增强芳香烃受体表达对糖尿病模型大鼠牙槽骨缺损区愈合及炎症反应的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.3144

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (14): 2166-2171.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.3144

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增强芳香烃受体表达对糖尿病模型大鼠牙槽骨缺损区愈合及炎症反应的影响

罗诒财，李昊

广西医科大学口腔医学院口腔修复科，广西壮族自治区南宁市 530022

收稿日期:2019-12-23 修回日期:2019-12-28 接受日期:2020-02-26 出版日期:2021-05-18 发布日期:2020-12-30
通讯作者: 李昊，博士，副主任医师，广西医科大学口腔医学院口腔修复科，广西壮族自治区南宁市 530022
作者简介:罗诒财，男，1987年生，湖南省祁东市人，汉族，广西医科大学在读硕士，主治医师，主要从事口腔种植修复方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81600833)，项目负责人：李昊

Effect of enhanced aryl hydrocarbon receptor expression on inflammatory response and healing of alveolar bone defects in diabetic rats

Luo Yicai, Li Hao

Department of Prosthodontics, School of Stomatology, Guangxi Medical University, Nanning 530022, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Received:2019-12-23 Revised:2019-12-28 Accepted:2020-02-26 Online:2021-05-18 Published:2020-12-30
Contact: Li Hao, MD, Associate chief physician, Department of Prosthodontics, School of Stomatology, Guangxi Medical University, Nanning 530022, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Luo Yicai, Master candidate, Attending physician, Department of Prosthodontics, School of Stomatology, Guangxi Medical University, Nanning 530022, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81600833 (to LH)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
AhR：Aryl hydrocarbon receptor，即芳香烃受体，一种配体激活的转录因子，参与体内一些重要的生物学过程，如信号转导、细胞分化、细胞凋亡等，对生长发育和生理功能具有调控作用。研究表明，AhR信号在健康和疾病免疫系统中发挥重要作用，其在多种免疫炎症反应中起重要调节作用，通过调控AhR表达来治疗一系列疾病是近年来研究的热点。
糖尿病牙槽骨缺损：糖尿病牙周炎是糖尿病在口腔的并发症，其导致的牙周附着丧失和骨吸收是糖尿病患者失牙的重要原因。糖尿病骨状态易导致牙槽骨缺损难以愈合，为后续口腔治疗如牙种植手术等的实施带来困难，因此治疗糖尿病牙槽骨缺损愈合障碍是当前口腔医学领域的难点及热点。

背景：高血糖状态下牙槽骨缺损区的高炎症反应状态，是导致骨愈合迟缓的重要原因。研究表明，增强芳香烃受体(AhR)表达能够抑制炎症反应，有利于组织损伤愈合。
目的：研究增强芳香烃受体表达对糖尿病大鼠牙槽骨缺损区炎症反应及骨缺损愈合的影响及机制。
方法：SD大鼠40只，随机取血糖正常大鼠10只作为正常对照组；其余大鼠构建糖尿病模型后，随机分为空白对照组、阴性对照组、芳香烃受体增强组，每组10只；所有糖尿病模型大鼠构建双侧上颌牙槽骨缺损模型。芳香烃受体增强组骨缺损处注射含有过表达芳香烃受体慢病毒载体的AteloGene胶体；阴性对照组骨缺损处注射含有慢病毒空白载体的AteloGene胶体；空白对照组及正常对照组不做注射。28 d取大鼠双侧上颌骨组织，苏木精-伊红染色检测局部骨缺损愈合状况；qRT-PCR检测芳香烃受体与Notch 信号通路相关基因的变化、炎症因子及碱性磷酸酶基因表达。动物实验获得广西医科大学动物实验伦理委员会批准。
结果与结论：①苏木精-伊红染色显示，芳香烃受体增强组的骨组织再生Lane-Sandhu 评分高于空白对照组和阴性对照组(P < 0.05)，炎性细胞浸润水平低于空白对照组和阴性对照组(P < 0.05)；②qRT-PCR结果显示，芳香烃受体增强组中肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、Notch1、Jagged1及Jagged2表达低于空白对照组和阴性对照组(P < 0.05)，白细胞介素10和碱性磷酸酶表达高于空白对照组和阴性对照组(P < 0.05)；③结果表明，在高糖状态下，增强芳香烃受体表达可减轻糖尿病大鼠牙槽骨缺损区炎症反应，促进骨缺损愈合，这些作用可能与Notch信号通路激活受到抑制有关。

