生物反应器中的力学刺激促进组织工程软骨再生

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.02.006

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (2): 185-190.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.02.006

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生物反应器中的力学刺激促进组织工程软骨再生

余晓明，孟昊业，孙振，尹合勇，袁雪凌，郭全义，彭江，汪爱媛，卢世璧

解放军总医院骨科研究所，骨科再生医学北京市重点实验室，北京市 100853

收稿日期:2015-11-13 出版日期:2016-01-08 发布日期:2016-01-08
通讯作者: 汪爱媛，副研究员，硕士生导师，解放军总医院骨科研究所，骨科再生医学北京市重点实验室，北京市 100853
作者简介:余晓明，男，1988年生，汉族，山西省阳泉市人，解放军医学院在读硕士，医师
基金资助:
国家“863”计划项目(2012AA020502)；全军十二五重点项目(BWS11J025)；国家“973”重点基础研究发展规划项目(2012CB518106)

Bioreactor cultivation and mechanical stimulation for regeneration of tissue-engineered cartilage

Yu Xiao-ming, Meng Hao-ye, Sun Zhen, Yin He-yong, Yuan Xue-ling, Guo Quan-yi, Peng Jiang, Wang Ai-yuan, Lu Shi-bi

Institute of Orthopedics, Chinese PLA General Hospital, Beijing Key Laboratory of Orthopedics Regeneration, Beijing 100853, China

Received:2015-11-13 Online:2016-01-08 Published:2016-01-08
Contact: Wang Ai-yuan, Associate investigator, Master’s supervisor, Institute of Orthopedics, Chinese PLA General Hospital, Beijing Key Laboratory of Orthopedics Regeneration, Beijing 100853, China
About author:Yu Xiao-ming, Studying for master’s degree, Physician, Institute of Orthopedics, Chinese PLA General Hospital, Beijing Key Laboratory of Orthopedics Regeneration, Beijing 100853, China
Supported by:
the National 863 Program of China, No. 2012AA020502; the PLA Major Project during the Twelfth Five-Year Period, No. BWS11J025; the National 973 Program of China, No. 2012CB518106.

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：

生物反应器：是利用生物催化剂为细胞培养或发酵或酶反应提供良好反应环境的设备，通常称为发酵罐或酶反应器。生物反应器是生物反应过程中的关键设备，它的结构、操作方式和操作条件对生物技术产品的质量、转化率和能耗有着密切关系。用于污水生物处理的曝气池或厌气消化罐也可作为生物反应器的一类。

构建组织工程软骨的主要条件：将软骨种子种植于可生物降解、组织相容性好的生物材料形成复合物，再把该复合物植入软骨缺损处，在生物材料自行降解的过程中，种植的细胞形成新的软骨来填充缺损。构建过程所需主要条件为：①足够数量、功能正常的种子细胞。②合适的细胞支架。③调节细胞增殖、保持细胞表型特征的细胞因子。

背景：软骨组织工程已被广泛用来实现体外软骨组织再生，并用来修复软骨缺损。软骨组织工程主要由软骨细胞、软骨支架和体外培养环境3部分组成。

目的：实验通过体外模拟体内关节软骨生长环境，为进一步提高组织工程软骨的仿生性及更好地修复损伤软骨提供理论依据。

方法：2月龄新西兰大白兔，用于分离培养膝关节软骨细胞，取第2代细胞以1×10⁶ L^-1细胞浓度接种于去细胞软骨基质支架上制备细胞-支架复合物。实验分为实验组和对照组，对照组单纯细胞支架复合静态培养1 d，实验组于Instron生物反应器中培养，加以力学刺激(力学加载参数为3 h/d，1 Hz，压缩量为10%)7，14，21，28 d。

