针刺与异常机械应力对大鼠椎间盘纤维环纳米级生物力学特性影响的对比

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0649

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (34): 5526-5517.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0649

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针刺与异常机械应力对大鼠椎间盘纤维环纳米级生物力学特性影响的对比

李海涛¹，梁婷²，邵毅杰¹，陈曦²，杨惠林¹，罗宗平²

¹苏州大学附属第一医院，江苏省苏州市 215000；²苏州大学骨科研究所，江苏省苏州市 215000

收稿日期:2018-07-03 出版日期:2018-12-08 发布日期:2018-12-08
通讯作者: 杨惠林，主任医师，苏州大学附属第一医院骨科，江苏省苏州市 215000
作者简介:李海涛，男，1990年生，安徽省阜阳市人，汉族，在读硕士，主要从事椎间盘退变的基础研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81320108018，31570943，31270995)

Influence of needle puncture versus abnormal mechanical compression on the biological properties of annulus fibrosus: a preliminary study at nano-scale

Li Haitao¹, Liang Ting², Shao Yijie¹, Chen Xi², Yang Huilin¹, Luo Zongping²

¹The First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215000, Jiangsu Province, China; ²Institute of Orthopaedics at Soochow University, Suzhou 215000, Jiangsu Province, China

Received:2018-07-03 Online:2018-12-08 Published:2018-12-08
Contact: Yang Huilin, Chief physician, the First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215000, Jiangsu Province, China
About author:Li Haitao, Master candidate, the First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215000, Jiangsu Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81320108018, 31570943, 31270995

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
复合改良型大鼠椎间盘退变模型：放弃使用llizarov所使用的固定应力诱导椎间盘退变，转而采用距离缩短的方式压缩椎间盘诱导退变，具有操作简便、装置轻便、可重复性高的优点。
原子力显微镜：微悬臂上尖细探针与受测样品之间的作用力引起微悬臂形变，利用激光束反射放大微悬臂形变的信号，达到以极高分辨率(纳米级)检测样本三维表面的目的，同时可以精确计算样本结构的力学特性。

背景：目前关于椎间盘退变机制的研究仍不透彻，尤其是不同退变机制影响下退变椎间盘纳米级改变的研究几乎处于空白状态。
目的：建立一种简便易行的大鼠尾椎椎间盘退变模型，探索针刺及异常机械应力退变机制对纤维环单根胶原纤维纳米级别生物力学特性的影响。
方法：取8只骨发育成熟的雄性SD大鼠，手法定位每只大鼠第5-11尾椎间盘位置，其中Co5-Co6椎间盘为正常组；对Co6-Co7椎间盘实施半程穿刺操作(针刺组)；对第7-10椎间盘加装自行设计的外固定支架(其中Co8-Co9椎间盘为异常压应力组)；Co10-Co11椎间盘为邻近组。4周后，对大鼠尾椎行磁共振矢状位T2加权像扫描，椎间盘组织行苏木精-伊红与番红O-快绿染色，以及椎间盘组织纤维环内外层原子力显微镜观察。
结果与结论：①异常压应力组、针刺组大鼠尾椎间盘MRI信号明显低于正常组及邻近组(P < 0.05)，正常组及邻近组尾椎间盘MRI信号无明显差异；②组织学观察显示，邻近组尾椎间盘组织表现与正常组相似；针刺组一侧纤维环明显紊乱、增厚且突入髓核区域之内，髓核与纤维环界限紊乱，穿刺一侧髓核内细胞数量明显下降，空泡状结构消失；异常压应力组纤维环髓核区域面积下降，髓核细胞数量减少、聚集，空泡状结构消失，髓核与纤维环界限清晰；③原子力显微镜观察显示，各组纤维环外层的胶原纤维弹性模量均高于内层(P < 0.05)；邻近组、异常压应力组纤维环内、外层的胶原纤维弹性模量与正常组比较无差异；针刺组纤维环内、外层的胶原纤维弹性模量大于正常组、异常压应力组(P < 0.01)；④结果表明与异常压应力诱导机制不同，针刺机制诱导的椎间盘退变纤维环胶原纤维表现出明显僵硬化现象。

ORCID: 0000-0001-8655-1513(杨惠林)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 纤维环, 大鼠椎间盘退变模型, 原子力显微镜, 针刺与异常压应力, 纳米级

Abstract:

BACKGROUND: Currently, the specific pathological mechanism of intervertebral disk degeneration, especially the tissue alteration at nano-scale, is still unknown.

