培哚普利对维甲酸所致骨质疏松模型大鼠骨代谢的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.18.001

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：

骨代谢：是一个由骨形成和骨吸收构成的动态平衡过程，一旦这种平衡被打破，破骨作用大于成骨作用，就会导致骨质疏松。骨代谢生化指标可及时反映骨转换状态，灵敏度高、特异性强，在骨质疏松发病机制、骨质疏松药物的研究及流行病学研究方面具有重要临床意义。

维甲酸：具有广泛的生物学活性，但具有致骨质疏松的不良反应，用药过程中多引发骨痛，有文献报道，维甲酸可促进成骨细胞的增殖和分化，又可增加破骨细胞的骨吸收，造成高转化型的骨质疏松。维甲酸法诱导的雌性大鼠骨质疏松模型在发病症状、组织形态学以及对雌激素的骨反应与人类有较大相似性，由于操作简单、时间短、成功率高等优势，被许多研究者选为制造动物骨质疏松模型的常用方法。

背景：骨组织中存在肾素-血管紧张素-醛固酮系统组分，近年来对抗高血压药物的研究，发现血管紧张素转换酶抑制剂类降压药对骨质疏松可能也有效，培哚普利是常用的此类降压药之一，其对骨代谢有什么影响及能否用于抗骨质疏松，未见文献报道。

目的：观察培哚普利对维甲酸溶液致骨质疏松模型大鼠骨代谢的影响。

方法：将50只SD大鼠随机分5组，每组10只。模型组及各培哚普利剂量组大鼠予维甲酸溶液80 mg/(kg•d)灌胃，造模成功后培哚普利2，4，8 mg/(kg•d)组分别给予相应剂量培哚普利灌胃干预，1次/d，连续42 d；正常对照组及模型组均灌予等容积蒸馏水。检测各组大鼠血清钙、磷、碱性磷酸酶以及骨质量、骨密度，并分别测定骨组织中骨特异性碱性磷酸酶及抗酒石酸酸性磷酸酶mRNA的表达量。

结果与结论：与模型组比较，经培哚普利治疗后，维甲酸所致骨质疏松大鼠血清钙、磷水平升高，碱性磷酸酶活性显著降低，骨质量和骨密度显著升高。培哚普利8 mg/(kg•d)组骨特异性碱性磷酸酶mRNA相对表达量要高于培哚普利2，4 mg/(kg•d)组及模型组；培哚普利8 mg/(kg•d)组抗酒石酸酸性磷酸酶mRNA相对表达量高于模型组。提示培哚普利能改善骨质疏松大鼠部分骨代谢生化指标，并通过上调骨特异性碱性磷酸酶mRNA的表达促进骨形成，对维甲酸所致的骨质疏松有一定的防治作用。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程
ORCID: 0000-0001-5626-648X(钟奕)

关键词: 实验动物, 骨软骨损伤与修复动物模型, 维甲酸, 骨质疏松模型, 培哚普利, 钙, 磷, 碱性磷酸酶, 骨质量, 骨密度, 骨特异性碱性磷酸酶, 抗酒石酸酸性磷酸酶, 大鼠

Abstract:

BACKGROUND: Renin-angiotensin-aldosterone system existed in bone tissue. Recent studies on antihypertensive drugs found that angiotensin converting enzyme inhibitor type antihypertensive drug was possibly effective for osteoporosis. Perindopril is one of the commonly used antihypertensive drugs. Whether perindopril affected bone metabolism or could be used in anti-osteoporosis has not been reported.

OBJECTIVE: To observe effects of perindopril on bone metabolism in a rat model of osteoporosis induced by retinoic acid.

METHODS: Fifty Sprague-Dawley rats were randomly divided into five groups, with ten in each group. In the model group and each perindopril groups, rats were intragastricaly administered retinoic acid solution 80 mg/kg per day. After successful model establishment, rats in different perindopril groups were intragastrically administered perindopril 2, 4 and 8 mg/kg per day, once a day, for 42 consecutive days. In the normal control and model groups, rats were given an equal volume of distilled water. Serum calcium, phosphorus, alkaline phosphatase, bone mass and bone mineral density were detected in each group. Expression of bone specific alkaline phosphatase and tartrate-resistant acid phosphatase mRNA in bone tissue was determined.

RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the model group, after treatment with perindopril, serum calcium and phosphorus levels were increased, alkaline phosphatase activities were significantly decreased, bone mass and bone mineral density were obviously increased in rats with retinoic acid-induced osteoporosis. Expression of bone specific alkaline phosphatase mRNA was higher in the perindopril 8 mg/kg group than in the perindopril 2 and 4 mg/kg groups and model group. Tartrate-resistant acid phosphatase mRNA expression was higher in the perindopril 8 mg/kg group than in the model group. These results indicated that perindopril could improve partial bone metabolic biochemical markers in osteoporosis rats, promoted bone formation by up-regulating bone specific alkaline phosphatase mRNA expression, and had a certain preventive effect on retinoic acid-induced osteoporosis.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

Key words: Models, Animal, Perindopril, Osteoporosis, Metabolism, Bone Density, Tissue Engineering

钟奕，薛青，周奕，陈亮华，张礼超. 培哚普利对维甲酸所致骨质疏松模型大鼠骨代谢的影响[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(18): 2589-2595.

Zhong Yi, Xue Qing, Zhou Yi, Chen Liang-hua, Zhang Li-chao. Effects of perindopril on bone metabolism in a rat model of retinoic acid-induced osteoporosis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(18): 2589-2595.

图/表（结果） 4

2.1 实验动物数量分析在连续14 d的造模过程中，有2只鼠出现烂嘴，造模结束时，有1只大鼠出现驼背、跛脚现象，但均未出现维甲酸中毒症状；连续42 d的培哚普利干预过程中，大鼠未出现明显异常。50只大鼠均未死亡，全部纳入结果分析。

2.2 模型方法的改进实验选用维甲酸法诱导大鼠骨质疏松模型，由于其操作简单、时间短、成功率高等造模优势被多数研究者应用；剂量方面，通过阅读文献并结合该实验中大鼠的月龄、体质量等相关情况，选取了维甲酸中等剂量80-85 mg/(kg•d)，后经做预实验，确定剂量为80 mg/(kg•d)更为合适。

2.3 模型稳定性维甲酸造模法近期效果较好，远期效果稍差，停用维甲酸后，骨质疏松情况随着时间的延长可能有自身修复作用^[2]，考虑此因素，实验设置模型组(造模+不给药组)，通过与正常对照组比较，抗酒石酸酸性磷酸酶mRNA表达量与正常对照组相仿，但低于培哚普利8 mg/(kg•d)组，提示骨吸收指标有一定程度的恢复，模型组骨形成指标骨特异性磷酸酶mRNA表达量仍相对较低且低于正常对照组，提示骨形成指标未恢复，说明由维甲酸造模在该实验中所致的骨质疏松情况并未完全自行修复。

2.4 大鼠一般情况维甲酸造模结束后，正常对照组大鼠活动正常、灵活，毛色光泽，而模型组大鼠活动明显减少，体质量减轻，食量减少，反应迟钝，体毛枯疏，出现拱背等表现，培哚普利干预30 d时模型组大鼠表现有所好转，培哚普利各剂量组与模型组相比较，前者活动较多，毛色较好，体质量显著增高，而与正常对照组比较则未见显著性差异。

2.5 血清钙、磷含量及碱性磷酸酶活性变化与正常对照组比较，模型组大鼠钙、磷含量均显著降低(P < 0.05或P < 0.01)，碱性磷酸酶活性提高，但差异无显著性意义。与模型组比较，培哚普利剂量组钙含量增加，且呈现一定的剂量依赖性，以培哚普利8 mg/(kg•d)组增加较为明显(P < 0.05)；磷含量有升高趋势，但差异无显著性意义；碱性磷酸酶活性呈现降低趋势，以培哚普利8 mg/(kg•d)组降低明显(P < 0.05)，见表1。

