用于慢性伤口羧甲基壳聚糖/氧化葡甘聚糖/三七总皂苷复合海绵的制备及性能评价

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.3147

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (16): 2528-2534.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.3147

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用于慢性伤口羧甲基壳聚糖/氧化葡甘聚糖/三七总皂苷复合海绵的制备及性能评价

李洁1，许楗桢1，胡萍1，雷琪琪1，张文柠1，敖宁建1 ，2

1暨南大学生命科学技术学院，广东省广州市 510632；2广东省教育厅生物材料重点实验室，广东省广州市 510632

收稿日期:2020-04-25 修回日期:2020-04-27 接受日期:2020-05-22 出版日期:2021-06-08 发布日期:2021-01-07
通讯作者: 敖宁建，研究员，博(硕)士生导师，暨南大学生命科学技术学院，广东省广州市 510632；广东省教育厅生物材料重点实验室，广东省广州市 510632
作者简介:Li Jie, Master candidate, College of Life Science and Technology, Jinan University, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China Xu Jianzhen, Master, Engineer, College of Life Science and Technology, Jinan University, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China Li Jie and Xu Jianzhen contributed equally to this article.
基金资助:
广东省科技厅科技计划资助项目(2017A020211006)，项目负责人：敖宁建；国家自然科学基金(20976068)，项目负责人：敖宁建

Preparation and performance evaluation of carboxymethyl chitosan/oxidized glucomannan/Panax notoginseng compound sponge dressing for chronic wound

Li Jie1, Xu Jianzhen1, Hu Ping1, Lei Qiqi1, Zhang Wenning1, Ao Ningjian1, 2

1College of Life Science and Technology, Jinan University, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China; 2Key Laboratory of Biomaterials of Guangdong Education Department, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China

Received:2020-04-25 Revised:2020-04-27 Accepted:2020-05-22 Online:2021-06-08 Published:2021-01-07
Contact: Ao Ningjian, Researcher, Master’s and doctoral supervisor, College of Life Science and Technology, Jinan University, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China; Key Laboratory of Biomaterials of Guangdong Education Department, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China
About author:李洁，女，1997年生，云南省西双版纳傣族自治州勐海县人，暨南大学在读硕士，主要从事生物医用材料研发与创伤修复研究。许楗桢，男，1993年生，广西壮族自治区南宁市人，汉族，暨南大学毕业，硕士，工程师，主要从事新型医用高分子材料与医疗器械产品研发工作。
Supported by:
a grant from Science and Technology Plan of Guangdong Provincial Department of Science and Technology, No. 2017A020211006 (to ANJ); the National Natural Science Foundation of China, No. 20976068 (to ANJ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
慢性伤口：是指皮肤经创伤后无法及时地自我修复达到正常解剖和功能上的完整状态的伤口，在医学临床上多指各种原因造成的创面在经过6周标准医疗治疗后未能愈合或无愈合倾向。创伤修复时间与伤口大小、病因、个体一般健康状况等多种因素有关。慢性伤口主要划分为静脉性溃疡、动脉性溃疡、糖尿病性溃疡、创伤性溃疡、压力性溃疡5类常见类型。
指纹图谱：是指利用分析科学、中药学、分离科学、化学和生物信息学等多学科交叉的综合技术手段，对复杂物质组成体系的化学信息进行整体表征和评价的方法，是建立中药质量标准体系中的中药环节。使用此方法可以全面地反映出提取物中的化学成分及含量。