OBJECTIVE: To establish a rat model of intervertebral disk degeneration in the caudal vertebrae and to explore the biomechanical alteration of collagen fibrils of annulus fibrosus at nano-scale induced by needle puncture and abnormal mechanical loading.

METHODS: Eight adult Sprague-Dawley male rats were chosen and the coccygeal vertebral discs from C_5-11 were located under anesthesia. The Co5-Co6 segments were set as normal group. The Co6-Co7 segments were subjected to needle puncture (needle-puncture group). The Co7-Co10 segments were drilled percutaneously by four parallel K-wires and the wires were fixed with self-made braces to make the Co8-Co9 segments under a constant compression environment. The Co8-Co9 segments were set as abnormal compression group. The Co10-Co11 segments were set as adjacent group. Sagittal T2-weighted MRI scanning of the rat caudal vertebrae was performed at 4 weeks after treatment. Hematoxylin-eosin and safranin O/Fast green staining of the intervertebral disc was also performed, and the inner and outer layers of the annulus fibrosus were observed using atomic force microscope.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) The MRI signals in the abnormal compression group and needle-puncture group were significantly lower than those in the normal and adjacent groups (P < 0.05), while the MRI signals in normal and adjacent groups showed no significant difference. (2) Histological analysis revealed similarity in the normal and adjacent groups. In the needle-puncture group, the annulus fibrosus on the puncture site arranged disorderly, thickened and bulged inward into the nucleus pulposus, resulting in an unclear boundary between the annulus fibrosus and nucleus pulposus. The number of nucleus pulposus cells on the puncture side was dramatically reduced and vacuole-like structure disappeared. In the abnormal compression group, nucleus pulposus area remarkably decreased, the number of nucleus pulposus cells reduced and vacuole-like structure in the nucleus pulposus disappeared. Boundaries between the nucleus pulposus and annulus fibrosus remained clear. (3) Under the atomic force microscope, the elastic modulus of collagen fibrils in the outer layer was higher than that in the inner layer (P < 0.05). The elastic modulus of collagen fibrils in the adjacent and abnormal compression groups was similar to that in the normal group, while the elastic modulus of collagen fibrils in the needle-puncture group was higher than that in the normal and abnormal compression groups (P < 0.01). To conclude, these results reveal that the needle-puncture can induce remarkable stiffening of collagen fibrils which differs from the abnormal compression.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Intervertebral Disk Degeneration, Microscopy, Atomic Force, Elastic Modulus, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

李海涛，梁婷，邵毅杰，陈曦，杨惠林，罗宗平. 针刺与异常机械应力对大鼠椎间盘纤维环纳米级生物力学特性影响的对比[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(34): 5526-5517.

Li Haitao, Liang Ting, Shao Yijie, Chen Xi, Yang Huilin, Luo Zongping. Influence of needle puncture versus abnormal mechanical compression on the biological properties of annulus fibrosus: a preliminary study at nano-scale[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(34): 5526-5517.

图/表（结果） 5

2.1 实验动物数量分析所有8只大鼠手术耐受良好，均存活过4周实验期。大鼠平均体质量由最初的(405±20) g增长至(445±15) g，外固定支架(约5.0 g)对大鼠日常活动影响不明显，未发现感染、皮肤坏死或支架滑脱现象。

2.2 磁共振结果评估典型的各组正中矢状面T2加权像尾椎间盘图像见图3A，依据Sobajima S评价法所得磁共振指数见图3B。结果显示，针刺组与异常压应力组大鼠椎间盘髓核含水量与正常组相比显著下降(P < 0.05，P < 0.01)，表现为T2加权像低信号；邻近组Co10-Co11椎间盘含水量与正常组比较差异无显著性意义(P=0.207)，针刺组与异常压应力组间椎间盘髓核含水量比较差异无显著性意义(P=0.745 6)。