基金资助：国家自然科学基金(81600833)，项目负责人：李昊

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 糖尿病, 牙槽骨缺损, 炎症反应, 受体, 骨缺损, 信号通路, 炎性因子, 碱性磷酸酶, 大鼠

Abstract: BACKGROUND: Under high glucose conditions, inflammatory responses in the defect site of alveolar bone are intensified, resulting in delayed bone healing. Previous studies have shown that enhanced aryl hydrocarbon receptor (AhR) expression can inhibit inflammatory responses and promote tissue healing.
OBJECTIVE: To study the effect and mechanism of enhanced AhR expression on inflammatory response and healing of alveolar bone defects in diabetic rats.
METHODS: Ten of 40 Sprague-Dawley rats were randomly selected as normal controls. Diabetic models were established in the other 30 rats, and randomly divided into AhR enhancement, negative control, and blank control groups, with 10 rats in each group. Bone defects were made by surgery in both sides of maxillae of each diabetic rat. After surgery, AteloGene gel with AhR lentiviruses was injected into the defect sites of rats in the AhR enhancement group. AteloGene gel with control lentiviruses was injected into the defect sites of rats in the negative control group. Rats in blank control group and normal control group received no injection. Twenty-eight days after defects were made, all rats were sacrificed, and left maxillary bone tissues were collected to detect bone healing using hematoxylin-eosin staining. Tissues from right maxillary bone defect sites were detached, and qRT-PCR was used to detect the gene expression of AhR and Notch signaling pathway members and inflammatory factors and alkaline phosphatase. Animal experiment was approved by the Animal Experimental Ethics Committee of Guangxi Medical University.
RESULTS AND CONCLUSION: Hematoxylin-eosin staining showed that the Lane-Sandhu scores of bone tissue regeneration in the AhR enhancement group were higher than those of negative control and blank control groups (P < 0.05); and the levels of inflammatory cell infiltration were lower than those of negative control and blank control groups (P < 0.05). qRT-PCR results showed that the levels of tumor necrosis factor α, interleukin-6, Notch1, Jagged1 levels, and Jagged2 in the AhR enhancement group were lower than those in the negative control and blank control groups (P < 0.05), and the levels of interleukin-10 and alkaline phosphatase were higher than those in the negative control and blank control groups (P < 0.05). These findings suggest that under high glucose conditions, enhanced AhR expression could reduce inflammatory response in alveolar bone defect sites of diabetic rats and promote the healing of bone defects, which may be associated with the inhibition of Notch signaling activation.

Key words: diabetes mellitus, alveolar bone defect, inflammatory response, receptor, bone defect, signaling pathway, inflammatory response, alkaline phosphatase, rat

中图分类号:

罗诒财, 李昊. 增强芳香烃受体表达对糖尿病模型大鼠牙槽骨缺损区愈合及炎症反应的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(14): 2166-2171.

Luo Yicai, Li Hao. Effect of enhanced aryl hydrocarbon receptor expression on inflammatory response and healing of alveolar bone defects in diabetic rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(14): 2166-2171.

图/表（结果） 4

2.1 实验动物数量分析实验选用大鼠40只，随机分为4组，实验过程无脱失，全部进入结果分析。
2.2 各组大鼠空腹血糖值比较各组大鼠处死当日测其空腹血糖值，正常对照组为(5.638±1.023) mmol/L，低于糖尿病各组(P < 0.05)；空白对照组、阴性对照组与AhR增强组的空腹血糖值分别为(17.632±2.122)，(18.353±1.742) 及(17. 009± 1.456) mmol/L，3组间差异无显著性意义(P > 0.05)。
2.3 各组大鼠骨缺损愈合状况比较苏木精-伊红染色检测显示，正常对照组骨缺损区骨形成量较多，但纤维组织较少；糖尿病各组纤维组织较多，但骨组织较少；AhR增强组和阴性对照组骨组织周围可见部分空隙，此空隙由标本处理过程中残余的 AteloGene 胶体脱落所致。骨组织再生Lane-Sandhu 评分显示：正常对照组为高于糖尿病各组(P < 0.05)，AhR增强组高于空白对照组和阴性对照组(均P < 0.05)；而空白对照组与阴性对照组相比，Lane-Sandhu 评分差异无显著性意义(P > 0.05)。正常对照组炎细胞浸润水平低于糖尿病各组(P < 0.05)；AhR增强组的炎细胞浸润水平低于空白对照组、阴性对照组 (P < 0.05)，而后两组之间未见统计学差异。见表2，图1。

