缺血后处理局灶性脑缺血再灌注模型大鼠相关通路以及白细胞介素8的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.49.012

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (49): 7938-7944.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.49.012

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缺血后处理局灶性脑缺血再灌注模型大鼠相关通路以及白细胞介素8的表达

李志行¹，吕敬雷²，陈萍¹，赵仁亮²

¹青岛大学医学院，山东省青岛市 266000；²青岛大学附属医院神经内科，山东省青岛市 266003

收稿日期:2015-09-07 出版日期:2015-11-30 发布日期:2015-11-30
通讯作者: 赵仁亮，博士，主任医师，教授，硕士生导师，青岛大学附属医院神经内科，山东省青岛市 266003
作者简介:李志行，男，1990年生，山东省青岛市人，汉族，青岛大学医学院在读硕士。
基金资助:
青岛市科技局立项课题(14-2-3-14-nsh)

Effects of ischemic postconditioning on related pathways and interleukin 8 expression in rat models of focal cerebral ischemia/reperfusion

Li Zhi-xing¹, Lv Jing-lei², Chen Ping¹, Zhao Ren-liang²

¹Qingdao University Medical College, Qingdao 266000, Shandong Province, China; ²Department of Neurology, the Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266003, Shandong Province, China

Received:2015-09-07 Online:2015-11-30 Published:2015-11-30
Contact: Zhao Ren-liang, M.D., Chief physician, Professor, Master's supervisor, Department of Neurology, the Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266003, Shandong Province, China
About author:Li Zhi-xing, Studying for master’s degree, Qingdao University Medical College, Qingdao 266000, Shandong Province, China
Supported by:
a grant from Qingdao Municipal Science and Technology Bureau, China, No. 14-2-3-14-nsh

摘要/Abstract

摘要：

背景：缺血后处理能够激发内源性保护作用，抑制缺血再灌注后的炎症反应，但具体机制目前尚不明确。

目的：观察缺血后处理对局灶性脑缺血再灌注大鼠Toll样受体4-核因子κB信号转导通路以及白细胞介素8表达的影响，进一步阐述缺血后处理的神经保护机制。

方法：将110只大鼠随机分为假手术组10只、模型组和缺血后处理组各50只，将大鼠按照Zea-Longa法建立局灶性脑缺血再灌注模型，再进行缺血后处理，即大脑中动脉闭塞2 h后进行3个循环的再灌注15 s/缺血15 s，设模型组和假手术组作对照。对各组进行神经行为学评分，TTC染色测定脑梗死体积，免疫组织化学法检测脑组织Toll样受体4、核因子кB和白细胞介素8蛋白表达，原位杂交法检测其mRNA表达。

结果与结论：模型组、缺血后处理组大鼠都出现神经行为学缺失及缺血侧大脑半球梗死。再灌注6，12，24，48，72 h，与模型组相比，缺血后处理组大鼠神经行为学评分显著改善(P < 0.05)、脑梗死体积明显减少(P < 0.05)。模型组和缺血后处理组Toll样受体4、核因子кB、白细胞介素8蛋白和mRNA表达于再灌注6 h时已升高，24 h达峰值。再灌注6，12，24，48，72 h，与模型组各对应时间点亚组比较，缺血后处理组上述各因子表达均显著降低(P < 0.05)。结果证实，缺血后处理可抑制缺血再灌注引起的炎症反应，通过抑制Toll样受体4-核因子κB信号转导通路和下调白细胞介素8的表达，以此发挥神经保护作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

关键词: 实验动物模型, 脑及脊髓损伤动物模型, 脑缺血, 再灌注损伤, 缺血后处理, 炎症反应, 神经保护, 动物模型, SD大鼠, Toll样受体4, 核因子кB, 白细胞介素8

Abstract:

BACKGROUND: Ischemic postconditioning may motivate endogenous protective effect and inhibit inflammatory response after ischemia/reperfusion, but the specific mechanism is still unclear.
OBJECTIVE: To investigate the effects of ischemic postconditioning on Toll-like receptor 4/nuclear factor кB signaling transduction pathway and interleukin 8 expression in rat models of focal cerebral ischemia/reperfusion, and further illustrate the neuroprotective mechanism of ischemic postconditioning.
METHODS: One hundred and ten rats were randomly divided into sham group (n=10), model group (n=50) and ischemic postconditioning group (n=50). Focal cerebral ischemia/reperfusion rat models were established according to Zea-Longa method, and then subjected to ischemic postconditioning, i.e., middle cerebral artery occlusion for 2 hours followed by 3 cycles of 15-second reperfusion/15-second ischemia. Model group and sham group were set for comparison. In each group, rat neurobehavioral deficit scores were evaluated, and rat infarct volume was measured with TTC staining. The expression of Toll-like receptor 4, nuclear factor кB and interleukin 8 protein in brain tissue was detected by immunohistochemistry. Their mRNA expression was detected
by in situ hybridization.
RESULTS AND CONCLUSION: Rats in the model and ischemic postconditioning groups all presented neurobehavioral deficits and cerebral hemisphere infarction on the ischemic side. At 6, 12, 24, 48 and 72 hours after reperfusion, the neurobehavioral deficit scores were significantly decreased in the ischemic postconditioning group compared with that in the model group (P < 0.05). The infarct volume of rats in the ischemic postconditioning group was significantly decreased compared with that in the model group (P < 0.05). The expression of Toll-like receptor 4, nuclear factor кB and interleukin 8 protein and mRNA was increased at 6 hours after reperfusion and reached the peak at 24 hours after reperfusion. At 6, 12, 24, 48 and 72 hours after reperfusion, the expression of Toll-like receptor 4, nuclear factor кB and interleukin 8 protein and mRNA was all significantly decreased in the ischemic postconditioning group compared with that in the model group (P < 0.05). The results confirm that ischemic postconditioning may inhibit inflammatory response induced by ischemia/reperfusion, and play its neuroprotective effect by inhibiting Toll-like receptor 4/nuclear factor кB signaling transduction pathway and down-regulating the expression of interleukin-8.

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中图分类号:

R318

李志行，吕敬雷，陈萍，赵仁亮. 缺血后处理局灶性脑缺血再灌注模型大鼠相关通路以及白细胞介素8的表达[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(49): 7938-7944.

Li Zhi-xing, Lv Jing-lei, Chen Ping, Zhao Ren-liang. Effects of ischemic postconditioning on related pathways and interleukin 8 expression in rat models of focal cerebral ischemia/reperfusion[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(49): 7938-7944.

图/表（结果） 4

2.1 实验动物数量分析实验共纳入141只大鼠，造模剔除31只，死亡动物通过随机原则补齐数量并重新造模，造模成功率78%。最终纳入110只大鼠进入结果分析。造模流程图见图1。

2.2 模型稳定性神经行为学评分和梗死体积检测显示：缺血再灌注后，模型组和缺血后处理组都出现不同程度神经功能缺失，缺血后处理组大鼠在各时间点的神经行为评分较模型组相应亚组显著降低(P < 0.05)；组内比较，模型组和缺血后处理组各亚组间评分差异无显著性意义(P > 0.05；表1)。 TTC染色显示，假手术组未见梗死灶，模型组和缺血后处理组可见白色梗死灶，主要位于额、顶、颞叶皮质，与模型组相应亚组比较，缺血后处理组各亚组梗死体积明显减小(P < 0.05；图2)；组内比较，模型组和缺血后处理组各亚组间梗死体积差异有显著性意义(P < 0.05)，模型组和缺血后处理组24 h亚组的梗死体积明显大于其他亚组 (P < 0.05；表1)。