结果与结论：①随着培养时间的延长，实验组细胞-支架复合物厚度、弹性模量及最大负荷均显著高于对照组(P < 0.05)。②实验组组织切片苏木精-伊红染色均可见软骨细胞增殖及软骨陷窝形成，番红“O”染色见细胞-支架复合物的细胞外基质中有大量蛋白聚糖形成，随力学刺激时间延长而逐渐增加，并与蛋白聚糖试剂盒检测结果相符。③实时荧光定量PCR检测示，实验组Ⅰ，Ⅱ型胶原表达均高于对照组(P < 0.05)，实验组中力学刺激21 d时Ⅰ型胶原表达最高(P < 0.05)；Ⅱ型胶原在力学刺激28 d表达最高(P < 0.05)。④结果证实细胞-支架复合物通过生物反应器的力学加载，可以产生更多的胶原和蛋白聚糖等细胞外基质成分，并增强其力学特性，使其更加复合人体软骨生长环境，并提高其与正常软骨的仿生性，从而使细胞支架复合物能更好的修复损伤软骨。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

ORCID: 0000-0003-2240-0710(汪爱媛)

关键词: 组织构建, 软骨组织工程, 生物反应器, 软骨支架, 软骨, 再生医学, 力学刺激, 弹性模量, 蛋白多糖, 仿生

Abstract:

BACKGROUND: Cartilage tissue engineering has been widely used to achieve cartilage regeneration in vitro and repair cartilage defects. Tissue-engineered cartilage mainly consists of chondrocytes, cartilage scaffold and in vitro environment.
OBJECTIVE: To mimic the environment of articular cartilage development in vivo, in order to increase the bionic features of tissue-engineered cartilage scaffold and effectiveness of cartilage repair.
METHODS: Knee joint chondrocytes were isolated from New Zealand white rabbits, 2 months old, and expanded in vitro. The chondrocytes at passage 2 were seeded onto a scaffold of articular cartilage extracellular matrix in the concentration of 1×106/L to prepare cell-scaffold composites. Cell-scaffold composites were cultivated in an Instron bioreactor with mechanical compression (1 Hz, 3 hours per day, 10% compression) as experimental group for 7, 14, 24, 28 days or cultured statically for 1 day as control group.
RESULTS AND CONCLUSION: Morphological observations demonstrated that the thickness, elastic modulus and maximum load of the composite in the experimental group were significantly higher than those in the control group, which were positively related to time (P < 0.05). Histological staining showed the proliferation of chondrocytes, formation of cartilage lacuna and synthesis of proteoglycan in the experimental group through hematoxylin-eosin staining and safranin-O staining, which were increased gradually with mechanical stimulation time. These results were consistent with the findings of proteoglycan kit. Real-time quantitative PCR revealed that mRNA expressions of collagen type I and collagen type II were significantly higher in the experimental group than the control group (P < 0.05). The experimental group showed the highest mRNA expression of collagen type I and collagen type II at 21 and 28 days of mechanical stimulation, respectively (P < 0.05). With the mechanical stimulation of bioreactor, the cell-scaffold composite can produce more extracellular matrix, such as collagen and proteoglycan, strengthen the mechanical properties to be more coincident with the in vivo environment of cartilage development, and increase the bionic features. With the progress of tissue engineering, the clinical bioregeneration of damaged cartilage will be achieved.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

余晓明，孟昊业，孙振，尹合勇，袁雪凌，郭全义，彭江，汪爱媛，卢世璧. 生物反应器中的力学刺激促进组织工程软骨再生[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(2): 185-190.

Yu Xiao-ming, Meng Hao-ye, Sun Zhen, Yin He-yong, Yuan Xue-ling, Guo Quan-yi, Peng Jiang, Wang Ai-yuan, Lu Shi-bi . Bioreactor cultivation and mechanical stimulation for regeneration of tissue-engineered cartilage[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(2): 185-190.

