低强度脉冲超声干预膝关节炎模型兔软骨细胞Ⅱ型胶原和基质金属蛋白酶13的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.18.002

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

低强度脉冲超声：是指利用输出强度小于0.1 W/cm²的脉冲超声作用于人体病变部位，影响细胞的物质代谢过程，加速代谢产物的排出，改善细胞缺血、缺氧状态，改善组织的营养，提高细胞组织的再生能力，从而达到治疗疾病的目的。

膝关节炎：是一种以退行性病理改变为基础的疾患。多患于中老年人群，其症状多表现为膝盖红肿痛、上下楼梯痛、坐起立行时膝部酸痛不适等。也会有患者表现肿胀、弹响、积液等，如不及时治疗，则会引起关节畸形，残废。在膝关节部位还常患有膝关节滑膜炎、韧带损伤、半月板损伤、膝关节游离体、腘窝囊肿、髌骨软化、鹅足滑囊炎、膝内/外翻等关节疾病。

背景：低强度脉冲超声安全无创、穿透性强，近年来，越来越多的研究表明，低强度脉冲超声在促进损伤关节软骨修复方面具有重要的作用。

目的：观察低强度脉冲超声对膝关节炎模型兔软骨细胞Ⅱ型胶原和基质金属蛋白酶13表达的影响。

方法：纳入20只新西兰白兔，均建立膝关节炎模型，建模后随机分为对照组和实验组，每组10只。实验组动物右侧膝关节利用超声波骨折愈合仪进行低强度脉冲超声治疗，对照组动物予以右侧膝关节假低强度脉冲超声治疗。干预后8 周，取胫骨内侧端以及膝关节股骨内侧端软骨组织，经常规处理后，进行甲苯胺蓝染色，并置于显微镜下进行病理学观察，利用 qRT-PCR法软骨细胞基质金属蛋白酶13 和Ⅱ型胶原表达量检测。观察实验动物一般情况和关节软骨病理形态，以及基质金属蛋白酶13、Ⅱ型胶原的 qRT-PCR检测结果。

结果与结论：①甲苯胺蓝染色和病理学观察：治疗 8 周后，对照组关节软骨出现明显的裂隙，并从表面延伸至深层，且存在严重的染色缺失现象；实验组可观察到关节软骨表面形成裂隙，存在中度染色缺失现象；②qRT-PCR检测：软骨细胞培养5，10 d后，实验组和对照组相同时间点基质金属蛋白酶13和Ⅱ型胶原基因表达差异均有显著性意义(P < 0.05)；③结果证实：低强度脉冲超声可调节膝关节炎模型兔软骨细胞Ⅱ型胶原和基质金属蛋白酶13基因的表达。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程
ORCID: 0000-0002-5647-1173(吴建萍)

关键词: 实验动物, 骨软骨损伤与修复动物模型, 低强度脉冲超声, 膝关节炎, 动物模型, 软骨细胞, Ⅱ型胶原, 基质金属蛋白酶13, 基因

Abstract:

BACKGROUND: Low intensity pulsed ultrasound is safe, non-invasive, and has strong penetration. In recent years, more and more studies have indicated that low intensity pulsed ultrasound has important role in promoting the repair of damaged articular cartilage.

OBJECTIVE: To investigate the effect of low intensity pulsed ultrasound on the expression of type II collagen and matrix metalloproteinase 13 in articular cartilage of rabbits of knee arthritis.

METHODS: A total of 20 New Zealand white rabbits were included in this study to establish knee arthritis model. All models were randomly divided into control group and experimental group, 10 rats in each group. In the experimental group, the right knee joint received low intensity pulsed ultrasound treatment with an ultrasonic fracture healing instrument. In the control group, right knee joint received false low intensity pulsed ultrasound therapy. At 8 weeks after intervention, cartilage tissue was collected from medial end of tibia and medial end of femur. After conventional treatment, toluidine blue staining was performed. Pathological observation was conducted under a microscope. Quantitative real-time polymerase chain reaction was used to detect matrix metalloproteinase 13 and type II collagen expression in chondrocytes. The general situation of the experimental animals was observed. The results of articular cartilage and the quantitative real-time polymerase chain reaction results of matrix metalloproteinase-13 and type II collagen were observed under a microscope.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) Toluidine blue staining and pathological observation: 8 weeks after treatment, obvious fissure appeared in articular cartilages, and extending from the surface to the deep layer in the control group, and there was a lack of staining. In the experimental group, cracks formed on articular cartilage surface, and there was a moderate staining missing. (2) Quantitative real-time polymerase chain reaction: at 5 and 10 days after culture, significant differences in gene expression of matrix metalloproteinase-13 and type II collagen were detected at various time points in the experimental and control groups (P < 0.05). (3) The results showed that the low intensity pulsed ultrasound could affect the gene expression of matrix metalloproteinase-13 and type II collagen in the rabbit model of knee arthritis.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