2.4 AhR基因及Notch 信号通路相关基因表达检测结果比较各组大鼠右上颌骨缺损区组织qRT-PCR结果显示，AhR增强组的AhR基因表达水平高于空白对照组、阴性对照组(P < 0.05)，而后两组之间未见统计学差异。正常组中Notch1、Jagged1、Jagged2基因表达水平低于糖尿病各组(P < 0.05)，AhR增强组的Notch1、Jagged1、Jagged2表达水平低于空白对照组、阴性对照组(P < 0.05)，而后两组之间差异无显著性意义(P > 0.05)。见图2。

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引言

糖尿病是由于胰岛素受体缺陷致使靶细胞对胰岛素敏感性降低所致的一种内分泌及全身代谢紊乱综合征，发病率呈逐年上升的趋势。糖尿病牙周炎是糖尿病在口腔的主要并发症，其导致的牙周附着丧失和骨吸收是糖尿病患者失牙的重要原因[1]，而糖尿病患者易发生骨愈合障碍，导致糖尿病患者牙槽骨缺损后难以恢复，影响牙种植术等多种口腔治疗措施的实施。研究表明，高血糖状态下骨缺损愈合时间比血糖正常者延长[2]。糖尿病高血糖会导致巨噬细胞极化异常，抑制成骨分化能力，致使拔骨愈合发生延迟[3-4]。此外，持续高血糖会导致骨胶原中糖化终产物(advanced glycation end products，AGEs)增多，其不仅会降低骨胶原纤维生成，还会导致缺损局部多种炎细胞聚集，炎症因子表达增多，提高破骨细胞的活性，使骨吸收加剧[5]。目前，对于糖尿病骨缺损的治疗主要包括血糖控制、牙周治疗、抗感染治疗以及药物治疗等，但都无法取得令人满意的效果。虽然一些新的药物被证明可以促进糖尿病骨愈合，如叉头转录因子１(Forkhead transcription factor 1，FoxO1)抑制剂[6]、二肽基肽酶4抑制剂等[7]，但都还需要更多的临床研究提供依据。因此，如何治疗糖尿病牙槽骨缺损依然是当前口腔医学领域的难点之一。
芳香烃受体(Aryl hydrocarbon receptor，AhR)是一种由配体激活的转录因子，其在多种免疫炎症反应的调节中起重要作用。通过对AhR的配体和AhR 基因敲除小鼠的研究，发现AhR能调控炎性细胞因子的产生和分泌，如肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、白细胞介素10等[8]，此外，通过调节AhR基因的表达，能够对炎症反应相关Notch信号通路的激活产生影响[9]。一些AhR调节剂已被证明可调节炎症反应，如FICZ是一种AhR信号通路激活剂，已有实验证明FICZ可以通过抑制炎性因子分泌和促进牙周膜细胞矿化而抑制牙周炎的发展[10]。然而，在糖尿病高糖状态下，调节AhR的表达能否影响牙槽骨缺损区的炎症反应和骨缺损愈合，目前鲜有报道。此次实验通过构建糖尿病大鼠牙槽骨缺损模型，研究在增强AhR表达的情况下对牙槽骨缺损区炎症反应以及牙槽骨愈合情况的影响，并探讨其发生发展的机制，为探寻糖尿病牙槽骨缺损的治疗方法提供实验依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。
1.2 时间及地点实验于2019年7月至2020年1月在广西重点实验室口腔颌面修复与重建研究实验室进行。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 SPF级4周龄雄性SD大鼠40只(体质量60-80 g)，购自广西医科大学动物实验中心，许可证号：SCXK桂2014-0002。动物实验获得广西医科大学动物实验伦理委员会批准。
1.3.2 主要实验试剂及仪器链脲佐菌素( Sigma，美国) ；含过表达AhR慢病毒载体、含慢病毒空白载体(上海吉玛制药技术有限公司，中国)；AteloGene 胶体(广州波柏贸易有限公司，中国) ；TRIzol裂解液(TAKARA公司，中国大连) ；qRT-PCR检测试剂盒(TAKARA公司，中国大连)；慢速牙科手机(KaVo，德国)，0.5 mm直径球钻(Sybron，美国)；Nikon 80i型显微镜( Nikon，日本)。
1.4 实验方法
1.4.1 构建糖尿病大鼠模型 40只SD大鼠，随机选取30只以高糖饲料联合链脲佐菌素法诱导其形成糖尿病，即经过高糖饲料喂养4周，空腹12 h后腹腔注射链脲佐菌素35 mg/kg，1周后取尾静脉血检测空腹血糖值，超过11.1 mmol/L者为糖尿病模型构建成功[11]，形成糖尿病后以常规鼠饲料喂养。30只糖尿病大鼠随机分为空白对照组、阴性对照组和 AhR增强组(n=10)；其余10只大鼠，不进行糖尿病诱导，均以常规鼠饲料喂食，作为正常对照组。处死前测定各组动物空腹血糖值确定是否为糖尿病状态。