2.6 骨质量和骨密度变化与正常对照组比较，模型组大鼠骨质量降低，差异有显著性意义(P < 0.05)，骨密度显著降低(P < 0.01)，表明维甲酸成功诱导了SD雌性大鼠骨质疏松的发生。与模型组比较，培哚普利各剂量组骨质量、骨密度均升高，且高剂量组表现出明显差异(P < 0.05)。表明培哚普利能有效阻止骨质疏松大鼠的骨质量、骨密度降低，见图1，2。

2.7 骨特异性磷酸酶及抗酒石酸酸性磷酸酶mRNA的表达量变化 骨形成指标：模型组与正常对照组比较，骨特异性碱性磷酸酶mRNA表达量显著下降，差异有显著性意义(P < 0.01)，培哚普利高剂量组与正常对照组比较，骨特异性碱性磷酸酶mRNA相对表达量差异无显著性意义(P > 0.05)；培哚普利2，4，8 mg/(kg•d) 3个剂量组、模型组间两两比较，差异均有显著性意义(P < 0.05)，且培哚普利8 mg/(kg•d)组骨特异性碱性磷酸酶 mRNA相对表达量要高于其余3组；培哚普利2，4 mg/(kg•d)组、模型组骨特异性碱性磷酸酶 mRNA均低于正常对照组，差异亦有显著性意义(P < 0.05)；培哚普利4，2 mg/(kg•d)组及模型组3组之间比较，表达量呈递减趋势，但差异无显著性意义(P > 0.05)，见表2。

骨吸收指标：培哚普利8 mg/(kg•d)组抗酒石酸酸性磷酸酶 mRNA相对表达量明显高于培哚普利2 mg/(kg•d)组及正常对照组，但差异无显著性意义(P > 0.05)；其余各组之间两两比较，差异也无显著性意义(P > 0.05)，见表2。

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引言

骨代谢是一个由骨形成和骨吸收构成的动态平衡过程，一旦这种平衡被打破，破骨作用大于成骨作用，就会导致骨质疏松。骨代谢生化指标可及时反映骨转换状态，灵敏度高、特异性强，在骨质疏松发病机制、骨质疏松药物的研究及流行病学研究方面具有重要临床意义^[1]。维甲酸是维生素A的一种衍生物，其对机体骨代谢具有较强的副反应，可造成动物继发性骨质疏松，维甲酸对雌性大鼠骨代谢的影响是骨吸收大于骨形成，致类似骨高转换状态^[2]。在骨质疏松症的形成和发展过程中，必然伴随着骨代谢生化指标的变化，正常情况下，血中钙、磷与骨中钙、磷维持动态平衡，成骨作用和破骨作用的正常进行是维持血中钙、磷浓度恒定的重要环节。碱性磷酸酶是评价骨形成和骨转换最常用的指标，血清中碱性磷酸酶的活性可反映成骨细胞活性和状态^[3-4]，骨特异性碱性磷酸酶是由成骨细胞分泌的一种锌蛋白，是反映成骨细胞活性和骨形成的特异性指标^[5]；抗酒石酸酸性磷酸酶主要是由破骨细胞分泌，作为骨吸收指标，参与降解骨基质中的钙磷钙化底物^[6]。文章通过检测血清钙、磷、碱性磷酸酶，测量股骨质量和骨密度，并检测骨组织中骨特异性碱性磷酸酶及mRNA及抗酒石酸酸性磷酸酶mRNA来观察骨代谢的变化。