Key words: Tissue Engineering, Models, Animal, Knee Arthritis

吴建萍，王志刚，王黎明. 低强度脉冲超声干预膝关节炎模型兔软骨细胞Ⅱ型胶原和基质金属蛋白酶13的表达[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(18): 2596-2602.

Wu Jian-ping, Wang Zhi-gang, Wang Li-ming. Effects of low intensity pulsed ultrasound on the expression of type II collagen and matrix metalloproteinase-13 in chondrocytes of a rabbit model of knee arthritis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(18): 2596-2602.

图/表（结果） 3

2.1 造模成功动物数量及过程入组的20只动物均顺利完成实验，未出现脱落。造模流程图见图1。

2.2 模型创新性实验通过建立动物模型，对人体情况予以模拟，通过对相关结果的分析，更好的了解地强度脉冲超声的临床治疗效果。

2.3 模型稳定性此模型稳定性、持久性来年更好，制作程序标准、规范，复制出更接近于人类膝关节炎的情况。

2.4 实验兔一般情况建模前后，两组兔均饮食正常，尿便无显著差异。建模后，动物出现右下肢跛行、弹腿等情况，但2周后逐渐消失。

2.5 兔关节软骨病理学改变两组兔低强度脉冲超声治疗8周之后，经甲苯胺蓝染色和病理学观察，在40倍光学显微镜下，可见对照组关节软骨出现明显的裂隙，并从表面延伸至深层，且存在严重的染色缺失现象；实验组可观察到关节软骨表面形成裂隙，存在中度染色缺失现象；置于100倍光学显微镜下进行观察，对照组可以观察到呈紊乱排列的细胞，每层均可观察到软骨细胞减少以及簇集情况；实验组可以观察到软骨细胞呈轻度异常排列，且可观察到浅层细胞的出现减少以及簇集现象，见图2。

2.6 低强度脉冲超声对膝关节炎模型兔软骨细胞Ⅱ型胶原和基质金属蛋白酶13基因表达的影响软骨细胞培养5，10 d后，实验组基质金属蛋白酶13基因表达均显著低于同时期对照组(P < 0.05)，Ⅱ型胶原基因表达显著高于同时期对照组(P < 0.05)。具体结果见表1。

2.7 不良反应分析所有动物均未出现切口感染、化脓和红肿等不良反应。

参考文献

[1] 柳学勇,冉春风,刘盼,等.低强度聚焦超声与普通超声治疗创伤性膝关节炎的疗效比较[J].中华物理医学与康复杂志,2011,33(12):927-929.

[2] 夏鹏,李雪萍,林强,等.低强度脉冲超声对兔膝骨性关节炎软骨细胞整合素-局部粘着斑激酶-促分裂原活化蛋白激酶力化学转导通路相关蛋白表达的影响[J].中华物理医学与康复杂志,2014,36(3):165-170.

[3] 徐守宇,张丽梅,姚新苗,等.低强度脉冲超声对兔膝骨关节炎软骨细胞外基质的影响及机制[J].中国骨伤,2014, 27(9): 766-771.

[4] 任莎莎,李雪萍,林强,等.低强度脉冲超声经PI3K/Akt通路调控兔膝骨性关节炎软骨细胞凋亡的作用机制研究[J].中国康复,2015,30(2):83-87.

[5] 张雁军,柴利军,杜林海,等.玻璃酸钠联合低强度脉冲超声治疗膝骨性关节炎的临床疗效观察[J].临床合理用药杂志,2014,(31):77-78.