2.3 局灶性脑缺血再灌注模型大鼠额顶叶皮质区Toll样受体4，核因子кB，白细胞介素8蛋白和mRNA的表达假手术组大鼠额顶叶皮质区有少量Toll样受体4蛋白和mRNA阳性细胞。模型组和缺血后处理组阳性细胞在大鼠缺血侧额、顶叶梗死灶周围区表达显著增高，再灌注6 h时表达已升高，24 h达到高峰；缺血后处理组各亚组Toll样受体4蛋白和mRNA阳性细胞数显著低于模型组相应亚组(P < 0.05；表2，图3)；组内比较，模型组各亚组间差异有显著性意义(P < 0.05)，模型组中24 h亚组Toll样受体4蛋白和mRNA阳性细胞显著高于其他时间点亚组(P < 0.05)。缺血后处理组Toll样受体4蛋白阳性细胞数在各亚组间的差异无显著性意义(P > 0.05)，但mRNA阳性细胞数在各亚组间的差异有显著性意义(P < 0.05)，缺血后处理组中24 h亚组Toll样受体4 mRNA阳性细胞数较其他亚组显著升高(P < 0.05)，见表2。

假手术组大鼠额顶叶皮质区核因子κB蛋白和mRNA阳性细胞呈低水平。再灌注6 h，后模型组和缺血后处理组阳性细胞数已升高，24 h达高峰，集中分布在大鼠脑额顶叶梗死灶周边区。缺血后处理各亚组核因子κB蛋白和mRNA阳性细胞数较模型组相应亚组显著降低(P < 0.05；表2，图3)；组内比较，模型组各亚组间差异有显著性意义(P < 0.05)，模型组中24 h亚组核因子κB蛋白和mRNA阳性细胞显著高于其他亚组(P < 0.05)。缺血后处理组中核因子κB蛋白阳性细胞数在各亚组间的差异无显著性意义(P > 0.05)，但其mRNA阳性细胞数在各亚组间的差异有显著性意义(P < 0.05)，缺血后处理组中24 h亚组核因子κB mRNA阳性细胞数较其他亚组显著升高(P < 0.05；表2)。
假手术组大鼠额顶叶皮质区白细胞介素8蛋白和mRNA阳性细胞呈散在分布。模型组和缺血后处理组阳性细胞在梗死灶周围区表达显著增高，再灌注6 h表达已升高，24 h达到高峰；缺血后处理组各亚组白细胞介素8蛋白和mRNA阳性细胞数显著低于模型组相应亚组(P < 0.05；表2，图3)；组内比较，模型组各亚组间差异有显著性意义(P < 0.05)，模型组中24 h亚组白细胞介素8蛋白和mRNA阳性细胞显著高于其他亚组(P < 0.05)。缺血后处理组白细胞介素8蛋白阳性细胞数在各亚组间的差异无显著性意义(P > 0.05)，但mRNA阳性细胞数在各亚组间的差异有显著性意义(P < 0.05)，缺血后处理组中24 h亚组白细胞介素8 mRNA阳性细胞数较其他亚组显著升高(P < 0.05；表2)。

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引言

材料方法

1.1 造模动物及材料选用SPF级SD大鼠141只，体质量230-260 g，由青岛市药物检验所实验动物中心提供，许可证号：SCXK(鲁)20100010。实验前将动物置于实验室适应环境饲养1周，均自由进食、饮水，每日光照12 h，实验室室温(22±2) ℃，相对湿度65%。实验过程符合中华人民共和国科学技术部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》的相关要求^[13]。