2.3 组织学分析结果

2.3.1 整体观如图4所示，邻近组尾椎间盘组织表现为与正常组相似的椭圆形髓核，髓核内细胞周围存在空泡状结构，且较为均匀的分布在髓核内，髓核与纤维环界限清晰，纤维环内成纤维细胞包埋于良好排列的纤维环板层之间；针刺组纤维环(半程穿刺)表现为一侧纤维环明显紊乱、增厚且突入髓核区域之内，髓核与纤维环界限明显紊乱，髓核内细胞穿刺一侧数量明显下降，空泡状结构消失；异常压应力组纤维环髓核区域面积下降，髓核细胞数量减少、聚集，空泡状结构消失，髓核与纤维环界限清晰，纤维环内成纤维细胞包埋于排列良好的纤维环板层之间。

2.3.2 组织学评分组织学评分统计柱状图(图5)表明，邻近组椎间盘组织学评分与正常组比较无明显差异；针刺组及异常压应力组椎间盘组织学评分与正常组相比发生了明显退变(P < 0.05，P < 0.01)。

2.4 原子力显微镜分析结果各组典型外层纤维环胶原纤维原子力显微镜下高清图像(1 μm×1 μm)如图6，各组纤维环内外层胶原纤维弹性模量统计值见图7，可知纤维环内外区域及诱导椎间盘退变的不同机制对大鼠椎间盘纤维环胶原纤维弹性模量有明显影响。各组大鼠椎间盘纤维环胶原纤维弹性模量均表现为外层高于内层(P < 0.05)。邻近组椎间盘内层、外层胶原纤维弹性模量均与正常组相比差异均无显著性意义(P=0.913 1)；针刺组内(P < 0.01)、外层胶原纤维弹性模量较正常组明显增大(P < 0.01）；异常压应力组内层(P=0.134 1)、外层(P=0.065 2)胶原纤维弹性模量与正常组相比差异无显著性意义；针刺组内外层胶原纤维弹性模量均显著高于异常压应力组(P < 0.01)。

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引言

在全球，约有80%的人在生命的某些时期都有过下腰痛记录，流行病学统计显示这一时期占生命的15%-45%之间^[1]。其中，椎间盘退变导致的椎间盘源性疼痛是下腰痛众多原因中最常见的病因^[2-3]。研究表明，椎间盘源性下腰痛导致了全球最多的劳动力丧失及相应巨大的社会经济负担^[2]。因此，详细深入地了解椎间盘退变病理机制具有十分重要的意义。

据现有文献可知，椎间盘退变是一个由细胞、细胞外基质及生物力学因素共同参与的恶性循环生理过程^[4]。细胞外基质的破坏及修复作用的失衡导致椎间盘含水量下降，致使其正常力学性能丢失，进而加速椎间盘退变的进展^[4]。为了更好地了解椎间盘退变的病理发展过程并探索治疗或是抑制椎间盘退变的方法，动物模型以其良好的经济适用性和简便性被广泛应用于椎间盘退变研究中。以已知的人类椎间盘退变危险因素为根据，现有的动物模型包括机械负荷模型^[5-7]、结构损伤模型^[8-10]、自发退变模型^[11-12]、化学诱导模型^[13]、尼古丁吸入模型^[14]、基因改造模型^[15]。虽然不同危险因素最终都可诱导椎间盘退变，但退变机制不同，椎间盘退变的分子生物学水平及其相应的纳米水平生物性能改变可能存在很大差异。作为常用的椎间盘退变模型之一，针刺诱导模型(结构损伤模型的一种)会导致椎间盘以机械性能缺失、炎症为特点的快速退变，这与另一常用的异常机械应力负荷诱导的椎间盘退变模型有着明显不同。已有相关椎间盘退变机制研究显示，针刺诱导的椎间盘退变过程中，基质金属蛋白酶3会呈现出早期升高后降低、后期再次升高的“双峰”特性，这与机械应力负荷诱导的椎间盘退变的“单峰”特性有明显不同^[16]。由于对Ⅱ型胶原非螺旋区域的裂解作用，基质金属蛋白酶3的超量表达会导致胶原蛋白类型的变化、蛋白多糖及糖蛋白的裂解。此外，椎间盘髓核含水量的下降及其弹性的丧失也与基质金属蛋白酶3的表达呈正相关，故基质金属蛋白酶3往往被认为在椎间盘退变中起着十分重要的作用。基于生物分子水平表达的差异，两种不同退变机制诱导的退变椎间盘纤维环胶原纤维纳米级生物力学特性即弹性模量也可能不同。