背景：前期研究显示，羧甲基壳聚糖/氧化葡甘聚糖复合海绵可作为载药性慢性伤口敷料的优良基材。
目的：制备羧甲基壳聚糖/氧化葡甘聚糖/三七总皂苷复合海绵，评估其理化性能与生物相容性。
方法：采用高碘酸钠氧化制备氧化葡甘聚糖；从三七超细粉中提取出三七总皂苷。先加入羧甲基壳聚糖与氧化葡甘聚糖作为混合原料，再分别加入占混合体系体积2%，6%，10%的三七总皂苷，采用冷冻干燥的方法制备羧甲基壳聚糖/氧化葡甘聚糖/三七总皂苷复合海绵，采用扫描电镜观察复合海绵的微观结构，检测复合海绵的孔隙率、蒸气透过率、三七总皂苷释放度、细胞相容性、抗菌性能与急性全身毒性反应。
结果与结论：①扫描电镜显示，复合海绵内部有许多孔洞饱满、分布均匀的孔隙，三七总皂苷稳定均匀地附着在海绵的孔洞的内壁及连接处；②随着三七总皂苷比例的增加，复合海绵的吸水率、孔隙率与蒸气透过率逐渐增加；③3种复合海绵中的绝大部分三七总皂苷体外在13 h内可高效地释放出来；④体外培养3 d内，3种复合海绵上培养的成纤维细胞增殖率均在95%以上；⑤3种复合海绵对大肠杆菌与金黄色葡萄球菌均有抑制作用；3种复合海绵无急性全身毒性反应；⑥结果表明，羧甲基壳聚糖/氧化葡甘聚糖/三七总皂苷复合海绵有望成为优良的医用慢性伤口敷料。

https://orcid.org/0000-0002-3640-5451 (李洁)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 材料, 三七总皂苷, 羧甲基壳聚糖, 氧化葡甘聚糖, 复合海绵, 慢性伤口, 生物安全性

Abstract: BACKGROUND: Previous studies have shown that carboxymethyl chitosan/oxidized glucomannan composite sponge can be used as an excellent substrate for drug-loaded chronic wound dressings.
OBJECTIVE: To prepare carboxymethyl chitosan/oxidized glucomannan/Panax notoginseng composite sponge and evaluate its physical and chemical properties and biocompatibility.
METHODS: Oxidized glucomannan was prepared by sodium periodate oxidation. Panax notoginseng saponins were extracted from Panax notoginseng powder. Carboxymethyl chitosan and oxidized glucomannan were first added as mixed raw materials, and then added separately to account for mixing system 2%, 6%, 10% of Panax notoginseng saponins. Freeze-drying method was used to prepare carboxymethyl chitosan/oxidized glucomannan/Panax notoginseng composite sponge. Scanning electron microscope was utilized to observe the microstructure of the composite sponge. Porosity, steam permeability, total saponin release rate of Panax notoginseng, cell compatibility, antibacterial properties and acute systemic toxicity were detected.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Scanning electron microscope showed that there were many pores in the composite sponge that were full and evenly distributed. The total saponins of Panax notoginseng were stably and evenly attached to the inner walls and joints of the pores of the sponge. (2) As the proportion of total saponins of Panax notoginseng increased, the water absorption rate, porosity, and steam permeability gradually increased. (3) The vast majority of the total saponins of Panax notoginseng in the three kinds of composite sponges could be efficiently released in 13 hours in vitro. (4) Within 3 days after in vitro culture, the proliferation rate of fibroblasts was more than 95%. (5) Three kinds of compound sponges have an inhibitory effect on E. coli and Staphylococcus aureus, but do not have acute systemic toxicity. (6) The results show that carboxymethyl chitosan/oxidized glucomannan/Panax notoginseng composite sponge is expected to be an excellent medical chronic wound dressing.

Key words: material, Panax notoginseng, carboxymethyl chitosan, oxidized glucomannan, composite sponge, chronic wound, biosafety

中图分类号:

李洁, 许楗桢, 胡萍, 雷琪琪, 张文柠, 敖宁建. 用于慢性伤口羧甲基壳聚糖/氧化葡甘聚糖/三七总皂苷复合海绵的制备及性能评价[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(16): 2528-2534.