1.2 造模方法
1.2.1 分组大鼠在造模时剔除31只，将剩余大鼠110只随机分为假手术组10只，模型组和缺血后处理组各50只，后2组大鼠根据再灌注时间分为6，12，24，48，72 h共5个亚组[14]，每亚组10只。各亚组随机选取4只大鼠用于测定脑梗死体积，其他6只用于制备石蜡切片。
1.2.2 局灶性脑缺血再灌注模型大鼠制备实验于2013年9月至2014年12月在青岛大学医学院脑研所完成。参照Zea-Longa等[15]线栓法制备局灶性脑缺血再灌注模型。 ①模型组：体积分数10%水合氯醛(30 mL/kg)腹腔注射麻醉后将实验用大鼠仰卧固定于手术台上，常规备皮消毒，颈部正中切口，钝性游离左侧颈总动脉、颈外动脉及颈内动脉，结扎颈外动脉远端及其分支，沿根部结扎颈内动脉颅外分支翼腭动脉，用动脉夹暂时夹闭颈总动脉及颈内动脉，在颈外动脉结扎线近端距分叉5 mm处剪一约0.2 mm小口并导入栓线，经颈总动脉分叉部沿颈内动脉缓慢推进，向前深入(18.5±2.0) mm，直至大脑中动脉起始处，遇阻力时停止，结扎颈外动脉近心端，松开颈总动脉和颈内动脉处动脉夹，将线尾埋于皮下，缝合皮肤切口，2 h后经颈外动脉轻轻抽出栓线至分叉处形成再灌注。②缺血后处理组：拔除线栓前的手术过程与模型组相同。术后2 h将线栓拔出 5 mm，15 s后再将线栓置入初始位置15 s，如此重复3次再灌注/缺血循环。③假手术组仅给予暴露颈总动脉及分叉处的处理，与以上两组的24 h亚组同时处死。在动物清醒状态下，按Menzies等[16]的方法进行评分，以出现右前肢不能伸展、爬行时向右侧转圈并存活至规定时间点作为建模成功的标准。术中均使用白炽灯维持大鼠肛温在(37.0±0.5) ℃，术后单笼饲养。
1.3 神经功能评分按Zea-Longa[15]等级评分法对实验动物神经功能进行评分：0级，无神经功能缺损症状；1级，不能完全伸展右侧前肢；2级，爬行时向右侧旋转；3级，向右侧倾倒；4级，不能自发行走，意识丧失。
1.4 脑梗死体积的测定利用2，3，5-氯化三苯基四氮唑(2，3，5-triphenyl tetrazolium chloride，TTC)染色法[16]操作，在规定时间点各亚组随机选取4只大鼠，快速断头取脑，用大鼠脑模具自额极2 mm向后连续等距切取5个冠状脑片，间距2 mm。TTC 37 ℃避光染色10 min，置于40 g/L多聚甲醛的PBS中固定保存。正常脑组织染为红色，梗死组织为白色。逐层拍照后，用Adobe PhotoShop CS6计算各层梗死面积，梗死体积=各层梗死面积之和×层间隔。
1.5 石蜡切片的制备各亚组其他6只大鼠按规定时间点取材，制备石蜡切片。以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，仰卧固定，依次用生理盐水、体积分数4%甲醛溶液各250 mL经心脏灌注固定后断头完整取脑，取前囟后3-6 mm间冠状脑组织，常规梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋。自视交叉后方开始连续冠状位切片，厚度5 μm，置于多聚赖氨酸处理过的载玻片上，4 ℃保存，以备免疫组织化学与原位杂交使用。