[6] 潘晓华,何爽,谢小青,等.玻璃酸钠与超声导入Fastum凝胶联合治疗膝骨性关节炎合并滑膜炎[J].中国康复,2007, 22(2):110-111.

[7] 张雁军,柴利军,杜林海,等.玻璃酸钠联合低强度脉冲超声治疗骨性关节炎疗效观察[J].临床合理用药杂志, 2014, 7(12A):28-29.

[8] 周崑,周伟,贾小林,等.超声对实验性早期兔膝关节骨关节炎的作用[J].重庆医科大学学报,2008,33(1): 6-17.

[9] 李涛.低强度脉冲超声、关节腔内注射玻璃酸钠及其两者联合治疗轻中度膝骨性关节炎的短期疗效分析[D].重庆:重庆医科大学,2013.

[10] 王小红.低强度脉冲超声对实验性兔骨性关节炎软骨损伤修复的影响[D].武汉:华中科技大学,2009.

[11] 成吉华,赵丹,郭杨,等.低强度脉冲超声治疗骨关节炎的应用进展[J].临床超声医学杂志,2014,16(7):475-477.

[12] Buchbender C, Sewerin P, Mattes-György K, et al. Utility of combined high-resolution bone SPECT and MRI for the identification of rheumatoid arthritis patients with high-risk for erosive progression. Eur J Radiol. 2013;82(2):374-379.

[13] 王小红,王洪,杨述华,等.低强度脉冲式超声对实验性兔骨关节炎软骨损伤修复的影响[J].国际骨科学杂志,2009, 30(3):191-193.

[14] Hwang SR, Seo DH, Al-Hilal TA, et al. Orally active desulfated low molecular weight heparin and deoxycholic acid conjugate, 6ODS-LHbD, suppresses neovascularization and bone destruction in arthritis. J Control Release. 2012;163(3):374-384.

[15] 李涛.低强度脉冲超声治疗膝骨性关节炎的研究进展[J].国际检验医学杂志,2013,34(15):2000-2003.

[16] 颜益红.超声波和运动疗法对兔膝骨关节炎软骨细胞凋亡BCL-2和MMP-13的影响[J].长沙:中南大学,2012.

[17] Korstjens CM, vail der Rijt RH, Alhers GH, et al. Low-intensity pulsed ultrasound affects human articular chondrocytes in vitro. Med Biol Eng Comput. 2008;46(12):1263-1270.

[18] Irrechukwu ON,Lin PC,Fritton K,et a1.Magnetic resonance studies of macromolecular content in engineered cartilage treated with low-intensity pulsedultrasound. Tissue Eng Part A. 2011;17(3-4): 407-415.

[19] 张丽梅,徐守宇.超声波对关节软骨影响的实验研究进展[J].风湿病与关节炎,2013,2(1):60-63.

[20] 马勇,郭杨,屠娟,等.低强度脉冲超声介导威灵仙干预兔膝关节软骨细胞增殖及Ⅱ型胶原和转化生长因子β1的表达[J].中国组织工程研究,2014,(38):6110-6115.

[21] 贾小林,陈文直,周伟,等.低强度脉冲超声对关节软骨缺损修复影响的初步观察[J].中国超声医学杂志, 2003, 19(12): 889-891.

[22] 郭杨,马勇,董睿,等.低强度脉冲超声对兔关节软骨细胞增殖及Ⅱ型胶原表达的影响[J].安徽医科大学学报, 2014, 49(12): 1739-1742.

[23] 周嘉辉,吕红斌,胡建中,等.兔胫骨骨延长模型在低强度脉冲超声刺激条件下的骨再生与成熟[J].中国组织工程研究与临床康复,2010,14(7):1141-1145.

[24] 贾小林,陈文直,孙保勇,等.低强度脉冲超声对兔关节软骨损伤修复的影响[J].中华物理医学与康复杂志, 2009, 31(5):305-307.

[25] 肖惟雄,班兆阳,朱智敏,等.低强度脉冲超声在骨治疗中的生物学机制[J].国际口腔医学杂志,2013,40(4):557-560.

[26] 钟守昌,黄丽霞,李长雷,等.低强度脉冲超声和低频电磁场联合治疗兔桡骨骨折中外骨痂和骨折线的影像评价[J].江汉大学学报(自然科学版),2014,(5):53-57.