Li Jie, Xu Jianzhen, Hu Ping, Lei Qiqi, Zhang Wenning, Ao Ningjian . Preparation and performance evaluation of carboxymethyl chitosan/oxidized glucomannan/Panax notoginseng compound sponge dressing for chronic wound[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(16): 2528-2534.

图/表（结果） 10

2.1 复合海绵微观结构分析
2.1.1 复合海绵中三七总皂苷颗粒分析图1为复合海绵中的PNS颗粒形貌观察图，其中A为CMCS/OKGM/PNS-10海绵中负载的PNS颗粒，B为微观PNS颗粒，C为PNS粒径分布，可以看到复合海绵表面上均匀分布的PNS颗粒圆润如珠，且大小不一，用image J软件获取PNS的粒径大小数据并导入Origin13.0软件中得到PNS粒径分布，统计分析算出PNS颗粒的平均粒径为(194±157) μm，由于PNS的提取经过萃取处理并无滤膜处理，且从图C中可以看到PNS粒径无正态分布现象，故PNS粒径大小不一。

2.1.2 复合海绵微观结构分析图2为各组复合海绵微观结构图，CMCS/OKGM海绵内部的OKGM与CMCS产生化学交联，使得CMCS/OKGM海绵内部生成了许多孔洞饱满、分布均匀的孔隙，形成了有利于成纤维细胞生长的友好结构。从含PNS复合海绵的微观结构图中可以看出，PNS能稳定均匀地附着在海绵的孔洞内壁及连接处，并且随着PNS含量的增大不会有团聚现象产生，说明CMCS/OKGM海绵负载PNS的能力较好。此外，PNS的加入并不影响海绵的微观结构，初步判断CMCS/OKGM/PNS复合海绵可能与CMCS/OKGM复合海绵有类似的孔隙率、吸水性等。

2.2 复合海绵吸水率分析糖尿病足伤口溃疡往往因为组织水肿、炎症、伤口面积较大等原因会伴随着有较多的渗出液流出，在复杂的细菌干扰环境下渗液较多会阻碍糖尿病足溃疡伤口的愈合，干扰生长因子，加重炎症反应并且阻碍药物的吸收。所以，对于糖尿病足患者来说，一个好的敷料往往应具有良好的吸液性，从而能保持对创面友好的湿润环境下吸收过多的伤口渗出液。
图3是各组复合海绵在3 min内的吸水率情况图，可以看出CMCS/OKGM复合海绵具有良好的吸水性，当开始加入PNS时复合海绵吸水率略有所上升，但是基本保持在300%附近，故PNS的加入并没有过多影响复合海绵的吸水率，符合复合海绵微观结构的分析结果。

2.3 复合海绵孔隙率分析图4为各组复合海绵孔隙率变化曲线图，各复合海绵均表现出超过94%的孔隙率，其中CMCS/OKGM海绵的孔隙率为95.45%。因为OKGM作为交联剂加入到CMCS体系中形成了孔洞结构，使得复合海绵获得良好的孔隙率。但随着PNS的加入孔隙率表现出趋势略上升，但均保持在97%附近，故PNS的加入对OKGM的交联作用影响不大。并且由于PNS的加入不会对复合海绵微观结构有影响，故PNS的加入不会对复合海绵的孔隙率有较大影响。

2.4 复合海绵水蒸气透过率分析图5为各组复合海绵水蒸气透过率变化的曲线，从图中明显看出各组透气率良好,随着PNS加入后透气率呈现上升趋势。

2.5 复合海绵中PNS释放度分析图6为各复合海绵的PNS释放曲线，从图中看到各复合海绵12 h之内PNS的释放度达到90%，曲线分2个阶段：在0-6 h时段为急释阶段，几乎接近线性释放程度，这是因为PNS是水溶性成分，在复合海绵首次与缓冲溶液接触时PNS就会立马从海绵上脱落而释放出来；另一个阶段是在6 h之后的缓释阶段，在13 h以后PNS的释放度基本平稳，含PNS 2%，6%，10%的复合海绵释放度分别达到96.82%，95.97%，94.11%，表明绝大部分PNS在13 h内能高效地从海绵中缓慢释放并作用于伤口，进而促进伤口愈合，有效降低了慢性伤口患者的病痛。

