1.1 设计 随机对照动物实验。
1.2 时间及地点 实验于2018年9月至2020年5月在苏州大学医学部心血管病研究所完成。
1.3 材料 人脐带间充质干细胞购于江苏和泽生物科技有限公司；C2C12细胞购于美国ATCC细胞库；piR823的抑制剂si-piR823及引物由广州市锐博生物科技有限公司合成。
1.3.1 实验动物 8周龄雄性C57BL/6J小鼠，用于构建后肢缺血模型，购于昭衍(苏州)新药研究中心有限公司，许可证号：SCXK(苏)2018-0006，饲养于苏州大学实验动物中心。
1.3.2 主要试剂 β-甘油磷酸钠(Sigma，美国)；壳聚糖(浙江金壳药业股份有限公司)；外泌体分离试剂盒(Life Technology，美国)；Annexin V-FITC 凋亡检测试剂盒(BD，荷兰)；Cell-LightTM Apollo 567 Stain Kit(锐博生物)。
1.4 实验方法
1.4.1 外泌体的获取及鉴定 将胎牛血清100 000 ×g离心7 h，以去除先前存在于其中的外泌体。将人脐带间充质干细胞用含有体积分数10%胎牛血清的培养基培养。培养48 h后，使用外泌体分离试剂盒分离外泌体，将人脐带间充质干细胞的培养基以2 000×g离心30 min以除去死细胞和碎片；吸取上清，与外泌体分离试剂以体积比2∶1加入到新试管中，4 ℃下孵育过夜；次日，4 ℃下以10 000×g离心1 h，沉淀即为分离得到的外泌体。
电子显微镜观察：将外泌体质量浓度调整到0.5 g/L，PBS重悬，加入2.5%戊二醛固定10 min，取20-30 μL固定好的外泌体悬液滴于碳膜包被的铜网上并于室温静置1 min，红外灯下烘干5 min，滴加一滴1%磷酸钨酸于铜网上室温染色 5 min，吸干磷酸钨酸溶液，再次置于红外灯下烘干10 min。最后将铜网置于电子显微镜下，进行观察并成像。
纳米粒度分析：将外泌体质量浓度调整到1 g/L(用量为1 mL)，随后使用纳米粒度及Zeta电位分析仪进行测量。
流式细胞术鉴定：取10 μL外泌体悬液到1.5 mL EP管中，加入10 μL醛/硫酸盐乳胶微珠室温孵育15 min。随后向EP管中加入PBS至总体积为1 mL，混匀后室温孵育2 h。2 h后，加入1 mol/L的甘氨酸溶液110 μL，混匀后室温孵育30 min。4 000 r/min离心3 min，弃上清。用含0.5%BSA的PBS洗涤2次外泌体沉淀。100 μL 含0.5%BSA的PBS重悬外泌体，加入10 μL FITC标记的CD63抗体，4 ℃避光孵育1 h。通过0.5%BSA的PBS洗涤外泌体沉淀2次，最后用200 μL含0.5%BSA的PBS重悬，上机检测。
1.4.2 piR823改造和修饰外泌体 采用细胞转染的方法敲低外泌体中的piR823，具体如下：待间充质干细胞密度达到60%-80%时即可进行转染实验，首先将旧的培养基吸出，每孔加入1 mL PBS，冲洗，吸出后每孔加入4 mL基础培养基(无双抗)，30 min后开始转染；配制A液：475 μL基础培养基+25 μL Lip2000，B液：475 μL基础培养基+25 μL piR823 inhibitor；室温条件下混匀A液和B液，孵育15 min；然后加入到培养皿中，此时每个培养皿的终体积为5 mL。6 h后转为无外泌体血清的培养基(αMEM基础培养基+通过离心去除外泌体的血清)，待细胞长满时即可收集外泌体，此时得到的外泌体即为转染后的外泌体。采用相同方法转染转染piR823的空白对照。利用qRT-PCR法检测piR823 mRNA的表达量。
为了探究piR823在人脐带间充质干细胞来源外泌体中的作用，检测小鼠各器官中piR823 mRNA的表达量，以及外泌体及其来源人脐带间充质干细胞中piR823 mRNA的表达量。