骨质疏松症和高血压病都是老年人的常见疾病，随着人口老龄化速度的加快，同时合并两种病的人数也逐渐增加，不可避免地，步入老年之后，由于多种疾病共患，老年人要服用的药物也会相应增多，相信寻求既能治疗高血压病又能防治骨质疏松的药物是众多老年患者的要求。体内外实验证实，血管紧张素Ⅱ能够提高成骨细胞分泌相关因子促进破骨细胞成熟和分化，从而引起骨质疏松^[7-8]，有多项流行病学研究显示，血管紧张素转换酶抑制剂类降压药可以增加骨量或骨密度，降低骨折风险^[9-11]。推测阻断血管紧张素Ⅱ的合成可能是治疗骨质疏松的有效方法。作为临床上常用的该类药物之一的培哚普利(雅施达)能否用于抗骨质疏松未见文献报道，文章通过观察培哚普利对维甲酸所致骨质疏松模型大鼠骨代谢的影响，确定其对骨质疏松的作用并探讨其可能的机制，为其对骨质疏松的防治作用提供实验依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

材料方法

1.1 实验材料随机对照动物实验于2014年4至11月在中山大学附属第五医院中心实验室及珠海市检验检疫局动物检疫实验室完成。

主要试剂及仪器：维甲酸，广州博新精细化工公司；培哚普利，施维雅天津制药有限公司；血清钙试剂盒、磷试剂盒，北京博奥公司；碱性磷酸酶试剂盒，Randox 公司；TRIzol^TM试剂盒、RT-PCR(一步法)试剂盒，TaKaRa宝生物工程大连有限公司；PCR引物及探针，上海辉睿生物科技有限公司；电子天秤，德国Sartorius公司；双能X射线骨密度测定仪，美国Hologic公司；高速低温离心机，ALC公司；自动生化分析仪，美国Beckman公司；液氮罐，美国MVE公司；定量PCR仪，美国ABI公司；微量分光光度计，美国Nano Drop公司；荧光定量PCR仪，美国ABI公司；凝胶成像仪，美国ALPHA公司。

1.2 实验动物 12周龄SPF级同批SD雌性大鼠50只，体质量(300±50) g，由广东省医学实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK(粤)2008-0002。标准饲料喂养，自由饮水，环境模拟自然状态，实验符合动物伦理学的要求。

1.3 造模方法适应性喂养1周后，把50只大鼠按随机数字表法分为正常对照组、模型组及培哚普利2，4， 8 mg/(kg•d)3个剂量组，共5组，每组10只。造模前给每个大鼠作标记，称量并记录各个大鼠的体质量。按每2 g维甲酸粉剂加入3 mL吐温80的比例将维甲酸充分溶解，再加去离子纯净水搅拌混匀配制成维甲酸溶液。模型组及培哚普利3个剂量组的大鼠均予维甲酸80 mg/kg灌胃，于早上9点开始灌胃，1次/d，连续14 d，用以制备骨质疏松模型。正常对照组则灌予等容积的蒸馏水。

造模成功的检测标准：实验第14天，用无菌生理盐水配成0.3%戊巴比妥钠溶液，按10 mL/kg剂量进行腹腔麻醉各组大鼠，采用双能X射线骨密度测定仪测量大鼠的股骨骨密度以确定造模是否成功。

药物干预：灌服维甲酸14 d后，停止给予维甲酸，培哚普利低、中、高剂量组分别予2，4，8 mg/(kg•d)培哚普利灌胃干预，1次/d，连续42 d。对照组及模型组均灌予等容积蒸馏水。实验过程中观察大鼠的一般情况、体质量变化。

1.4 指标测定

血清钙、磷含量及碱性磷酸酶活性测定：末次给药结束后, 处死所有大鼠，心脏取血12 mL，温度控制在 4 ℃左右，2 000 r/min (r=12.4 cm) 离心10 min，取上清液，于-80 ℃冰箱中保存。测血清钙、磷、碱性磷酸酶，分别按照试剂盒说明进行操作检测。

骨质量和骨密度测定：迅速取出所有处死大鼠的两侧股骨，经剔除周围软组织后，取左侧股骨称量质量, 计算骨质量系数，应用双能X射线骨密度测定仪和软件对左侧股骨中段进行扫描并测定骨密度值，右侧股骨置于液氮罐中冻存，以测量组织中骨特异性碱性磷酸酶及抗酒石酸酸性磷酸酶的mRNA的表达。