众所周知，椎间盘是维持脊柱稳定性与活动的重要因素。宏观上，椎间盘包括纤维软骨样的纤维环、凝胶状髓核及软骨终板，它们各自发挥不同的生理学功能，其中纤维环环绕在髓核周围，使椎间盘具备传导并分散脊柱应力的作用^[17]。除了椎间盘纤维环胶原纤维的独特排列外，纤维环内胶原纤维本身的弹性模量也起着不可或缺的作用^[18]。微观上，纤维环细胞已被证实其代谢活动明显受细胞周围力学环境的影响^[19-20]。Hayes等^[21]的研究表明，拉应力会明显影响纤维环细胞的功能和细胞类型，包括分布、排列及合成胶原的类型。可见，纤维环胶原纤维弹性模量的改变可能不仅会影响宏观椎间盘生物力学的性能，同时也会影响纤维环细胞周围的力学环境，进而影响椎间盘退变的发展。而目前有关纳米级别纤维环胶原纤维力学特性的研究处于接近空白状态。原子力显微镜为人们提供了一个能够直接观察胶原纤维组织表面的方法，并能自动计算出单根胶原纤维的弹性模量。

综上，作者认为椎间盘的退变会导致单根胶原纤维纳米级别力学特性发生改变，且其变化与退变机制存在相关性。由于上述其在宏观与微观上对椎间盘性能的影响，研究不同退变机制下纤维环胶原纤维的生物力学改变，不仅可以从纳米级别角度认识椎间盘退变，同时对于椎间盘退变修复治疗手段的研究也有积极意义。故实验采用自行设计的大鼠尾椎间盘模型，实现针刺与异常应力压缩模型在同一大鼠尾椎上，在尽可能减小个体差异的前提下，研究现今最为常见的针刺和压缩机制对大鼠尾椎间盘纤维环胶原纤维生物力学的影响。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计体外对比观察实验。

1.2 时间及地点实验于2016年2月至2017年8月在苏州大学附属第一医院骨科研究所完成。

1.3 材料

实验动物：3月龄骨发育成熟雄性SD大鼠，体质量(405±20) g，由苏州大学实验动物中心提供，动物许可证号：SYXK(苏)2012-0062。

实验主要试剂与仪器：自主设计的模具以及支架、手术器械(苏州大学材料供应中心提供)；20 G穿刺针(苏州大学附属第一医院)；空心骨钻(广州华创医疗器械有限公司)；磁共振机器(1.5 T，美国GE公司)；10%中性甲醛固定液(上海源叶生物技术有限公司)；EDTA-2Na(美国Biosharp公司)；组织包埋切片机(德国Leica公司)；二甲苯(分析纯，凌峰化学试剂有限公司)；无水乙醇(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；伊红、苏木精染液(北京BiotoppedScience ＆Technology Co.Ltd)；番红-O及快绿染液(美国Sigma公司)；光学显微镜(德国蔡司公司Zeiss)；冰冻切片机(德国Leica公司)；原子力显微镜(Dimension ICON，Bruker，USA)。

1.4 实验方法

1.4.1 实验动物的分组选取8只3月龄骨发育成熟清洁级雄性SD大鼠^[22]。每只大鼠的第五六尾椎间盘(Co5-Co6)为正常组，六七尾椎间盘(Co6-Co7)为针刺组，八九尾椎间盘(Co8-Co9)为异常压应力组，第10至11尾椎间盘(Co10-Co11)为邻近组。MRI扫描后，随机选取5只用于组织学分析，剩余的3只用于冰冻切片作原子力显微镜扫描检测。

1.4.2 退变动物模型的建立

自行设计退变模型外固定装置及器具：整体固定装置(图1A)包括直径1.2 mm克氏针(4根)，40 mm的矩形铝棒，上有与克氏针直径相符针孔，针孔间隔依次为13 mm、 11 mm、13 mm，20 G穿刺针。穿刺辅助模具及模型用具如图2，共分上下2部分，2部分均对应每隔12 mm穿一孔洞，中央区域做一锥形孔洞以适应大鼠尾巴直径近端向远端逐渐变小的特点(近远端孔径直径根据适龄大鼠尾巴实际测量直径制作)。最后实际大鼠模型见图1B。