1.6 免疫组织化学检测大鼠额顶叶皮质区Toll样受体4、核因子κB、白细胞介素8蛋白的表达利用免疫组织化学SABC(strept-avidin-biotin complex)法检测Toll样受体4、核因子кB和白细胞介素8蛋白的表达。石蜡切片常规脱蜡至水，PBS洗3次；体积分数3%H2O2灭活内源性酶；热修复抗原，将切片浸入0.01 mol/L的枸橼酸盐缓冲液，微波炉加热沸腾、冷却滴加封闭液，室温20 min，甩去多余液体；滴加1∶200工作浓度的一抗(兔抗Toll样受体4，核因子κB p65，白细胞介素8单克隆抗体)，4 ℃过夜；滴加生物素化二抗(辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG)，37 ℃孵育30 min；滴加试剂SABC，37 ℃孵育30 min；DAB显色，混匀DAB显色液加至切片。室温显色，镜下控制反应时间。蒸馏水洗涤中止反应；梯度乙醇脱水，二甲苯透明，封固。光学显微镜下观察胞浆或胞核有棕黄色颗粒者为阳性细胞，所有切片均在同一光强度、同一放大倍数下进行，每张切片先在低倍镜下随机选择额顶叶梗死灶周围区视野，然后在高倍镜下(400倍视野)选择缺血灶周围5个不连续的视野计数阳性细胞，取其平均值为该张切片的阳性细胞数。
1.7 原位杂交检测大鼠额顶叶皮质区Toll样受体4、核因子кB、白细胞介素8 mRNA 严格按照试剂盒说明操作：切片常规脱蜡至水，灭活内源性酶；滴加体积分数3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶暴露mRNA核酸片段；后固定10 min；滴加预杂交液，样品置于湿盒恒温箱40 ℃孵育2 h；滴加杂交液，恒温箱40 ℃杂交过夜；杂交后洗涤、滴加封闭液，37 ℃孵育30 min；滴加生物素化鼠抗地高辛，37 ℃孵育60 min；滴加SABC，37 ℃孵育20 min；滴加生物素过氧化酶，37 ℃孵育20 min；DAB显色30 min，水洗、封固。光学显微镜下观察阳性细胞胞浆呈棕黄色，所有切片均在同一光强度、同一放大倍数下进行，每张切片先在低倍镜下随机选择额顶叶梗死灶周围区视野，然后在高倍镜下(×400)选择缺血灶周围5个不连续的视野计数阳性细胞，取其平均值为该张切片的阳性细胞数。
1.8 主要观察指标各组大鼠神经行为学评分、梗死体积、额顶叶皮质区Toll样受体4、核因子κB和白细胞介素8蛋白和mRNA阳性细胞计数。
1.9 统计学分析采用SPSS 19.0软件包进行统计学处理，计量数据采用x(_)±s表示。各组对应时间点之间比较采用t 检验，组内不同时间点之间比较采用单因素方差分析和q检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