qRT-PCR检测piR823 mRNA表达量：将组织样品先进行研磨后加入Trizol裂解液提取RNA，细胞及外泌体样品直接加入Trizol裂解液裂解提取RNA。根据PrimeScript RT试剂盒(TaKaRa，日本)对RNA进行反转录，具体反应体系：5×PrimeScript Buffer 2 μL，PrimeScript Enzyme mTX 0.5 μL，Oligo dT Primer(50 μmol/L)0.5 μL，Random primers(100 μmol/L)0.5 μL，Total RNA 500 ng，RNAase Free ddH2O补齐至10 μL；反应程序：16 ℃30 min，30 ℃30 s，42 ℃30 s，50 ℃1 s，85 ℃ 5 s，10 ℃hold。采用SYBR Premix Ex Taq试剂盒对cDNA样品进行qRT-PCR检测，反应体系：SYBR Premix Ex Taq 5 μL，Forward Primer(5 μmol/L)
0.4 μL，Reverse Primer(5 μmol/L)0.4 μL，ROX Reference Dye 0.2 μL，cDNA模板2 μL，RNAase Free ddH2O 2 μL；反应程序：95 ℃1 min，95 ℃2 s，60 ℃30 s，95 ℃15 s，60 ℃1 s。piR823引物序列：AGC GUU GGU GGU AUA GUG GUG AGC AUA GCU GC。
1.4.3 细胞增殖实验 将处于对数生长期、生长状态良好的C2C12细胞均匀接种于96孔板中，培养至正常生长阶段，待细胞密度达到85%以上时即可进行实验，以每孔4×103-1×105个细胞为宜。将C2C12细胞均匀铺到96孔板中，12 h后在培养基内分别加入转染piR823抑制剂的外泌体和转染空白对照的外泌体，两者质量浓度均为100 g/L。培养24 h后，按照锐博生物Cell-LightTM Apollo 567 Stain Kit使用说明进行实验，依次进行EdU标记、细胞固定化、Apollo染色和DNA染色，最后进行图像获取及分析，染色完成后马上进行检测；如果条件限制，应在4 ℃避光条件下保存，但不应超过3 d。
1.4.4 细胞凋亡实验 取对数生长期的C2C12细胞，待细胞密度达到75%-80%时，将细胞培养基分别换成含50，100，200 μmol/L过氧化氢的培养基处理24 h，建立体外细胞凋亡模型。24 h后，通过qRT-PCR检测细胞内piR823 mRNA的表达情况。为进一步检测外泌体及其中piR823对体外细胞凋亡的影响，将对数生长期的C2C12细胞分为3组，分别为过氧化氢处理组、过氧化氢+外泌体组、过氧化氢+敲低piR823外泌体组，过氧化氢浓度均为100 μmol/L，外泌体的质量终浓度均为100 g/L，处理24 h，最后用流式细胞术检测凋亡情况。
1.4.5 外泌体对壳聚糖/β-甘油磷酸钠温敏型水凝胶的影响实验
壳聚糖/β-甘油磷酸钠温敏型水凝胶制备：称取2.8 g β-甘油磷酸钠溶解于5 mL去离子水中，使其质量浓度为
560 g/L；将脱乙酰度为95%的壳聚糖粉末(脱乙酰度> 95%)0.2 g溶解于10 mL的0.1 mol/L醋酸溶液中，使其质量浓度为22 g/L，于25 ℃搅拌过夜至完全溶解，以100 μm细胞筛过滤，除去杂质。取壳聚糖乙酸溶液10 mL于小烧杯中，在冰水浴条件下按照10∶1比例逐滴添加1 mL的β-甘油磷酸钠溶液，并不断搅拌。用饱和的磷酸氢钠溶液调节pH值至6.96。将上述配置好的溶液置于37 ℃恒温水浴锅中，待溶液不流动时，即形成壳聚糖/β-甘油磷酸钠温敏型水凝胶。
温敏型水凝胶包封外泌体：在温敏型水凝胶成胶前与外泌体直接混合，保证外泌体的质量浓度为100 g/L。
温敏型水凝胶的成胶性能：将配制好的壳聚糖/β-甘油磷酸钠温敏型水凝胶溶液通过皮下分别注入4只小鼠体内，注射量为100 μL，15 min后剪开小鼠皮肤，如发现产生胶冻样物质，证明可在小鼠体内成胶。
酶标仪检测：取壳聚糖溶液、壳聚糖溶液+外泌体、壳聚糖/β-甘油磷酸钠温敏型水凝胶、壳聚糖/β-甘油磷酸钠温敏型水凝胶+外泌体各100 μL，放入96孔板中，每组3孔。设置450，562，695 nm 3个波长，利用酶标仪进行吸光度值检测。
扫描电镜检测：首先将冷冻干燥的样品黏附在扫描电镜底座的导电胶带上，待离子溅射仪镀膜后入扫描电镜观察。