2.6 复合海绵对3T3细胞增殖影响分析作为慢性伤口敷料必须具备的功能就是可以促进表皮成纤维细胞的生长，以此加速创面的愈合速度，因此通常采用成纤维细胞的增殖情况作为判断伤口敷料有效性依据。图7为各组复合海绵对3T3细胞增殖的影响对比图，可以看到各组复合海绵1，2，3 d的3T3细胞增殖率均超过90%，相比于CMCS海绵，CMCS/OKGM复合海绵可明显促进3T3细胞的增殖；在CMCS/OKGM复合海绵的基础上分别加入2%，6%，10%的PNS，3T3细胞增殖率有显著提升，几乎呈梯度式增长且增殖率均大于95%，说明在CMCS/OKGM复合海绵的基础上加入10%的PNS，能显著提高复合海绵促进3T3细胞增殖的能力，从而对伤口的愈合起到促进作用。

2.7 复合海绵的抑菌效果分析图8为各组复合海绵抗菌能力测试结果，图中看到所制材料对2种代表性菌种的抑菌圈直径均大于7 mm，表现出明显的抑菌作用，其中CMCS/OKGM是CMCS在体系中所占比例最高的材料，由于CMCS的优良抑菌作用，其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均产生超过9 mm的抑菌圈；随着PNS的加入，可以观察到CMCS/OKGM/PNS-2复合海绵对2种代表性菌种的抑菌圈均在8 mm左右，略弱于CMCS/OKGM复合海绵的抑菌效果，该两种复合海绵对大肠杆菌的抑菌性均略强于对金黄色葡萄球菌的抑菌性；CMCS/OKGM/PNS-6复合海绵对2种代表性菌种的抑菌效果弱于CMCS/OKGM、CMCS/OKGM/PNS-2复合海绵，抑菌圈均略小于8 mm； CMCS/OKGM/PNS-10复合海绵对2种代表性菌种所产生的抑菌圈在7.0-8.0 mm间，并且很清晰，说明其与CMCS/OKGM/PNS-2、CMCS/OKGM/PNS-6复合海绵相比有极佳的抑菌效果，符合医用敷料的抗菌需求。各组复合海绵的抑菌圈直径见表1。

2.8 复合海绵急性全身毒性实验结果 KM小鼠在注射不同材料浸提液1周内生理活动都正常，无中毒或死亡现象发生，且体质量稍有增长，故判定所制材料无急性全身毒性反应，具有生物安全性。
腹腔注射材料浸提液后1，3 ，7 d的KM小鼠体质量变化记录表如表2所示，第1天各组材料浸提液对KM小鼠体质量影响不大；第3，7天时各组KM小鼠体质量日渐增加，生理盐水组与CMCS/OKGM/PNS-2组、CMCS/OKGM/PNS-6组体质量增长结果相似；第7天时，CMCS/OKGM组体质量增长最少；CMCS/OKGM/PNS-10组第3天时体质量增长最少，第7天时体质量增长最多。在复合海绵对3T3细胞增殖影响结果中也表明了CMCS/OKGM/PNS-10复合海绵对3T3细胞的增殖效果最佳，该两项测试结果的高度吻合，证明CMCS/OKGM/PNS-10复合海绵具有极好的生物安全性。