1.4.2 构建大鼠双侧上颌牙槽骨缺损模型及分组干预确定糖尿病大鼠模型构建成功后，对所有大鼠构建双侧上颌牙槽骨缺损模型。以100 g/L水合氯醛按 250 mg/kg剂量腹腔注射麻醉大鼠，在上颌第1磨牙腭侧分离牙龈及黏骨膜后，用配备0.5 mm直径球钻的慢速钻机从近中向远中磨除部分骨质，一边磨除一边用注射器滴无菌生理盐水冷却，制备长3 mm、宽1.5 mm、深1.5 mm的缺损，然后缝合软组织关闭创口。AhR增强组立即对骨缺损处缓慢注射5 μL含有 1 μmol/L过表达AhR慢病毒载体的AteloGene胶体；阴性对照组骨缺损处缓慢注射5 μL含有1 μmol/L慢病毒空白载体的AteloGene胶体，注射时胶体无溢出，无渗漏；空白对照组及正常对照组不做注射。
1.4.3 苏木精-伊红染色检测骨缺损的愈合状况在构建缺损28 d后，处死各组动物，取其左侧上颌骨组织于40 g/L多聚甲醛中固定24 h后，10%乙二胺四乙酸溶液脱钙8周，脱钙结束后，将骨组织常规脱水、包埋，所得标本蜡块按 4 μm厚度连续切片，常规进行苏木精-伊红染色，在Nikon 80i 型显微镜下观察牙槽骨缺损部位形态与炎细胞浸润情况，计算各组标本骨组织再生Lane-Sandhu评分。
1.4.4 qRT-PCR检测目的基因表达处死各组大鼠后，取右上颌骨缺损区组织并分离清除干净牙龈和黏膜，将分离后的术区组织置于冰上裂解匀浆，12 000×g离心40 min，取上清液常规提取总RNA后，用qRT-PCR检测AhR与Notch信号通路相关基因(Notch1、Jagged1、Jagged1)的变化，炎症因子(肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、白细胞介素10)及碱性磷酸酶基因的表达，所有实验操作按照试剂盒说明进行(内参为β-actin)。反应条件：95 ℃预变性5 min，(95 ℃变性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸45 s) ×40个循环，72 ℃延伸7 min。采用2-ΔΔCT法计算各目的基因表达量。各基因引物序列见表1。

1.5 主要观察指标 ①各组大鼠空腹血糖；②大鼠骨组织再生Lane-Sandhu 评分及炎症细胞浸润水平；③大鼠牙槽骨缺损区AhR基因、Notch 信号通路(Notch1、Jagged1、Jagged2)基因、炎性因子(肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、白细胞介素10)基因及碱性磷酸酶基因表达。
1.6 统计学分析采用 SPSS 18.0软件对数据(x±s)进行分析，各组间比较采用成组设计方差分析，组件比较采用SNK-q检验，检验水准α=0.05。