[27] 王小红,王洪,杨述华,等.低强度脉冲式超声对实验性兔骨关节炎软骨损伤修复的影响[J].国际骨科学杂志,2009, 30(3):191-193.

[28] Naito K, Watari T, Muta T, et al. Low-intensity pulsed ultrasound (LIPUS) increases the articular cartilage type II eoBagen in a rat osteoarthritis model. J Orhop Res. 2010;28(3):361-369.

[29] Li X, Li J, Cheng K, et al. Effect oflow-intensity pulsed ultrasound on MMP-13 and MAPKs signaling pathway in rabbit knee osteoarthritis. Cell Biochem Biophys. 2011;61(2):427-434.

[30] Koga T, Lee SY, Niikura T, et al. Effect of low-intensity pulsed ultrasound on bone morphogenetic protein 7-induced osteogenic differentiation of human nonunion tissue-derived cells in vitro. J Ultrasound Med. 2013;32(6):915-922.

[31] Ito A, Aoyama T, Yamaguchi S, et al. Low-Intensity Pulsed Ultrasound Inhibits Messenger RNA Expression of Matrix Metalloproteinase-13 Induced by Interleukin-1β in Chondrocytes in an Intensity-Dependent Manner. Ultrasound Med Biol. 2012;38(10):1726-1733.

[32] Lv YG, Zhao PC, Chen GB, et al. Effects of low-intensity pulsed ultrasound on cell viability, proliferation and neural differentiation of induced pluripotent stem cells-derived neural crest stem cells. Biotechnol Lett. 2013;35(12):2201-2212.

[33] 高明霞,程凯,林强,等.低强度脉冲超声波对早中期兔膝骨性关节炎软骨细胞外基质及MAPKs信号通路的影响[J].中国康复医学杂志,2013,28(7):593-599.

[34] Cheng K, Xia P, Lin Q, et al. Effects of low-intensity pulsed ultrasound on integrin-FAK-PI3K/Akt mechanochemical transduction in rabbit osteoarthritis chondrocytes. Ultrasound Med Biol. 2014;40(7): 1609-1618.

[35] Hu J, Qu J, Xu D, et al. Combined application of low-intensity pulsed ultrasound and functional electrical stimulation accelerates bone-tendon junction healing in a rabbit model. J Orthop Res. 2014;32(2): 204-209.

[36] 柯丹,刁庆春,李发琪,等.低强度脉冲超声对人皮肤成纤维细胞增殖及胶原蛋白合成的影响[J].中华物理医学与康复杂志,2008,30(1):17-20.

[37] Yang Z, Ren L, Deng F, et al. Low-intensity pulsed ultrasound induces osteogenic differentiation of human periodontal ligament cells through activation of bone morphogenetic protein-smad signaling. J Ultrasound Med. 2014;33(5):865-873.

[38] 李雪萍,励建安.低强度脉冲超声波促进骨性关节炎软骨修复的研究进展[J].中国康复医学杂志,2010,25(12): 1204-1207.

[39] 夏鹏.低强度脉冲超声波经整合素-FAK-MAPK力化学传导通路对兔膝骨性关节炎关节软骨细胞的作用研究[D].南京:南京医科大学,2014.

[40] 周崑,周伟,陈文直,等.低强度脉冲超声对美蓝渗入正常兔膝关节软骨的作用[J].重庆医科大学学报,2012,37(2): 121-124.

[41] Zieba J, Forlenza KN, Khatra JS, et al. TGFβ and BMP Dependent Cell Fate Changes Due to Loss of Filamin B Produces Disc Degeneration and Progressive Vertebral Fusions. PLoS Genet. 2016;12(3):e1005936.

[42] Zhuang C, Xu NW, Gao GM, et al. Polysaccharide from Angelica sinensis protects chondrocytes from H2O2-induced apoptosis through its antioxidant effects in vitro. Int J Biol Macromol. 2016;87:322-328.

[43] Ding L, Wu J, Li D, Wang H, et al. Effects of CCN3 on rat cartilage endplate chondrocytes cultured under serum deprivation in vitro. Mol Med Rep. 2016;13(3): 2017-2022.

[44] Yun S, Ku SK, Kwon YS. Adipose-derived mesenchymal stem cells and platelet-rich plasma synergistically ameliorate the surgical-induced osteoarthritis in Beagle dogs. J Orthop Surg Res. 2016;11(1):9.