图/表（结果） 4

2.1 细胞-支架复合物通过生物反应器的力学加载后的生物力学特性变化静态培养1 d组、力学加载培养7，14，21，28 d各组细胞-支架复合物在生物反应器中培养，经过不同力学加载时间后，检测各组力学特性，结果显示，各组弹性模量在力学加载后逐渐增强，前2周加载后的弹性模量增加明显，2周后增加幅度明显下降。力学加载培养各组与静态培养组比较，均差异有显著性意义(P < 0.05)。其中，静态培养1 d组、力学加载培养7，14 d组间差异均有显著性意义(P < 0.05)；力学加载培养14，21 d组间差异有显著性意义(P < 0.05)。见图2。

2.2 细胞-支架复合物通过生物反应器的力学加载后的组织学变化各组样本经苏木精-伊红染色和番红“O”染色后，结果显示，各组均可见典型软骨陷窝样结构以及蛋白聚糖特异性的番红“O”阳性染色。其中，各组苏木精-伊红染色及番红“O”染色随力学加载的时间的增加而逐渐变深，且力学加载培养28 d组染色最明显。见图3。

2.3 各组经生物反应器加载后所产生的蛋白聚糖含量各组样本经不同时间点加载试验后，测得各组间蛋白聚糖含量的差异，结果显示，各组中均有蛋白聚糖的产生，但其中，随着加载时间的延续，支架中蛋白聚糖的含量逐渐增加(P < 0.05)，其结果与组织学染色结果相符。见图4。

2.4 各组经生物反应器加载后所Ⅰ，Ⅱ型胶原的表达实时荧光定量PCR检测结果显示，各组中均有不同程度表达Ⅰ型胶原，力学加载培养28 d组Ⅰ型胶原表达最高(P < 0.05)。同样，各组中均有不同程度Ⅱ型胶原的表达，其中力学加载培养21 d组中表达最高(P < 0.05)。见图5。

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引言

关节软骨在体内主要起减少摩擦、抵抗接触磨损、缓冲压力等作用。在人体正常活动过程中，关节软骨在一个动态的复杂的应力负荷环境中，其中包括压力、拉力和剪切力共同作用于软骨。这些应力的作用可以使软骨组织产生一系列物理现象，例如静态压力梯度，剪切应力，组织内液体流动，流动电位和电流，细胞和细胞外基质的变形，以及体积改变^[1-4]。而软骨抵挡高负荷和时刻变化的机械应力的能力，有赖于其结构、生化组成和软骨中的水含量。由软骨细胞合成和维持的软骨细胞外基质，包含大量的蛋白多糖、胶原以及其他的蛋白和非蛋白分子，而这些都是正常的、有功能的软骨组织所必须的。目前的组织工程技术，还难以使软骨细胞产生足够的细胞外基质来构成再生软骨组织，并组成其力学结构。并且，在构成力学结构的过程中，再生软骨组织本身的受力情况，决定了其所构成的力学结构的力学性能的强度，因此组织工程软骨所处的力学环境是决定其力学性能强度的重要因素之一，力学环境在关节软骨的生长过程中发挥重要的调节作用^[5-7]。因此，近年来加载力学刺激的培养方法已被应用于软骨组织工程当中，目的就是用来增强软骨细胞的分化和软骨基质的生长^[8-10]。许多研究证明，在支架中的软骨细胞对力学负荷的反应与体内软骨的反应很相似^[11-14]。因此，生物反应器逐渐被用于软骨组织工程，而实验同样是通过利用新一代的生物反应器的力学加载装置来构建组织工程软骨组织，模拟仿生天然软骨的力学生长环境，以构建出更好的软骨修复移植物^[15]。

在生物医学的临床应用中，证明关节软骨修复材料的临床可用性非常重要。其中，软骨移植物的细胞外基质的力学性能，如抗压能力和抗阻能力，在软骨重塑过程中非常关键^[16-18]。而修复效果由细胞和支架，以及细胞支架复合物受到的力学刺激共同决定。因此，生物反应器在运用中的方式方法至关重要。实验通过比较对细胞-支架复合物进行不同时间的力学加载后，导致的软骨支架的力学性能、基质产生及细胞生长的差别，证明力学刺激对组织工程软骨组织构成的影响，探索适当的力学环境是否有利于组织工程软骨具有更好的仿生性，旨在为利用组织工程技术修复软骨损伤寻找更好方法。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点于2014年10月至2015年6月在解放军总医院骨科研究所完成。

