CMCS分子包裹，而其表面附着的CMCS分子可继续吸附溶液中的钙离子，并作为成核模板^[31]，此时不但不能抑制转化，反而会对无定形磷酸钙晶相转化起到诱导作用。

实验通过对CMCS-CaP冻干沉淀物进行X射线衍射和红外光谱分析，确定了CMCS能够稳定无定形磷酸钙的最小添加量。在X射线衍射图谱中，当CMCS/Ca≥1∶3时，谱线中存在无定形磷酸钙非晶体衍射峰，小于此比值则非晶体衍射峰消失，与对照组CaP晶体位置相同的的晶体衍射峰出现。此外，谱线中CMCS的典型衍射峰随着CMCS/Ca比值减小而逐渐降低，间接提示了CMCS分子包裹了合成的无定形磷酸钙颗粒。在红外光谱中，CMCS谱线在1 400 cm^-1和1 630 cm^-1附近的峰值分别代表-COO基团的对称及非对称伸缩振动(与羟基和氨基介导的羧甲基化相关)^[45-46]，CMCS-CaP冻干沉淀物中这两个峰值的变化表明CMCS与Ca发生了螯合。当CMCS/Ca≥1∶3时，在550 cm^-1附近的单一的光环峰的出现提示沉淀物中无定形磷酸钙的存在；而当CMCS/Ca继续降低，超出CMCS稳定能力时，该单一峰发生分裂，表现类似结晶相CaP谱线的形貌。

扫描电镜显微结构观察结果验证了可稳定无定形磷酸钙的最小为CMCS/Ca比值为1∶3，当CMCS/Ca≥1∶3时，沉淀物中可见大量分布均匀的无定形磷酸钙颗粒，其形貌与无CMCS合成的薄片状晶体CaP截然不同。无定形磷酸钙颗粒之间的泥雪样物质即为缠绕包裹Posner's团簇的CMCS分子，随着CMCS/Ca比值降低，泥雪样CMCS也逐渐减少消失，颗粒轮廓变得模糊，晶体结构也相继出现，这与X射线衍射显示的变化趋势一致。显微结构观察同时发现单个CaP颗粒的平均尺寸几乎不受CMCS/Ca比值变化的影响，这与Pazit Bar-Yosef Ofir及其同事提出的结果相似^[31]。实验中无定形磷酸钙颗粒外形呈不规则形状而非之前研究报道的球形^[47]，这可能是由于此次实验中观察到的无定形磷酸钙颗粒并非水结合条件下的最初形态，CMCS分子链包裹大量Posner's团簇从而形成镜下所见颗粒，因而其外形呈不规则形态。

如前所述，探讨无定形磷酸钙合成过程中CMCS的用量旨在以最小CMCS添加量获得稳定的CMCS-无定形磷酸钙复合物，此时复合物中无定形磷酸钙含量较高，更有利于其生物学效应的发挥。实验中通过对CMCS及CMCS/Ca为1∶3的CMCS-无定形磷酸钙复合物进行热重量和差热分析，可计算复合物中无定形磷酸钙的含量。在CMCS检测结果中，60 ℃附近的放热峰对应的是体系中的水，其质量约占19.17%；280 ℃附近的放热峰对应的是CMCS开始高温分解；加热到1 000 ℃时仅剩余7.04%，表明CMCS分解基本完全，仅有少量物质残余。在CMCS-无定形磷酸钙复合物检测结果中，加热之初损失的15.83%质量是体系中的水分；CMCS分解的初始温度降低到 260 ℃，提示钙与CMCS的螯合作用造成CMCS的结晶程度降低；当加热到1 000 ℃时，CMCS-无定形磷酸钙复合物剩余53.31%，即为以CaP为主的残余。根据以上提及的数据计算可得CMCS-无定形磷酸钙复合物中无定形磷酸钙的实际量为63.63%，这与65.06%的理论值较为接近。

在无定形磷酸钙的合成过程中，除稳定剂的添加量外，反应处理的陈化时间也是影响合成效果的重要因素。因此，研究中在确定了CMCS最小添加量后，检测了该比例下通过不同陈化时间制备的冻干沉淀物中无定形磷酸钙的生成情况。结果显示，当陈化时间不超过60 min时，沉淀物中CaP以无定形磷酸钙形式存在。进一步探讨不同陈化时间对无定形磷酸钙稳定期的影响，发现低温条件下，经10，30，60 min陈化期合成的CMCS-无定形磷酸钙复合物，其稳定期依次不低于2，6，8 h。在稳定期内，CMCS-无定形磷酸钙复合物的微结构在呈不规则颗粒形态，超出稳定期则不规则颗粒消失，指状形态出现，随着时间延长，指状结构继续生长并逐渐融合转化为片状晶体形态，相位转化完成。该过程与Posner's团簇溶解-再沉积或重组过程的理论描述相一致。此次实验对相位转化(稳定期)的研究与以往实验不同，以往实验中相位转化都是在母液(合成反应液)中进行的^[7]，而母液的pH值及温度与体内生理状态相差较大，因此其研究结果仅对无定形磷酸钙材料的贮存有指导作用，而不能对无定形磷酸钙材料体内行为规律提供准确线索。实验中无定形磷酸钙相位转化均在pH=7.4的模拟体液中进行，并控温在37 ℃，完全模拟体内生理环境，因此对其临床应用更具有指导意义。

实验确定了CMCS-无定形磷酸钙复合物的低温合成条件，同时通过控制陈化时间获得了具有适宜稳定期的无定形磷酸钙材料，后续研究将着重探讨该材料在促进牙体组织矿化和骨组织愈合及再生中的作用和在体应用效果。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程