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引言

皮肤是人体最大的器官，可作为屏障来保护人体免受病原体和疾病的侵害，并防止体液流失。在全球范围内，数以百万计的人由于不良的生活因素或疾病而遭受皮肤损伤[1]。皮肤伤口可根据其愈合速度分为慢性或急性伤口，慢性伤口是一项重要的医疗保健问题[2]。例如：糖尿病是造成慢性伤口的主要危险因素之一，因为25%的糖尿病患者会患上足溃疡[3]。通常，将慢性伤口定义为经过标准医疗6周后无法使受伤部位的解剖和功能完整的伤口[4]。在长期的愈合过程中，伤口可能会受到病原菌的感染，从而导致微生物膜的形成[5]。形成慢性伤口的病因非常复杂，主要有静脉功能不全、周围血管性疾病、全身性疾病、外伤瘢痕和感染等[6]。基本上，理想的伤口敷料应具有透气性和生物相容性，它应在损伤界面保持湿润，并作为对微生物的屏障[7]；此外，它还通过为细胞增殖提供支持来增强人体的再生能力[8]。因此，用天然材料来做医用敷料就成为一个热点。
魔芋葡甘聚糖拥有凝胶性、生物相容性、成膜性、增稠性和保水性、生物可降解性等优良性能[9]。此次实验中的氧化葡甘聚糖(oxidized konjac glucomannan，OKGM)是由高碘酸钠作为氧化剂氧化而得，避免了常用氧化方法的局限性、生产成本高等缺点[10-11]，还减低了原有分子量并提高了溶解度；替代了常用的戊二醇等有毒化学交联剂，提高了材料的生物安全性[12]。羧甲基壳聚糖(carboxymethyl chitosan，CMCS)作为壳聚糖的优良衍生物，不但拥有壳聚糖的大部分生物性能优势，并为无定型状态，可以溶于任何pH值的水溶液中[13]，拥有水溶性、保湿型、成膜性、低免疫原性、抗氧化、抗微生物及更快的生物可降解速度等优良性能[14-15]。三七的主要活性成分三七总皂苷(panax notoginseng，PNS)能够高效地作用于伤口，促进伤口愈合，并且有促进神经修复和血管再生等奇效[16]。现代研究还表明三七不仅有止血功效，还有保护心肌细胞、保护脑组织、降血脂、抗血栓、增强免疫力、抗炎、抗纤维化、抗肿瘤、消除氧自由基、抗氧化等作用[17]。有研究表明，PNS是通过调节细胞增殖分化的基因表达来提高细胞增殖率的，但是具体作用机制尚不清楚[18]。
目前，国内有关于OKGM的研究较少。前期研究制备了不同比例的CMCS/OKGM复合海绵，筛选出了具备医用复合海绵性能的5∶5比例CMCS/OKGM复合海绵，并将其作为载药性复合海绵的优良基材。因此，实验以CMCS、OKGM、三七作为原料，采用冷冻干燥法制备CMCS/OKGM/PNS复合海绵。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计观察性实验。
1.2 时间及地点于2017年7月至2018年6月在暨南大学生命科学学院生物医学工程实验室研发。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 SPF级KM小鼠20只，5周龄，体质量(22.5±3.0) g，由广州医科大学实验动物中心提供，许可证号：SYXK(粤)2020-0227。实验获得暨南大学动物伦理委员会审批(批准文号：20200315-04)。