1.3 材料健康2月龄的新西兰大白兔3只，体质量2.3-3.8 kg，由解放军总医院动物实验中心提供，实验方案经解放军总医院动物实验管理委员会批准。

1.4 实验方法

1.4.1 软骨细胞的分离和培养取兔膝关节软骨原代，培养软骨细胞。关节软骨组织剪碎后，PBS冲洗，用体积分数0.1%的Ⅱ型胶原酶在37 ℃培养箱中消化30 min后，离心，去沉渣，接种到装有含体积分数10%牛血清的DMEM培养瓶中，在恒温箱中孵育。

1.4.2 细胞-支架复合物制备支架的制备采用单一的纳米级关节软骨细胞外基质(articular cartilage extracellular matrix，ACECM)悬液，具体制备方法已在解放军总医院骨科研究所发表的文章中描述^[19-20]。ACECM纳米悬液的制备方法如下：取猪膝关节，用保鲜冰袋运至实验室，在超净台中常规消毒后，无菌打开膝关节腔，分别切削股骨内外侧髁、胫骨及髌骨关节的透明软骨。用无菌的PBS冲洗收集到的软骨片3次后，剪成最小块置于粉碎机内，加入适量4 ℃ PBS，充分粉碎后形成原浆。将所得原浆充分稀释后4 ℃恒温下进行差速离心(Beckman J-25离心机，美国)：低转速离心(1 500 r/min 5 min)后分离沉淀，收集上清液，然后分别以中转速(3 000 r/min 10 min及6 000 r/min 20 min)的先后顺序离心，保留上清。所得上清悬浮液继续以高转速(10 000 r/min 30 min)离心，所得沉淀即为软骨纳米微丝原液。加入体积分数3% Triton X-100和0.25%胰蛋白酶，置于摇床匀速搅拌，4 ℃恒温下脱细胞处理12 h，然后蒸馏水反复清洗；于37 ℃下加入核糖核酸酶(1 U/mL)和脱氧核糖核酸酶(50 U/mL)去除核物质；然后，用PBS及蒸馏水反复漂洗，高转速离心(10 000 r/min 30 min)后得到的沉淀即为非矿化的ACECM纳米微丝，收集至去离子水中，配制成30 g/L悬液，无菌条件下保存备用。经过脱气的ACECM悬液缓慢注入特制的聚丙烯圆筒形模具(内径：10 mm；高度：10 mm)。应用改良温度梯度的热致相分离技术(thermally induced phase separation，TIPS)使悬液固化成型，然后冷冻干燥，以产生具有均匀孔隙的取向支架^[20-21]。

将培养好的软骨细胞，分别种在无菌的软骨支架上，培养24 h后，置入生物反应器中加载培养(图1)。实验分为5组，对照组：静态培养1 d；4个实验组分别力学加载培养7，14，21，28 d，n=6。

1.4.3 细胞-支架复合物的力学加载将各组细胞-支架复合物放入Instron生物反应器的培养槽内，设定适当力学加载条件后，进行加载实验。为模拟正常生活状态，加载条件为：频率1 Hz，加载应变为1 mm，每日加载3 h。整个加载实验，生物反应器放置在37 ℃、体积分数5%CO₂的细胞培养箱内(图1)。

1.4.4 力学特性检测取各组标本，置于10 cm培养皿中心，一起黏附在生物力学机(BOSE3220)的基座。模拟正常生物体内软骨受力环境，检测各组复合物的弹性模量。将直径为5 mm的末端为平面的圆柱状压头固定于225 N的传感器上进行力学测试。以0.005 mm/s的速度压缩0.8 mm，当位移达到预设值后，以同样速度松弛到应力松弛的状态。分别记录每组的平衡载荷值P，载荷位移S，计算各组标本的弹性模量(Modules，MPa)。

1.4.5 组织学染色各组标本在加载后置于40 g/L多聚甲醛中48 h后，脱水，并用石蜡包埋。组织学染色前，石蜡切片5 μm，经脱蜡后行苏木精-伊红染色和番红“O”染色，并观察各组间细胞形态、分布及细胞外基质分泌情况。