手术过程：术前对每只大鼠(共8只)进行称质量，以1%戊巴比妥钠(40 g/L腹腔注射)麻醉大鼠。以体积分数75%乙醇消毒手术台及手套，铺无菌垫单。大鼠麻醉后，固定于手术台，以安尔碘清洁大鼠尾巴。将大鼠定于左侧卧位，根据Lotz等^[23]提供的方法手法定位Co5-Co11的椎间盘并标记^[16^，^24]。之后标记目标椎间盘间椎体，并使标记点间隔为固定12 mm。取20 G穿刺针，在标尺的协助下，对Co6-Co7椎间盘行半程穿刺(穿深5 mm)，旋转180°停留 5 s后缓慢拔出。之后在自制模具的协助下，用空心骨钻将4根克氏针(长度：40 mm；直径：1.2 mm)在Co7-Co10椎体标记处经皮穿出，使4根克氏针平行穿出并保持间距均为12 mm。随后将预制好的铝合金支架(13 mm-11 mm- 13 mm)安装在大鼠尾巴上，模型完成。术后生理盐水冲洗手术部位并连续3 d注射青霉素。大鼠可在鼠笼中自由活动进食和饮水。

1.4.3 MRI检查术后4周，将所有大鼠腹腔麻醉，采用1.5 T磁共振系统扫描大鼠尾椎间盘(矢状面)。成像序列为自选回拨T2加权像，获得无脂肪饱和扫描参数：充实时间：3 000 ms；响应时间：80 ms；视野：200 mm×200 mm；片层厚度：1.4 mm。实验使用pacs系统对图像进行观察分析，磁共振信号评价采用Sobajima S标准^[25]，所有图像均由3位作者共同观察评价，数据为3人所得结果的平均值，表示为磁共振指数。

1.4.4 组织学检查

椎间盘组织切片的制作：磁共振检查后过量麻醉处死大鼠，将随机选取的5只大鼠包含Co5-Co11椎间盘的尾巴切下，剥离表皮后置于体积分数10%中性甲醛中，室温固定24 h；之后放于EDTA脱钙液中脱钙4周，期间定期更换脱钙液，观察脱钙状况并逐步修剪椎间盘周围组织；将彻底脱钙的大鼠尾椎清洗、脱水、透明、浸蜡并包埋切片(切片厚度5 μm)。

苏木精-伊红染色：载玻片置于55 ℃恒温箱中烤片 20 min；二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中分别脱蜡10 min；无水乙醇、体积分数95%乙醇梯度脱二甲苯；蒸馏水洗2 min；苏木精染色5 min，自来水冲洗；75%盐酸乙醇分化30 s；自来水浸泡15 min；伊红染液2 min；体积分数95%乙醇1 min；体积分数95%乙醇1 min；体积分数100%乙醇1 min；体积分数100%乙醇1 min；二甲苯1 min；二甲苯1 min；中性树脂封固。

番红O-快绿染色：将载玻片置于55 ℃恒温箱中烤片20 min；二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中分别脱蜡10 min；无水乙醇、体积分数95%乙醇梯度脱二甲苯；去离子水中浸泡3 min；苏木精染色5 min；流水冲洗；快绿染液中染色6 min；1%的乙酸中浸洗10次；番红-O染色15 min；95%乙醇浸洗 3 min；无水乙醇1 min 2次；二甲苯透明2 min 2次；中性树胶封固。

组织学分析：椎间盘退变评分采用经典的Masuda评分标准用于评估各组椎间盘变化，具体见表1。

1.4.5 原子力显微镜检查

冰冻切片：将剩余3只大鼠过量麻醉处死，剥除表皮组织并剪除多余肌肉韧带组织，暴露目标椎间盘(Co5-Co6正常组、Co6-Co7针刺组、Co8-Co9异常压应力组、C10-Co11邻近组)。用11号尖刀片环切剜出完整大鼠尾椎间盘，放于2 mL冻存管中。将组织放于专用的冰冻包埋剂中，并用冰冻切片机以20 μm的厚度切片。

原子力显微镜观察：鉴于之前研究表明^[26]，纤维环不同区域的胶原纤维直径、弹性模量明显不同，且中间区域与内外侧纤维环差异无统计学意义。故实验将纤维环分为内层、外层两区域加以检测。每个区域随机选取10根胶原纤维作为检测对象(针刺组扫描区域为穿刺路径周围组织)。原子力显微镜图像扫描及纳米力学测定使用曲率半径为5 nm的ScanAsyst-Air探针，扫描频率为1 Hz，力常数为0.4 N/m。原子力显微镜测试在室温空气环境下进行。