[45] Hemphill DD, McIlwraith CW, Slayden RA, et al. Adeno-associated virus gene therapy vector scAAVIGF-I for transduction of equine articular chondrocytes and RNA-seq analysis. Osteoarthritis Cartilage. 2015.

[46] Lu H, Zeng C, Chen M, et al. Lentiviral vector-mediated over-expression of Sox9 protected chondrocytes from IL-1β induced degeneration and apoptosis. Int J Clin Exp Pathol. 2015 .

[47] Kudelko M, Chan CW, Sharma R, et al. Label-Free Quantitative Proteomics Reveals Survival Mechanisms Developed by Hypertrophic Chondrocytes under ER Stress. J Proteome Res. 2016;15(1):86-99.

[48] Khazaeel K, Mazaheri Y, Hashemi Tabar M, et al. Effect of Enrofloxacin on Histochemistry, Immunohistochemistry and Molecular Changes in Lamb Articular Cartilage. Acta Med Iran. 2015;53(9): 555-561.

[49] Kimura M, Ichimura S, Sasaki K, et al. Endoplasmic reticulum stress-mediated apoptosis contributes to a skeletal dysplasia resembling platyspondylic lethal skeletal dysplasia, Torrance type, in a novel Col2a1 mutant mouse line. Biochem Biophys Res Commun. 2015;468(1-2):86-91.

[50] Che X, Chi L, Park CY, et al. A novel method to detect articular chondrocyte death during early stages of osteoarthritis using a non-invasive ApoPep-1 probe. Arthritis Res Ther. 2015;17:309.

[51] Correia SI, Silva-Correia J, Pereira H, et al. Posterior talar process as a suitable cell source for treatment of cartilage and osteochondral defects of the talus. J Tissue Eng Regen Med. 2015.

[52] Lin P, Weng X, Liu F, et al. Bushen Zhuangjin decoction inhibits TM-induced chondrocyte apoptosis mediated by endoplasmic reticulum stress. Int J Mol Med. 2015;36(6):1519-1528.

Jia L, Chen J, Wang Y, et al. Focused Low-intensity Pulsed Ultrasound Affects Extracellular Matrix Degradation via Decreasing Chondrocyte Apoptosis and Inflammatory Mediators in a Surgically Induced Osteoarthritic Rabbit Model. Ultrasound Med Biol. 2016;42(1):208-219.

引言

材料方法

1.1 造模动物成年新西兰白兔20只，雌雄不限，体质量(1.0±0.1) kg，由北京大学医学部实验动物科学部提供，许可证号：SYXK(京)2011-0039，健康状况良好。此次实验相关内容和方法均经本院伦理部门审核并批准，实验设计方案、使用动物品种品系规格、处死动物的方法、项目进行中设计动物福利和伦理问题等均符合要求。

1.2 造模方法入组的20只新西兰白兔均建立膝关节炎模型^[6]，经耳缘静脉注射1 mL/kg戊巴比妥钠溶液进行麻醉，待达到理想麻醉效果之后，常规消毒铺巾，于动物靠近膝关节内侧面做切口，将关节腔打开，向后向外翻髌骨，使膝关节保持最大屈曲状态。关节腔暴露之后，利用眼科剪刀对内侧半月板予以分离，并切除内侧半月板，同时将前交叉韧带剪断。妥善保护软骨，并对关节进行生理盐水冲洗。对关节囊和皮肤进行缝合，伤口用碘伏棉球进行擦洗，并敷贴注射用敷贴。

建模后将20只兔随机分为对照组和实验组，每组10只。术前禁食水，术后连续3 d肌注青霉素以抗感染，并对动物进行常规喂养。

1.3 造模成功的检测标准通过摄取X射线膝关节正位侧位片，可观察到存在关节间隙改变及膝关节周围骨赘产生即视为造模成功。

1.4 低强度脉冲超声干预建模2周后，对实验组动物右侧膝关节利用超声波骨折愈合仪进行低强度脉冲超声治疗，探头固定放置，最大输出空间平均声功率 50×(1.0±0.1) mW/cm²，工作频率为(800±40) kHz， 20 min次，1次/d；对照组动物予以右侧膝关节假低强度脉冲超声治疗(即采取与实验组相同的操作，但探头并无能量输出)。