1.3.2 试剂、药品与仪器 CMCS(取代度≥80%，上海麦克林生化科技公司)；三七超细粉(同仁堂生物制品公司)；魔芋葡甘聚糖(纯度≥95%，湖北强森魔芋科技有限公司)；高碘酸钠(AR，天津市大茂化学试剂厂)；PBS(武汉普诺赛生命科技有限公司)；CCK-8 试剂盒(上海贝博生物科技有限公司)；真空冷冻干燥机(LGJ-12，北京松源华兴科技发展有限公司)；高速冷冻离心机(KDC-160HR，科大创新股份有限公司中佳分公司)；旋转蒸发器(RE-2000A，上海司乐仪器有限公司)；酶标仪(Lab Serv K3，赛默飞世尔科技(中国)有限公司)；扫描电子显微镜(EVO MA 15，德国卡尔蔡司公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 OKGM的制备称取5.0 g 魔芋葡甘聚糖溶于500 mL 去离子水中，搅拌至均一体系，后加入6.0 g 高碘酸钠，在暗环境下24 h、30 ℃水浴并持续搅拌；再加入2 mL 乙二醇反应2 h，除去多余高碘酸钠后将液体旋蒸浓缩至总体积的1/3；经透析72 h后离心取上清液，旋蒸并干燥后研磨成粉，为OKGM[19]。
1.4.2 PNS的提取倒入10倍体积的体积分数70%乙醇于装有一定量三七超细粉的烧杯中，超声震荡提取3次，过滤之后合并滤液。将滤液旋蒸浓缩至原体积的1/3，用正丁醇重复萃取3次，去离子水稀释倒入培养皿中，铺上保鲜膜后放入冰箱4 ℃预冻1 h，再放入-30 ℃环境静置12 h，取出后用冻干机冷冻干燥，最后研磨成粉即三七提取物PNS，提取率为三七超细粉的57.16%。
1.4.3 CMCS/OKGM/PNS复合海绵的制备首先，将适量的CMCS、OKGM分别溶于去离子水中，配成5%浓度的溶液备用；然后，将制备好的三七提取物以物理混合方式按照CMCS/OKGM混合体系(CMCS与OKGM质量比为5∶5)体积2%，6%，10%的量加入到5%CMCS溶液中，室温下不断搅拌至PNS溶解完至混合均匀的分散系，加入混合体积的2%的甘油为塑性剂，加入5%OKGM溶液，继续搅拌，使氧化葡甘聚糖充分混合均匀于复合体系中，注入聚四氟乙烯培养皿中并用保鲜膜将其密封，静置30 min待材料充分交联，放入4 ℃冰箱预冻1 h ，之后转移到-30 ℃环境下12 h，最后冷冻干燥制成CMCS/OKGM/PNS复合海绵置，于-80 ℃冰箱中保存，备用。含2%，6%，10%三七总皂苷的复合海绵分别记为CMCS/OKGM/PNS-2、CMCS/OKGM/PNS-6、CMCS/OKGM/PNS-10。
1.4.4 复合海绵的性能检测
复合海绵微观结构检测：将复合海绵从-80 ℃冰箱中取出，用手术刀小心地裁剪成长宽5 mm×5 mm，厚2.5 mm 的海绵横截面样品，迅速放置于附有导电胶的铜台上并固定，喷金处理，扫描电镜下观察且记录各样品的横截面微观形貌。
复合海绵吸水率测定：将复合海绵裁剪为相同大小的长方条，在60 ℃烘箱中烘干到恒质量，随后将其冷却至室温后称质量(m0)。随后将各样品放入100 mL生理盐水中浸泡3 min，再将样品置于60°角的干净玻璃板上沥干水分，过程大约2 min，再用滤纸吸收外表多余水分后称质量(m1)。按下述式(1)进行计算吸水率，各样品均测3次后取平均值[20]。