胶原纤维的压缩弹性模量通过原子力学显微镜在Peak Force QNM (Quantitative Nano Mechanic，定量纳米力学分析)模式下测定。由于胶原纤维束的弹性模量在重叠区和间隙位置存在很大的差异，所以研究只测定重叠区域的弹性模量。首先通过Thermal tune校准探针的力常数k，通过Ti标样的扫描图像校准针尖的曲率半径R，在QNM模式下先扫描较大面积区域(5 μm×5 μm)，再选择其中较小面积的扫描区域(1 μm×1 μm)进行高精度测量。实验中弹性(压缩)模量的计算采用生物组织原子力显微镜测试中最常用的Hertz模型，见公式(1)：

其中F为压力，E为杨氏模量，υ为泊松比，R为校准后的压头(探针)半径，δ为压痕深度。

1.5 主要观察指标各组大鼠椎间盘MRI、组织学及原子力显微镜观察结果。

1.6 统计学分析所有数据均以x(_)±s表示。采用费舍尔偏最小二乘法双向方差分析不同组间纤维环胶原纤维的差异。t 检验被用于分析不同退变机制诱导的退变椎间盘的MRI和组织学分级评分及胶原纤维弹性模量组间区别。使用的统计软件为SPSS 13.0统计软件，统计学差异被设定为P < 0.05。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

由于实验异常压应力组采用了缩短距离的方式压迫椎间盘，而非常用的类似IIizarov装置所采用的弹簧固定应力的造模方式^[27]，故采用MRI及组织学分析的方式对大鼠尾椎间盘是否发生退变加以确认。

首先，MRI是临床最为常用且公认最为有效的判断椎间盘退变方法。T2加权像可有效反映椎间盘髓核含水量变化^[28-30]，而椎间盘退变的一大特征就是髓核含水量下降。Kim等的研究也认为T2加权像检查是大鼠椎间盘退变的有效评价措施^[31]。实验MRI检查结果表明，针刺组与异常压应力组椎间盘T2加权像信号显著降低，而MRI指数的量化分析也表明，针刺组与异常压应力组椎间盘发生了退变，而邻近组大鼠尾椎间盘与正常组相比并未发现明显改变。组织学分析方面，Masuda依据人类椎间盘退变的特点，将椎间盘退变的特点总结为髓核区域、髓核与纤维环交界及纤维环区域3大区域的变化，并分别评分最终用于评估椎间盘的退变程度^[32]。实验结果表明，针刺组与异常压应力组椎间盘均发生退变且各有特点。综上认为，实验动物模型成功地诱导出了针刺与压缩机制的大鼠尾椎间盘退变，同时邻近组的结果也表明，克氏针造成的损伤及支架对实验期间大鼠尾椎间盘的影响并不明显。

根据原子力显微镜扫描结果发现，所有大鼠尾椎间盘纤维环胶原纤维弹性模量均表现为外层大于内层，这与之前的研究结果保持一致^[26]。此外实验发现，针刺显著影响了椎间盘纤维环胶原纤维的力学特性(压缩弹性模量)，而异常压应力诱导的退变椎间盘纤维环胶原纤维仅表现为趋势性升高。