1.5 标本获取干预后8周，麻醉后再行空气栓塞法处死两组动物。处死后迅速将动物皮肤切开，打开关节腔，对膝关节情况进行观察，了解是否出现关节积液以及滑膜肿胀现象，并观察关节软骨变化情况。

利用手术刀离断动物右侧膝关节，取出胫骨内侧端以及膝关节股骨内侧端软骨组织，并置于冰块中进行保存备用。

1.6 病理学观察取两组软骨标本，置入中性甲醛溶液，经EDTA 3周缓慢脱钙之后，常规予以乙醇和二甲苯处理后，并利用石蜡进行包埋，常规切片，切片厚度4 μm。予以体积分数0.05%甲苯胺蓝染色，并置于光学显微镜下进行病理学观察。所有切片均同一批完成，以控制操作中的差别。

1.7 qRT-PCR法软骨细胞基质金属蛋白酶13 和Ⅱ型胶原表达量检测于无菌条件下，利用手术刀片取软骨组织表面软骨，置于含有PBS的无菌培养皿中进行反复冲洗，并剪为碎片，添加体积分数0.25%胰蛋白酶进行消化，并添加体积分数0.25%Ⅱ型胶原酶，置于恒温箱中进行消化。待软骨组织完全消化之后，终止消化，常规离心，弃上清液，PBS缓慢冲洗之后，加入体积分数10%的胎牛血清的完全高糖DMEM培养基进行吹打，并种植在培养瓶中，置于恒温培养箱中进行培养。对细胞进行传代培养，将第2代软骨细胞接种在培养瓶中。

培养第10天收集细胞，进行全 RNA 提取。并进行RT反应、Real-time PCR反应以及SYBR Green RT-PCR实验。具体步骤：95 ℃变性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸30 s，反复进行40个循环；Real-time PCR 正式实验反应程序模式图：95 ℃变性30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸30 s，反复进行40个循环，得出荧光定量数据并进行整理分析，计算软骨细胞基质金属蛋白酶13和Ⅱ型胶原相对表达量(2^-^??^Ct)。

引物序列：
cDNA	引物链	引物序列(5’-3’)	片段长度(bp)
基质金属蛋白酶13	正义反义	TGC CCT TAT TTT ATG TTT C TTC CGC TTC CTA GTC AGT T	106
Ⅱ型胶原酶	正义反义	AGC ACG TGT GGT TTG GGG A CGT TGG CAG TGT TGG GAG G	84
GAPDH	正义反义	GCA GAA GGA GAT CAC AGC CCT GCT GAT CCA CAT CTG CTG GAA	136

1.8 不良反应评价标准观察各兔造模侧膝关节有无红肿、感染、化脓和活动障碍等症状。

1.9 主要观察指标 ①实验动物一般情况。②关节软骨病理学镜下观察结果。③基质金属蛋白酶13、Ⅱ型胶原的qRT-PCR检测结果。

1.10 统计学分析采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析。计量资料用x(_)±s表示，组间数据差异的比较采用t 检验及单因素方差分析法，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

低强度脉冲超声是一种物理治疗方法，可以发挥出一定的空化效应、机械效应以及热效应^[7]。在治疗过程中，利用输出强度在0.1 W/cm²以下的脉冲超声对特定的病变部位予以作用，对局部细胞物质代谢产生影响，以促进各种代谢产物的排出^[8-9]。从而达到改善细胞缺氧、缺血状态以及组织营养状态的目的，提高细胞组织再生能力，最终达到治疗疾病的目的^[10]。

利用低强度脉冲超声对骨关节炎患者进行治疗的过程中，可对患者的软骨细胞产生一定的影响^[11]。在关节软骨中，所包含的成分主要是软骨细胞和基质。在骨关节炎发病过程中，关节软骨会出现退行性改变，导致软骨细胞凋亡率出现显著上升的情况^[12-15]。