讨论

以往的实验表明，AhR激活可减轻组织中的炎性反应水平，使促炎因子(如肿瘤坏死因子α、白细胞介素6)分泌减少而抑炎因子(如白细胞介素10)分泌增加[12-14]。此外，还有研究发现，AhR激活剂可减轻自身免疫性葡萄膜炎模型的炎症反应[15]。肿瘤坏死因子α是致炎作用较强的前炎症因子，其能促使单核巨噬细胞分泌过量的白细胞介素6，二者均能诱导破骨细胞的分化与生成，引发骨吸收[16-17]。许多证据表明，2型糖尿病的发生发展与肿瘤坏死因子α及白细胞介素6的水平呈正相关[18]。白细胞介素10是一种抑炎细胞因子，在调节免疫系统中发挥重要作用，研究显示糖耐量受损或2型糖尿病患者的白细胞介素10水平低于糖耐量正常的患者[19]。此次研究结果显示，正常组中促炎因子肿瘤坏死因子α、白细胞介素6基因表达及炎症细胞浸润水平低于糖尿病各组，而抑炎因子白细胞介素10基因表达高于糖尿病各组，提示高糖状态下骨缺损区炎症反应加剧，这可能与高血糖状态下AhR表达受抑制有关。AhR增强组中肿瘤坏死因子α、白细胞介素6基因表达水平低于空白对照组和阴性对照组，白细胞介素10基因表达水平高于空白对照组和阴性对照组，提示高糖状态下增强AhR表达可减轻骨缺损区炎症反应程度。
骨组织再生Lane-Sandhu 评分的高低可以反映骨缺损区骨形成情况，评分高说明骨形成活跃。碱性磷酸酶作为一种骨形成相关蛋白，可调控骨的形成过程，在2型糖尿病性骨质疏松的发生发展过程中发挥重要作用[20]，其在骨组织中含量增加表明骨生成活跃。在此次研究中，正常对照组Lane-Sandhu 评分及碱性磷酸酶基因表达高于糖尿病各组，提示高血糖会导致骨缺损愈合延迟。AhR增强组中Lane-Sandhu 评分及碱性磷酸酶表达高于空白对照组和阴性对照组，则说明高糖状态下增强表达AhR可以改善缺损区骨组织的愈合水平。
Notch信号通路广泛存在于脊椎动物和非脊椎动物中，在调控细胞发育、分化、增殖和凋亡等方面起重要作用[21]。Notch信号家族由Notch受体、Notch配体和CSL-DNA结合蛋白等构成[22]，其中受体包括Notch1、Notch2、Notch3、Notch4，配体由Delta like(DLL1、DLL3、DLL4)、Jagged1和Jagged2组成。研究证明，Notch信号通路在炎症反应中有重要调节作用，在多种疾病中改变Notch信号通路的激活水平可影响病损部位炎症因子的表达[23-24]。在动物实验中，激活小鼠Notch1信号可诱导巨噬细胞释放炎症递质[25]，脂多糖诱导猪巨噬细胞炎症反应后，配体Jagged1、Jagged2的表达增加[26]，这些研究表明激活Notch信号通路可加剧炎症反应，而Notch1、Jagged1、Jagged2在该通路的信号传导过程中起关键作用。此外，有研究显示Notch1信号可抑制成骨细胞进行体外细胞分化[27]，成骨细胞前体和成熟成骨细胞中Notch1信号的激活会导致骨形成受损，进而导致严重的骨质减少[28]，在成骨细胞分化的早期阶段，Notch通路的激活可抑制成骨细胞的分化，而在成熟的成骨细胞中，激活Notch信号能影响其合成矿化基质的能力[29-30]，在高血糖状态下，该通路的激活同样会使成骨细胞骨生成能力下降[31]。这些研究成果表明，抑制Notch信号通路的激活可提高成骨能力，有利于骨缺损的愈合。此次研究显示，正常对照组Notch1、Jagged1、Jagged2基因表达低于糖尿病各组，提示高血糖状态可能激活了Notch信号通路，导致炎症反应加剧及骨缺损愈合能力降低，而AhR增强组中Notch1、Jagged1、Jagged2基因的表达低于空白对照组和阴性对照组，则提示增强AhR基因表达可抑制骨缺损区炎症反应，提高成骨能力，且该作用可能与Notch信号通路的激活受到抑制有关。
综上所述，实验证明对糖尿病大鼠牙槽骨缺损部位组织增强AhR表达后，局部过度的炎症反应减弱，牙槽骨缺损愈合水平增高，这些作用可能与Notch信号通路激活受到抑制有关。这些研究成果可为改善糖尿病牙槽骨缺损愈合提供新策略。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

增强芳香烃受体表达对糖尿病模型大鼠牙槽骨缺损区愈合及炎症反应的影响

Effect of enhanced aryl hydrocarbon receptor expression on inflammatory response and healing of alveolar bone defects in diabetic rats

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