目前针刺导致大鼠纤维环胶原纤维弹性模量显著上调的机制目前尚不清楚，但从分子学角度出发，已知纤维环由内向外Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原含量比例的逐渐提高，以适应逐渐改变的纤维环所受应力特点，Ⅰ型胶原含量的逐渐升高可能是导致纤维环内外层胶原纤维弹性模量差异的重要原因^[33-35]。同理，针刺组椎间盘在退变过程中，纤维环内可能产生了更多的Ⅰ型胶原。另一方面，从针刺对椎间盘生物力学宏观影响的方面看，胶原纤维弹性模量的显著增加可能是椎间盘对其结构完整性破坏及力学环境改变的一种适应性改变。Gregory等^[36]关于针刺对兔椎间盘退变的研究发现，针刺诱导退变的椎间盘纤维环抗分层能力明显下降。研究表明，纤维环板层间基质主要成分包括Ⅵ型胶原纤维、蛋白多糖及弹力蛋白^[37-39]。每一种成分都在保持基质完整性和抗分层中扮演着重要角色，而针刺可能会造成以上基质成分的改变，导致纤维环抗分层能力下降。已知纤维环的机械特性受以下几个因素影响，包括纤维的特殊排列、板层间基质、纤维机械特性及基质成分的相互作用^[40-41]。因此，在力学刺激下，针刺造成的纤维环抗分层能力下降很可能导致胶原纤维弹性模量适应性升高。一项关于针刺诱导椎间盘退变机械特性改变的急性期和长期研究也为此提供了侧面支持^[42]。该研究发现，针刺会导致椎间盘抗压缩强度、抗扭转强度及阻尼刚度的立刻下降，8周后，尽管实验组椎间隙下降、髓核糖胺聚糖含量下降等椎间盘退变表现十分明显，前述椎间盘力学特性仍并未发生显著变化。总之，针刺诱导的退变椎间盘中髓核基质由凝胶状转变为纤维软骨状，纤维环抗分层能力下降及纤维环胶原纤维弹性模量的显著提高共同构筑了椎间盘对纤维环结构被破坏，以及机械力学刺激变化所做的适应性改变理论基础。

值得注意的是，胶原纤维弹性模量升高所造成的纤维环细胞外微力学环境改变是不能忽视的。研究表明，椎间盘组织所受到的机械应力会传递至细胞等级，并通过纤维环细胞分泌的黏附分子传递给纤维环细胞^[43]，影响细胞的功能和表达^[21^，^44-45]。由于纤维环细胞包埋于胶原纤维的细胞外基质中，胶原纤维弹性模量的改变很可能会影响纤维环细胞外的力学环境。

与异常压应力组纤维环胶原纤维弹性模量趋势性上升相比，针刺组相对于异常压应力组以及正常组弹性模量的显著升高可能含有重要的临床意义。众所周知，穿刺针穿刺被广泛用于临床的椎间盘造影，同时也常常是治疗椎间盘退变的潜在手段，如基因治疗、脊索细胞注入等的给药方式。矛盾的是，针刺同时也是诱导椎间盘退变的有效方式，一项针对针刺损伤对纤维环微观剪切力的研究表明，即使直径最小的椎间盘造影穿刺针都会改变纤维环局部结构的构成，影响其力学功能并增加椎间盘退变的风险^[46-48]。而近期一项关于椎间盘造影长期影响的前瞻性队列研究表明，经历了椎间盘造影的患者往往有更高的腰椎间盘退变相关临床风险，如手术、疼痛加剧、药物治疗及劳动力丧失等^[49]。因此作者倾向于认为，即使是小直径的穿刺针也会导致纤维环胶原纤维弹性模量显著升高的椎间盘退变，这与长期异常应力(人类椎间盘退变最常见的诱因之一)导致的椎间盘退变有明显不同。利用针刺的式进行单纯髓核生物治疗而忽视针刺对纤维环的特殊影响，可能会对椎间盘退变的治疗产生不利影响。

相比之前研究中纤维环胶原纤维的弹性模量在0.6-1.2 GPa之间^[26]，实验结果仅为90-270 MPa。原因可能在于实验直接采用冰冻切片的方法，所扫描的样本未经甲醛固定，脱水，脱钙以及浸蜡等可能干扰胶原纤维力学性能的准确性的步骤。同时实验也存在一定的不足，首先，与人类椎间盘脊髓细胞在成年时期即转变为软骨样细胞相比^[50]，实验所采用的大鼠椎间盘中仍旧存在的脊索细胞，在一定程度上限制了其与人类退变椎间盘的可比性^[51]，且大鼠尾椎所受的机械负荷类型也与人类椎间盘有所不同，但可以确定的是实验中针刺缺失导致了椎间盘退变，且纤维环胶原纤维弹性模量的定性改变结果是可靠的；另一个不足在于实验大鼠样本数量相对较少，且如果实验加入更多时间点，或许有更多有意义的发现。在未来的研究中，会尝试使用更接近人类椎间盘的动物模型实验针刺对椎间盘的影响，并加入更多时间点以便更深入地理解针刺对椎间盘的影响。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

针刺与异常机械应力对大鼠椎间盘纤维环纳米级生物力学特性影响的对比

Influence of needle puncture versus abnormal mechanical compression on the biological properties of annulus fibrosus: a preliminary study at nano-scale

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