1.4.6 蛋白聚糖含量检测各组样本加载实验后，运用蛋白聚糖含量检测试剂盒，分别检测各组样本中蛋白聚糖含量的差异。

1.4.7 实时荧光定量PCR检测各组标本加载实验后，取出标本，置于Trizol裂解液，提取全部RNA后，进行反转录反应，获得cDNA。后经RT-PCR反应，以GAPDH为内参，检测各组Ⅰ，Ⅱ型胶原表达水平。PCR反应中各引物序列见表1。各个基因mRNA表达水平用2^-^??Ct计算得到的结果表示。

1.5 主要观察指标 ①细胞-支架复合物的力学特性。②细胞-支架复合物在加载不同时间后产生的细胞外基质的差别。③细胞-支架复合物在加载不同时间后产生的Ⅰ，Ⅱ型胶原的差别。④细胞-支架复合物组织学染色结果表示的细胞外基质的分泌情况。

1.6 统计学分析计量资料x(_)±s表示，用应用SPSS 17.0统计学软件进行结果分析，各组间数据差异比较采用单因素方差分析的方法，组间数据两两比较采用t 检验，P < 0.05表示差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

生物反应器在组织工程中，主要通过施加适当的力学刺激来有助于生物生长的过程^[17^，^22]。生物反应器的这一功能，被用来刺激细胞，并促使细胞产生细胞外基质。从当前研究中发现，静态培养条件，容易导致支架中心区域只有少量细胞生长，这种不均匀的细胞分布，正是组织工程体外3D生物组织或器官效果并不理想的主要问题所在^[23]。而且，尽管细胞与支架复合时，细胞均匀分布，但经过一段时间的培养后，会发现在支架的表层分布有更多的细胞，这是由细胞坏死和细胞的趋化性造成的^[24-25]。由于缺少营养物质和代谢产物的输入和输出，坏死主要发生在支架的中心区域。因为支架在静态培养条件下，这些物质只能通过向周围扩散来交换。随着支架尺寸的增加，营养物质扩散到支架中心就更加困难，而且，随着支架表层的细胞的生长和分泌细胞外基质，液体进入支架内部的通道将被阻碍。同时，细胞的趋向性促使支架内部的细胞随着营养物质由内向外的浓度梯度而向表层生长^[25-26]。而有研究已证明，生物反应器的应用实现了细胞的均匀分布^[27]。为了提高整个支架中细胞的活性，液体流动性必须增加，而生物反应器可以用来加强支架内外的液体流动量。在提高细胞活性的同时，生物反应器的另一个重要作用是刺激细胞，利用细胞在一定的机械刺激下会有相应的生理反应的原理，生物反应器可以通过机械刺激细胞，促进细胞在更短的时间产生更多的细胞外基质^{[15, 28-29]}，同时还可以保证细胞的均匀分布。而细胞外基质的增加，有利于提高组织的力学强度^[30]。

生物反应器的应用在细胞的分化中起很重要的作用，可以通过对细胞加载机械刺激而使干细胞沿着特定的分化路径而生长为所需细胞表型，通过生物化学和物理学的调控信号而介导细胞的分化^[12^，^31-32]。

软骨是一种无血管的组织，营养物质和代谢产物的运输完全通过软骨基质之间的扩散而进行。当软骨发生小的损伤时，可以被同部位的软骨组织再生来修复；但是当软骨遭受严重损伤后，机体无法修复损伤软骨^[33]。而近些年的软骨组织工程的不断发展，为大面积软骨损伤的修复带来了希望，通过组织工程技术，培养的细胞-支架复合物，可以用来作为软骨移植物修复损伤软骨。但是，如前所述，静态培养的组织工程软骨移植物尚存在很多不足之处。