傅里叶红外光谱检测：将壳聚糖溶液、壳聚糖溶液+外泌体、壳聚糖/β-甘油磷酸钠温敏型水凝胶、壳聚糖/β-甘油磷酸钠温敏型水凝胶+外泌体置于-20 ℃冷冻，待完全凝固后放到冷冻干燥仪中进行冷冻干燥。待完全冻干后取出适量，随后使用VERTEX70红外光谱仪(Thermo Fisher，美国)进行检测。首先将仪器预热30 min，然后将样品取出，放于样品检测台中间的光源透过处，最后进行ATR光谱测量(测量时样品一定要压紧)。
流变学测量：取壳聚糖/β-甘油磷酸钠温敏型水凝胶与包封外泌体的壳聚糖/β-甘油磷酸钠温敏型水凝胶，运用振荡模式，固定频率1 Hz、应变振幅0.01%，温度范围0-40 ℃，升温速率1 ℃/min，平衡3 min后对样品进行温度扫描，考察G’ (储能模量)、G″ (耗能模量) 随温度的变化关系。
水凝胶包封外泌体的缓释动力学：为了检测温敏型水凝胶释放外泌体的速率，使用PKH26荧光染料试剂对外泌体进行荧光标记，将包封外泌体的水凝胶置于24孔板内，用 1 mL PBS浸泡。在37 ℃下每2 d收集一次降解液，并加入新的PBS，最后使用流式细胞仪(Millipore 德国)检测不同时间收集的外泌体的量。将浸泡30 d的缓释液与C2C12细胞共孵育，24 h后通过EdU试剂检测PBS及缓释液对细胞的影响。
1.4.6 不同修饰和改造的外泌体对小鼠缺血后肢恢复的影响
小鼠后肢缺血模型的建立：将30只小鼠随机分为5组，每组6只。首先，使用4%水合氯醛进行腹腔注射，待小鼠麻醉后将其仰卧固定。用脱毛膏对两条后肢脱毛，并用体积分数75%乙醇棉球对皮肤消毒。纵行切开左后肢正中的皮肤，从腹股沟开始，沿腹股沟韧带向远端钝性剥离肌肉至膝关节，分离出股动脉，在腹股沟韧带下结扎股动脉，并结扎与股动脉相连的所有分支。手术结束后，从中间偏下端的位置剪断股动脉，以不出血初步鉴定为建模成功。随后向小鼠的左后肢腓肠肌分别注射PBS(A组)、壳聚糖/β-甘油磷酸钠温敏型水凝胶(B组)、包封外泌体的壳聚糖/β-甘油磷酸钠温敏型水凝胶(C组)、外泌体(D组)、敲低piR823的外泌体(E组)，每组试剂60 μL，最后缝合伤口。
qRT-PCR检测：后肢缺血0，1，3，7 d后，利用qRT-PCR检测缺血组织piR823 mRNA表达量。
激光多普勒血流仪实验：术后0，7，14，21及28 d，通过激光多普勒血流仪对小鼠后肢血流灌注情况进行检测。建模当天血流灌注率低于15%为建模成功。首先通过小动物呼吸麻醉机对小鼠进行麻醉(2%异氟烷)，之后用脱毛膏对小鼠的双后肢进行脱毛处理，并用激光多普勒血流仪检测小鼠后肢血流。具体操作是：在室温下分别于小鼠手术侧和非手术侧的后肢放置激光探头，扫描测量后肢血流(在放松、恒温下所测得的数值)。灌注平均值根据储存的数字彩色编码图像进行计算，灌注率为缺血左肢血流/正常右肢血流。
运动耐力实验：术后28 d进行运动耐力实验。先将小鼠置于跑步机上低速运动1 h以适应周围环境，1 h后当小鼠在跑步机上处于稳定运动状态时开始记录跑步时间与距离。首先将跑步机的初始速度设定为6 m/min，之后再将跑步机速度匀速增加至18 m/min并保持不变，直至小鼠处于完全疲惫状态。最终，记录小鼠运动最终总距离与时间。
抓力实验：术后28 d，通过小鼠抓力仪对小鼠四肢力量进行评估测量。首先是将小鼠轻轻放置在抓力板上，抓住鼠尾轻轻向后牵拉(不可猛拉)，待动物抓牢抓力板后，均匀用力后拉致使动物松爪，仪器会自动记录小鼠的最大抓力。每只小鼠测量10次，去掉最大值和最小值，取剩余数值的平均值作为最终测量结果值。
肢体运动功能与恢复评分：根据国际通用的半定量评分系统对小鼠肢体功能与恢复进行评分，具体评分参照标准见表1。
肌肉质量比实验：在术后30 d处死小鼠，称量小鼠体质量，再取出小鼠缺血后肢腓肠肌称质量，以获得其肌肉质量比。
1.5 主要观察指标 敲低piR823的外泌体对C2C12细胞增殖与凋亡的影响；外泌体与壳聚糖/β-甘油磷酸钠温敏型水凝胶的相互作用；外泌体及敲低piR823的外泌体小鼠缺血后肢恢复的影响。
1.6 统计学分析 采用GraphPad 7.0软件进行统计分析，计量资料用x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，各组间两两比较采用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。
文题释义：