作为一种后处理措施，缺血后处理可抑制缺血再灌注后的炎症反应，减少组织细胞坏死及凋亡，能够激发内源性保护作用^[3，6，22]，其主要作用机制为：改善脑血流量和能量代谢，维持血脑屏障的完整性；抑制脂质过氧化，减少氧自由基的生成；抑制Caspase-3活性以及抑制细胞色素C从线粒体易位；抑制炎性递质生成等^[18-21]。Zhao等^[2]于2006年的研究中分别对3组大鼠的双侧颈总动脉夹闭15，30，60 min，夹闭后均开放30 s，然后予以缺血后处理处理，即双侧颈总动脉夹闭10 s/开放30 s，循环3次。结果发现，脑梗死体积分别减少80%，51%和17%，证实缺血后处理能诱导机体自身的神经保护功能。2007年有研究采用大鼠局灶性脑缺血模型，发现缺血后处理发挥神经保护作用的最佳时间为再灌注15 s/缺血15 s，循环3次^[22]。文章参阅国内外文献，经过反复预实验，通过对大鼠进行神经行为学评分，测量脑梗死体积明确脑对缺血耐受的改变，证实3个循环的再灌注15 s/缺血15 s 缺血后处理措施能够起到最佳的神经保护作用。
Toll样受体4是一种跨膜信号传递受体蛋白，其在胞内与接头蛋白髓样分化因子结合(MyD88)，通过MyD88依赖途径，转位到细胞核，进而启动促炎细胞因子转录^[23]。该信号传导通路可归纳为：Toll样受体4→MyD88→白细胞介素1 受体相关激酶(IRAK)→肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)→κIB→核因子κB 活化^[24]；经上述信号传导通路激活核因子κB后，白细胞介素1、白细胞介素6、白细胞介素8、部分黏附分子及肿瘤坏死因子等炎性细胞因子的大量释放，参与炎症反应以及细胞凋亡^[4，25]。动物实验证实，Toll样受体4缺陷大鼠缺血再灌注后的脑梗死体积和神经功能缺损评分明显低于Toll样受体4功能正常大鼠^[26-27]。冯蕊等^[28]通过建立血栓性脑缺血模型，在缺血4 h时夹闭缺血侧颈总动脉5 min，再通5 min，重复3个循环，发现缺血后处理可减轻脑缺血造成的神经元损伤，与对照组相比，缺血后处理组4 h及24 h时Toll样受体4蛋白表达明显减少。文章发现模型组梗死灶周围区域Toll样受体4、核因子κB蛋白6 h表达明显升高，24 h达高峰后开始下降。Toll样受体4、核因子κB mRNA的表达趋势与蛋白的表达基本一致，与以往报道结论相符^[10]，证实Toll样受体4-核因子κB信号转导通路在脑缺血再灌注损伤中具有关键作用。
炎症级联反应是脑缺血再灌注损伤机制中的重要环节。研究表明，许多生物活性物质例如白细胞介素1β、白细胞介素6、黏附分子和肿瘤坏死因子α等在缺血再灌注后表达增强或活性上调^[29-30]，导致血脑屏障破坏，影响脑内微环境的相对稳定^[31-32]。白细胞介素8又称嗜中性粒细胞因子，是一种趋化性炎性细胞因子，可以促进炎性细胞趋化和诱导细胞增殖。白细胞介素8主要由巨噬细胞和上皮细胞分泌，其主要生物学作用是趋化并激活中性粒细胞，增强中性粒细胞溶酶体酶活性和吞噬作用^[33]。中性粒细胞与白细胞介素8接触后发生形态学变化，定向游走到反应部位并释放一系列活性产物，这一过程可导致机体产生局部炎症反应，达到杀菌和损伤细胞的目的^[34-36]。白细胞介素8在缺血再灌注损伤过程中趋化中性粒细胞，介导、加重局部炎症反应^[35]。实验观察了缺血后处理后Toll样受体4-核因子κB信号转导通路以及下游炎性因子白细胞介素8表达的动态变化并与模型组以及假手术组进行比较。结果表明缺血再灌注可激活Toll样受体4-核因子κB信号转导通路，上调脑组织白细胞介素8的表达，启动和强化局部炎症反应，加重脑损伤。
研究分析显示，缺血后处理组与模型组相比大鼠Toll样受体4、核因子κB、白细胞介素8阳性细胞数显著减少，脑梗死体积缩小，神经行为学评分得到改善，提示缺血后处理可在脑缺血后抑制Toll样受体4-核因子κB信号转导通路，减少白细胞介素8等炎性细胞因子的释放，启动内源性保护机制，介导神经保护作用，提高机体对脑缺血耐受。文章仅观察了Toll样受体4-核因子κB信号转导通路以及白细胞介素8表达的动态变化，在今后的研究中可进一步检测该信号转导通路上游及下游细胞因子的变化趋势以及明确通路中其他途径的作用，更详尽地阐述缺血后处理抑制炎症反应的相关机制。
综上所述，Toll样受体4-核因子κB信号转导通路及下游炎症因子白细胞介素8在缺血再灌注损伤中起到重要作用。缺血后处理可能通过抑制该转导通路激发内源性保护作用，减少白细胞介素8等相关炎性因子的表达，从而起到神经保护功能。由于缺血后处理实施于脑缺血后，可控性强，具有重要的临床应用价值，深入开展缺血后处理的实验性研究将为缺血性卒中的治疗提供新途径。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

缺血后处理局灶性脑缺血再灌注模型大鼠相关通路以及白细胞介素8的表达

Effects of ischemic postconditioning on related pathways and interleukin 8 expression in rat models of focal cerebral ischemia/reperfusion

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