实验主要通过生物反应器在组织工程软骨支架的制备过程中的运用，证明适当的力学刺激更有利于制备出更仿生的软骨支架。通过对软骨细胞-支架复合物加载一定参数的力学刺激，使软骨细胞产生更多的细胞外基质，有利于软骨内环境的建立，更有利于构建天然的软骨细胞生长环境，并通过支架的铰链，更有助于增加软骨支架的弹性模量，提高其力学性能。同时，使Ⅱ型胶原表达水平更高，而Ⅱ型胶原是天然软骨组织中的主要组成成分，通过胶原之间的相互铰链，更有利于构建软骨的负载结构，使软骨的受力更强，这样更加提高了人工软骨支架的仿生性，使得在动态培养状态制备的软骨支架优于静态制备的软骨支架。结果表明，通过生物反应器的力学刺激，细胞-支架复合物的细胞分布均匀，细胞活性得到很大提高，并且分泌更多的细胞外基质，通过生物反应器的动态力学刺激，使得培养液在细胞-支架复合物中得到更大的流动性，得以运输更多的营养物质到支架中心，并带走更多的代谢废物，避免了细胞的表层生长分布不均的现象，使细胞-支架复合物力学性能更强，能承受更大的力学载荷，更加仿生天然软骨的结构和功能特性。

综上所述，生物反应器在组织工程研究中的应用，可以显著提高组织工程3D组织移植物的细胞活性和仿生性，从而可以大大提高组织工程修复的效果，有助于损伤组织的再生修复及功能的恢复，为再生医学提供更好的方法。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

生物反应器中的力学刺激促进组织工程软骨再生

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[2]	李嘉程, 梁学振, 刘金豹, 许波, 李刚. 骨性关节炎mRNA差异表达谱及竞争性内源RNA调控的网络分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1212-1217.
[3]	耿秋东, 葛海雅, 王和鸣, 李楠. 基于网络药理学探讨龟鹿二仙胶治疗骨关节炎的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1229-1236.
[4]	刘翔翔, 黄云梅, 陈文列, 林如辉, 卢小冬, 李钻芳, 许亚晔, 黄美雅, 李西海. 早期骨关节炎模型大鼠半月板白区细胞的超微结构变化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1237-1242.
[5]	何祥忠, 陈海云, 刘军, 吕阳, 潘建科, 杨文斌, 何静雯, 黄俊翰. 富血小板血浆联合微骨折对比微骨折治疗膝关节软骨病变的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(6): 964-969.
[6]	刘欣, 颜飞华, 洪坤豪. 调控水通道蛋白表达延缓膝骨关节炎模型大鼠软骨退变[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 668-673.
[7]	马泽涛, 曾晖, 王德利, 翁鉴, 冯松. 微小RNA-138-5p与软骨细胞增殖和自噬的关系[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 674-678.
[8]	谢崇新, 张磊. 保留与不保留残端重建前交叉韧带术后膝关节退变的比较[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 735-740.
[9]	邓桢翰, 黄勇, 肖璐璐, 陈昱霖, 朱伟民, 陆伟, 王大平. 骨形态发生蛋白在关节软骨再生过程中的作用与应用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 798-806.
[10]	常文辽, 赵杰, 孙晓亮, 王锟, 吴国锋, 周剑, 李树祥, 孙晗. 人工骨膜的材料选择、理论设计及生物仿生功能[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 600-606.
[11]	王晓非, 滕学仁, 丛琳岩, 周旭, 马振华. Herbert螺钉内固定治疗成年人膝关节剥脱性骨软骨炎[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(3): 397-402.
[12]	陈磊, 郑蕊, 杰永生, 綦惠, 孙磊, 舒雄. 脂肪血管基质成分复合骨软骨一体化支架的体外评价[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3487-3492.
[13]	田广招, 杨振, 查康康, 孙志强, 李旭, 眭翔, 黄靖香, 郭全义, 刘舒云. 脱细胞软骨基质对巨噬细胞极化的调控[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3545-3550.
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[15]	潘璇, 赵萌, 张秀梅, 赵杰, 翟运开. 生物3D打印技术在精准医学领域研究应用现状的中英文文献分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(21): 3382-3389.