以往有学者通过研究报道，利用低强度脉冲超声对骨关节炎患者进行治疗，可以对软骨细胞的增殖产生积极的促进作用，并有效降低软骨细胞凋亡率^[16]。Korstjens等^[17]从骨关节炎患者的关节软骨中获得软骨细胞，并进行实验，最终的研究结果显示，软骨细胞数目出现显著增加的情况。即提示体外环境下，利用低强度脉冲超声对软骨细胞进行刺激，可以对其增殖产生积极的促进作用。Irrechukwu等^[18]建立工程化软骨，利用低强度脉冲超声进行5周的处理，并通过 MRI测量方式对其生长状况予以观察。最终的实验结果显示，低强度脉冲超声可以对工程化软骨的生长产生积极的促进作用。

实验结果显示，两组动物低强度脉冲超声治疗8周之后，经甲苯胺蓝染色和病理学观察，在40倍光学显微镜下，可见对照组关节软骨出现明显的裂隙，并从表面延伸至深层，且存在严重的染色缺失现象；实验组可观察到关节软骨表面形成裂隙，存在中度染色缺失现象；置于100倍光学显微镜下进行观察，对照组可以观察到呈紊乱排列的细胞，每层均可观察到软骨细胞减少以及簇集情况；实验组可以观察到软骨细胞呈轻度异常排列，且可观察到浅层细胞的出现减少以及簇集现象，即表明低强度脉冲超声治疗会对软骨细胞产生一定的影响。另外，低强度脉冲超声治疗还会对关节软骨基质产生一定的影响^[19]。

在关节软骨基质中，Ⅱ型胶原蛋白约占胶原总量的90%，是主要的结构成分。在关节软骨内，胶原纤维会形成纤维网状结构，具有很强的耐磨能力，可以发挥出抵抗压力负荷的效果^[20]。受到骨关节炎的影响，Ⅱ型胶原在降解方面会出现异常增加的情况，从而导致从软骨表层的细胞周围开始，逐渐发展到深层和远处^[21-23]。

因此，在骨关节炎发病的过程中，Ⅱ型胶原质和量的变化是一个十分重要的环节^[24-26]。王小红等^[27]建立兔骨关节炎模型，并对动物进行低强度脉冲超声治疗。在治疗后2，4，8周进行观察发现，较之对照组不同时间点，经低强度脉冲超声治疗的实验组的软骨损伤程度均明显减轻。Naito等^[28]也通过研究报道，通过低强度脉冲超声治疗，可显著促进大鼠关节软骨中Ⅱ型胶原蛋白的合成。分析其作用机制，可能是因为低强度脉冲超声会对软胶原相关mRNA表达予以有效的激活，从而达到保护软骨的效果。

有学者通过研究发现，对骨关节炎动物进行低强度脉冲超声治疗后，在软骨中会出现基质金属蛋白酶13表达量下降的情况，Ⅱ型胶原的降解速度也会出现下降，可能是因为ERK1/2以及p38信号传导通路受到不同程度的抑制所导致的^[29]。软骨细胞合成的基质金属蛋白酶也会参与到骨关节炎的病程发展过程中，并参与到骨关节炎软骨基质的降解过程^[30-35]，在正常组织中，高活性的胶原酶基质金属蛋白酶13不会发生表达，但在骨关节炎软骨细胞，高活性的胶原酶基质金属蛋白酶13会呈现出高度表达情况，并加速胶原的降解^[36-39]。一旦胶原遭到破坏，软骨细胞便会丧失胶原蛋白网的保护，导致其凋亡率进一步上升^[40-53]。

实验结果还显示，软骨细胞培养5，10 d后，与0 d进行比较，两组基质金属蛋白酶13 基因表达量均出现显著上升的情况，但与同时期对照组进行比较，实验组均显著低于对照组。软骨细胞培养5，10 d后，与0 d进行比较，观察组Ⅱ型胶原基因表达量均出现显著上升的情况，但与同时期对照组进行比较，实验组均显著高于对照组。实验结果表明，低强度脉冲超声会对膝关节炎模型兔软骨细胞Ⅱ型胶原和基质金属蛋白酶13基因表达产生一定的影响，有效促进Ⅱ型胶原基因的表达，并降低基质金属蛋白酶13基因表达，以达到修复软骨损伤的效果。

综上所述，作为一种无创的治疗方法，利用低强度脉冲超声对骨关节炎进行干预可以促进软骨细胞和Ⅱ型胶原等产生一定的影响，达到修复损伤的效果，具有一定的研究价值。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程