检测骨组织中骨特异性碱性磷酸酶及抗酒石酸酸性磷酸酶的mRNA表达量：将冻存的股骨置于预冷的研钵中研麿成粉状，采用Trizol+过柱法提取组织总RNA，经纯化后采用一步法进行RT-PCR反应，并通过7500 1.4 ABI PCR仪对产物进行相对定量，研究目的基因在骨组织中的表达情况。

1.5 主要观察指标 ①培哚普利对骨质疏松模型大鼠血清中钙、磷含量及碱性磷酸酶活性的影响。②培哚普利对骨质疏松模型大鼠骨质量和骨密度的影响。③培哚普利对骨质疏松模型大鼠骨特异性碱性磷酸酶及抗酒石酸酸性磷酸酶mRNA表达量的影响。

1.6 统计学分析所有数据采用x(_)±s表示。采用SPSS 13.0统计软件处理分析。多个样本均数比较选择单因素方差分析，组间两两比较选择LSD检验，P < 0.05表示差异有显著性意义，P < 0.01表示差异有非常显著性意义。

讨论

维甲酸具有广泛的生物学活性，常用于肿瘤的化疗和皮肤病的治疗^[12]，但维甲酸具有致骨质疏松的不良反应，用药过程中多引发骨痛，有文献报道，维甲酸可促进成骨细胞的增殖和分化，又可增加破骨细胞的骨吸收，造成高转化型的骨质疏松。胡彬等^[13]通过动物实验研究，显示维甲酸主要是增强破骨的活性，同时使大鼠的卵巢损伤、功能减退，雌激素分泌减少，对破骨细胞的抑制作用减弱，最后导致骨丢失。维甲酸法诱导的雌性大鼠骨质疏松模型在发病症状、组织形态学以及对雌激素的骨反应与人类有较大相似性，由于操作简单、时间短、成功率高等优势，被许多研究者选为制造动物骨质疏松模型的常用方法^[14-15]。实验给大鼠灌胃70 mg/kg维甲酸，连续2周，可以导致大鼠骨质疏松^[16]，但另有研究认为，每天低剂量维甲酸溶液灌胃[70 mg/(kg•d)]造模效果欠佳，推荐用高剂量维甲酸[90，100， 120 mg/(kg•d)]溶液造模，因为后者能有效地拮抗饲料中钙对骨丢失的补偿作用^[17]。因此，实验采用较为常用的剂量80 mg/(kg•d)，而目前较常用剂量80-85 mg/(kg•d)已证实可成功造模^[18]。

实验结果显示，维甲酸诱导14 d后，大鼠出现食量减少，反应迟钝，体毛枯疏等表征，但均未出现维甲酸中毒甚至是死亡现象，说明80 mg/(kg•d)维甲酸能安全有效地诱导骨质疏松大鼠模型。维甲酸可降低骨矿物质的骨量和骨钙磷含量，降低骨吸收和胶原代谢的生物力学性能，增加骨转换^[19]；与正常对照组比较，模型组血清钙、磷水平显著降低，碱性磷酸酶活性升高；与模型组比较，培哚普利组血清钙含量显著升高，而磷含量有升高趋势，碱性磷酸酶活性降低，表明培哚普利能提高血浆中钙、磷含量，促进骨形成。与正常组比较，模型组股骨质量和骨密度都明显降低，培哚普利用药后回升，且均以8 mg/(kg•d)组明显，说明培哚普利能增加骨质量，提高骨密度。骨特异性碱性磷酸酶和抗酒石酸酸性磷酸酶分别反映骨形成和骨吸收标志，作者此次实验中大鼠骨组织中8 mg/(kg•d)的培哚普利能够上调骨特异性碱性磷酸酶mRNA，具有骨形成的作用，培哚普利2，4，8 mg/(kg•d)3个剂量之间比较，骨特异性碱性磷酸酶mRNA相对表达量呈递增趋势，说明培哚普利促进骨形成的作用呈剂量依赖性。虽然培哚普利 8 mg/(kg•d)组抗酒石酸酸性磷酸酶mRNA相对表达量高于模型组，但与正常对照组相比，差异仍无显著性意义；而模型组与正常对照组的抗酒石酸酸性磷酸酶mRNA比差异亦无显著意义，培哚普利2，4 mg/(kg•d)组与模型组相比差异也无显著性意义，考虑骨质疏松大鼠停用维甲酸后抗酒石酸酸性磷酸酶可能有自身修复作用，说明这3种剂量的培哚普利对骨吸收指标的影响尚不能确定，需要进一步的探索。