吸水率=(m1-m0)/m0×100% (式1)
复合海绵孔隙率测定：采用称重法检测复合海绵孔隙率。称取样品质量(mt)。首先用水装满200 mL烧杯，称质量(m1)；倒掉其中一部分水后放入样品到烧杯里，待水充满样品孔隙后称质量(m2)；将材料从烧杯里取出后剩余水分和烧杯再称质量(m3)。孔隙率可以按照下述式2进行计算。各样品均平行测3次后取平均值[20]。
孔隙率=(m2-mt-m3)/(m1-m3)×100% (式2)
复合海绵水蒸气透过率测定：将复合海绵置于恒温鼓风干燥箱内烘干至恒质量，倒入30 mL蒸馏水至细口瓶中，称质量(m1)，随后在瓶口边涂满凡士林再把样品放在瓶口处，样品不接触蒸馏水的水面，注意用密封条把瓶口周围密封好，将其整个置干燥器中存放24 h，取下样品后细口瓶与蒸馏水再称质量(m2)，每组样品有3个平行样，且各样均平行测定3 次后取平均值，样品的透气率按下述式3进行计算[20]。
透气率ε=(m1-m2)/(t×π×r2×h) (式3)
式中t为测试时间，r为细口瓶内径，h为样品厚度。
复合海绵的药物释放度测定：称取0.5 g复合海绵，每组设置3个平行对照，用pH值为7.4的PBS为药物释放的介质，按照“《中国药典》2015 年版总则0931”中的相关规定进行海绵，三七总皂苷释放度测试，分别于开始测试后的预定时间点取样100 μL，然后加入色谱纯甲醇400 μL，混匀后6 000 r/min离心5 min，吸取上清液，0.45 μm 滤膜过滤后按照指纹图谱及人参皂苷Rg1定量分析方法测定释放的三七总皂苷含量[20-21]。
复合海绵对3T3细胞增殖的影响：采用CCK-8 法检测复合海绵对3T3小鼠胚胎成纤维细胞(上海研域生物科技有限公司)增殖率的影响。此部分实施步骤均按照《中华人民共和国国家标准GB/T 16886.5-2003》“医疗器械生物学评价第5部分”中的要求进行实验[22]。取培养箱中培培养24，48，72 h的细胞液，采用酶标仪检测450 nm 处的A值，按照公式4计算出细胞相对增殖率。
细胞相对增殖率=(A实验组-A空白组)/(A对照组-A空白组)×100%
(式4)
复合海绵抗菌性能实验：该部分研究采用的是抑菌圈测试法，是实验室目前评价材料的抗菌性能最常用的方法之一。采用其中的打孔法来评价5 mg复合海绵对革兰阴性菌种大肠杆菌(E.coli，环凯微生物)和革兰阳性菌种金黄色葡萄球菌(S.aureus，环凯微生物)的抗菌效果。实验24 h后观察抑菌效果，拍照记录。
复合海绵的急性全身毒性实验：将复合海绵经浸提液(将复合海绵置于去离子水中，浸提比例为1 g/L，25 ℃浸提48 h)注射入KM小鼠，按照“《中华人民共和国国家标准》GB/T16886.11-2011”中的“医疗器械生物学评价第11部分：全身毒性试验”的相关规定进行实验[23]。每只小鼠按照50 mL/kg 的剂量标准腹腔注射浸提液，注射完毕后饲养并观察反应，然后在第1，3，7天记录各组小鼠的运动量、进食情况、排便情况、呼吸速率、死亡状况等，并称重记录体质量。
1.5 主要观察指标复合海绵的微观结构、孔隙率、蒸气透过率、三七总皂苷释放度、细胞相容性、抗菌性能与急性全身毒性反应。
1.6 统计学分析采用SPSS 19.0统计软件，数据以x±s表达，采用单因数方差分析对实验数据进行相应处理。

讨论

皮肤慢性伤口以糖尿病患者的皮肤溃疡为典型代表，25%的糖尿病患者会患上足溃疡[3]，该种伤口渗出液较多，其表面易形成不良性微生物膜，一旦出现皮肤缺损伤口就开始感染、化脓，接着病变成反复性伤口——“溃疡”，即使经过长时间治疗也不易愈合，甚至还会恶性发展为坏疽(足病)而导致截肢[24]。临床上对于糖尿病的足病治疗手段也比较复杂，带给患者生理及心理上的极大病痛和生活困扰[25]。故针对慢性伤口设计的伤口敷料必须拥有良好的抗菌性、透气性、吸液性、无毒，能作为缓释药物载体且促进细胞增殖。实验的3成分复合海绵可以负载不同的药物，以满足不同程度的慢性伤口需求，有很大的发展前景。
实验选用的CMCS、OKGM与PNS均是天然生物材料，有着较高的生物相容性。有研究表明，CMCS在细胞间相互作用使细胞增殖，从而达到促进伤口愈合的目的[26-27]。在载药方面，MARZAN等[28]的实验表明原材料配比不同会影响释药速度。实验中的复合海绵PNS释放度曲线图也证实了这一点，同时也证明了CMCS/OKGM/PNS-10复合海绵具有优异的释药能力。PNS可以调节高脂饮食糖尿病大鼠的血脂异常[29]，并能降低升糖负荷和胰岛素抵抗指数、抗血小板聚集[30-31]。在结构性能方面，复合海绵负载PNS的效果较好，分布均匀的孔洞结构也使得复合海绵拥有优良的吸水率、孔隙率及透气率，有利于吸收伤口渗液，并且保持伤口处的气体交换，避免了渗液积留在伤口表面，从而保证伤口愈合的友好环境[32]，符合医用级伤口敷料标准。在抗菌方面，CMCS表现出很强的抗菌性[33]。此外有研究表明，PNS能预防且治疗动物和人类感染[34]。此次实验结果表明所制备的复合海绵具有优良的抗菌性。在细胞增殖方面，由于CMCS的两性电解质特性使得成纤维细胞能够很好地贴附材料生长[35]，并且实验研究结果表明PNS的加入极大地促进了3T3细胞增殖的能力，使得慢性伤口能很好地愈合。急性全身毒性结果也表明CMCS/OKGM/PNS-10复合海绵有极好的生物安全性，优良的吸水率、孔隙率和水蒸气透过率性能，这一结果是由于：起初CMCS与OKGM的交联作用使得CMCS/OKGM复合海绵具有较好的吸水率、孔隙率与水蒸气透过率，而后PNS的加入使得CMCS与OKGM的混合原料总体系发生变化，导致CMCS/OKGM/PNS-10复合海绵的孔洞结构发生改良，这一变化也使得CMCS/OKGM/PNS-10复合海绵拥有相对于其他比例的CMCS/OKGM/PNS复合海绵更优异的吸水率、孔隙率与水蒸气透过率。故实验因此获得了较佳的CMCS/OKGM/PNS-10复合海绵制作配方。
实验中制备的复合海绵质量较轻，在复合海绵孔隙率测定中使用的是吸水称重法，虽然设置了3组平行样来测定，但是精确度方面仍不够准确，有一定的误差。在吸湿性方面，由于实验中复合海绵自身有容纳伤口渗液的有限空间，使得复合海绵不具有较长的持续吸湿能力，但其吸水率较高，针对渗液较多的伤口有显著疗效。患者使用应及时更换复合海绵(建议过夜前更换，伤口渗液严重时勤换)，避免渗液富集在海绵内部造成伤口的二次感染。急性全身毒性实验中实验对象为KM小鼠，其皮肤生理构造与人体有所差别。考虑到适用性，后期应将CMCS/OKGM/PNS-10复合海绵进一步实施临床测试，才能运用到皮肤科的临床治疗中，使得实验研发的慢性伤口敷料——CMCS/OKGM/PNS-10复合海绵具有较高的临床价值和市场前景。
结论：实验采用冷冻干燥法制备CMCS/OKGM/PNS复合海绵，并对其进行3T3细胞增殖率、急性全身毒性、孔隙率、水蒸气透过率、抗菌性、三七总皂苷释放度等测试，结果分析表明：以CMCS/OKGM复合海绵为最佳载药型慢性伤口敷料的载体，向CMCS/OKGM复合海绵混合原料的总混合体系中加入10%的PNS为研制CMCS/OKGM/PNS复合海绵的最佳配方，该海绵具有更优异的透气率、抗菌活性、生物安全性且能促表皮细胞增殖，有望成为优良的医用慢性伤口敷料。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

用于慢性伤口羧甲基壳聚糖/氧化葡甘聚糖/三七总皂苷复合海绵的制备及性能评价

Preparation and performance evaluation of carboxymethyl chitosan/oxidized glucomannan/Panax notoginseng compound sponge dressing for chronic wound

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