目前已有多项实验证实成骨细胞和破骨细胞都可以合成和表达血管紧张素转换酶、血管紧张素转换酶受体AT1、AT2等骨组织中存在肾素-血管紧张素-醛固酮系统各组分^[20-22]。骨组织肾素-血管紧张素-醛固酮系统中的血管紧张素Ⅱ通过成骨细胞与破骨细胞表面表达的受体影响骨代谢。血管紧张素Ⅱ分别通过ERK信号通路和cAMP信号途径促进成骨细胞的分化，分泌白细胞介素6，激活AT1受体，上调成骨细胞表达的RANKL，与破骨细胞表面的核因子κB受体活化因子RANK结合，促进破骨细胞的分化、增殖，导致骨吸收和骨形成失衡，最终骨量下降，骨微结构损坏^[23]。但血管紧张素Ⅱ对成骨细胞的影响是矛盾的，它刺激成骨细胞的DNA合成，增加细胞和胶原纤维数量，但抑制骨的矿化过程，这种双向调节作用可能与其两个AT1、AT2密切相关，两受体在破骨细胞表面均有表达，并者各自执行着不同的生理功能，存在功能性交互作用^[24]。对血管紧张素Ⅱ直接调控成骨细胞的研究中发现，血管紧张素Ⅱ能够抑制骨钙素mRNA的表达，降低碱性磷酸酶的活性，减少矿化结节的数量与面积，减少Ca²⁺在细胞和基质层的沉积^[25]。在脂代谢中，三酰甘油、低密度脂蛋白与骨质疏松具有显著相关性，血中两者升高是骨质疏松的危险因素^[26]，血管紧张素Ⅱ可上调低密度脂蛋白受体，增强冠状动脉及脐动脉的血管内皮细胞摄取低密度脂蛋白，从而增加骨质疏松的发生^[27]。血管紧张素Ⅱ还能促使成骨细胞分泌血管内皮生长因子，与造血细胞表面的血管内皮生长因子受体1结合，刺激破骨细胞的成熟、分化^[28-29]。推测血管紧张素转换酶抑制剂类药物主要是通过抑制血管紧张转换酶活性，抑制血管紧张素Ⅰ转化为血管紧张素Ⅱ，减少血管紧张素Ⅱ生成，从而影响骨代谢来改善骨质疏松。

环氧合酶2是一种诱导酶，多在炎症情况下诱导产生，正常情况下体内仅表达少量，近年发现它在骨骼重建、骨质吸收以及成骨细胞转导等过程中扮演着重要角色，研究发现去卵巢大鼠的骨质疏松模型中环氧合酶2在骨组织中表达增强^[30]，而在肾组织中血管紧张素Ⅱ增多和肾脏氧化应激状态均可诱导环氧合酶2表达增加^[31-32]，那么在骨组织中，血管紧张素Ⅱ是否会能过环氧合酶2介导骨质疏松的产生，还有待相关的实验研究验证。

综上所述，培哚普利有效控制维甲酸所致骨质疏松模型大鼠的骨质丢失，抑制骨吸收，促进骨形成，改善骨代谢的负平衡状态，对维甲酸导致的骨质疏松症具有良好的防治作用。高血压与骨质疏松密切相关，很多心血管疾病患者同时伴有骨质疏松，所以在使用心血管药物的同时须注意到药物对骨量的影响^[33]，此次研究为新药开发或临床制备同时治疗高血压和骨质疏松方面的药物提供了理论依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程