脂肪与髓核来源间充质干细胞在转化生长因子β1诱导下向类髓核细胞分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.10.020

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (10): 1585-1891.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.10.020

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脂肪与髓核来源间充质干细胞在转化生长因子β1诱导下向类髓核细胞分化

薛晨晖¹，马迅²，关晓明²，张辉¹，张丽²

¹山西医科大学，山西省太原市 030001；²山西医学科学院山西大医院，山西省太原市 030032

出版日期:2015-03-05 发布日期:2015-03-05
通讯作者: 马迅，教授，博士生导师，山西医学科学院山西大医院，山西省太原市 030032
作者简介:薛晨晖，男，1988年生，山西省晋中市人，汉族，山西医科大学在读硕士，主要从事椎间盘组织工程研究。
基金资助:
山西医科大学科技创新基金(01201114)

Mesenchymal stem cells derived from adipose and nucleus pulposus tissue differentiate towards nucleus pulposus-like cells induced by transforming growth factor-beta 1

Xue Chen-hui¹, Ma Xun², Guan Xiao-ming², Zhang Hui¹, Zhang Li²

¹Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China; ²Shanxi Dayi Hospital, Shanxi Academy of Medical Sciences, Taiyuan 030032, Shanxi Province, China

Online:2015-03-05 Published:2015-03-05
Contact: Ma Xun, Professor, Doctoral supervisor, Shanxi Dayi Hospital, Shanxi Academy of Medical Sciences, Taiyuan 030032, Shanxi Province, China
About author:Xue Chen-hui, Studying for master’s degree, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China
Supported by:
the Scientific Innovation Foundation of Shanxi Medical University, No. 01201114

摘要/Abstract

摘要：

背景：大量研究表明多种组织来源的成体干细胞在体外均可向类髓核细胞分化。椎间盘髓核组织来源间充质干细胞在转化生长因子β1诱导下能否向类髓核细胞分化？其分化能力与脂肪间充质干细胞相比是否有差异目前未见报道。

目的：比较脂肪间充质干细胞与髓核间充质干细胞在转化生长因子β1诱导下向类髓核细胞诱导分化能力的差异。

方法：分别取大鼠腹股沟处脂肪组织与尾段脊柱，采用机械酶消化法分离培养脂肪间充质干细胞与髓核间充质干细胞。流式细胞仪检测两种细胞CD105、CD90、CD29、CD45、CD44、CD34、CD24的表达。脂肪间充质干细胞与髓核间充质干细胞各自分为诱导组、无因子诱导组和对照组，诱导组以转化生长因子β1标准软骨诱导液培养，无因子诱导组以不含转化生长因子β1的软骨诱导液培养，对照组以含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养液培养。培养14 d后用RT-PCR检测各组细胞Ⅱ型胶原、蛋白多糖、SOX-9基因的表达。

结果与结论：两种细胞CD105、CD90、CD29表达阳性，CD45、CD44、CD34、CD24表达阴性。向类髓核细胞诱导培养14 d后两种细胞诱导组Ⅱ型胶原、蛋白多糖、SOX-9基因表达水平较对照组均明显升高，差异有显著性意义(P < 0.05)；髓核间充质干细胞诱导组3种基因的表达水平明显高于脂肪间充质干细胞诱导组，差异有显著性意义(P < 0.05)。提示脂肪间充质干细胞与髓核间充质干细胞均具有向类髓核细胞分化的能力，而髓核间充质干细胞相对于脂肪间充质干细胞其软骨相关基因表达更高，可能更适合于作为组织工程髓核研究的种子细胞。

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中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 脂肪干细胞, 髓核间充质干细胞, 椎间盘, 转化生长因子β1, 诱导分化

Abstract:

BACKGROUND: A large number of studies have shown that adult stem cells derived from multiple tissues are available to differentiate towards nucleus pulposus-like cells in vitro. It is unclear whether mesenchymal stem cells derived from nucleus pulposus tissues have the ability to differentiate towards nucleus pulposus-like phenotypes induced by transforming growth factor-beta 1. Up to now, there are few reports on the difference between the differentiation ability of mesenchymal stem cells derived from nucleus pulposus tissues and adipose-derived mesenchymal stem cells.

OBJECTIVE: To compare the ability of mesenchymal stem cells derived from nucleus pulposus tissues and adipose-derived mesenchymal stem cells differentiating into nucleus pulposus-like cells under induction of transforming growth factor-beta 1.

METHODS: The groin fat tissue and the coccygeal spine of rats were taken respectively to isolate and culture mesenchymal stem cells derived from nucleus pulposus tissues and adipose-derived mesenchymal stem cells by mechanical enzyme digestion method. Flow cytometry was employed to detect the expression of CD105, CD90, CD29, CD45, CD44, CD34, and CD24 of both two kinds of stem cells. Mesenchymal stem cells derived from nucleus pulposus tissues and adipose-derived mesenchymal stem cells were divided into complete induction group (complete induction medium with transforming growth factor-beta 1), incomplete induction group (complete induction medium without transforming growth factor-beta 1) and control group(DMEM/F12 containing 10% fetal bovine serum and 100 mg/L penicillin/streptomycin), respectively. After 14 days of culture, real-time PCR was used to detect the expression of collagen type II, Aggrecan and SOX-9 in each group.

RESULTS AND CONCLUSION: CD105, CD90, CD29 expressed positively and CD45, CD44, CD34, CD24 negatively in both two kinds of stem cells. After 14 days of induced differentiation, the expressions of collagen type II, Aggrecan and SOX-9 in the two kinds of cells were significantly higher in the complete induction groups than in the control groups (P < 0.05). Under the induction of transforming growth factor-beta 1, the expression of collagen type II, Aggrecan and SOX-9 in mesenchymal stem cells derived from nucleus pulposus tissues was significantly higher than that in adipose-derived mesenchymal stem cells (P < 0.05). These findings suggest that both two kinds of mesenchymal stem cells have the ability to differentiate towards nucleus pulposus-like cells induced by transforming growth factor-beta, and mesenchymal stem cells derived from nucleus pulposus tissues may be more suitable as seed cells for nucleus pulposus tissue engineering research.

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Key words: Adipose Tissue, Intervertebral Disk, Mesenchymal Stem Cells, Transforming Growth Factor beta1

中图分类号:

R394.2

薛晨晖，马迅，关晓明，张辉，张丽. 脂肪与髓核来源间充质干细胞在转化生长因子β1诱导下向类髓核细胞分化[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(10): 1585-1891.

Xue Chen-hui, Ma Xun, Guan Xiao-ming, Zhang Hui, Zhang Li. Mesenchymal stem cells derived from adipose and nucleus pulposus tissue differentiate towards nucleus pulposus-like cells induced by transforming growth factor-beta 1[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(10): 1585-1891.

图/表（结果） 4

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引言

材料方法

设计：细胞学体外观察实验。

时间及地点：实验于2013年4月至2014年3月在山西医科大学第二医院中心实验室完成。

材料：

实验动物：清洁级雄性SD大鼠，4-6周龄，体质量150-200 g，由山西医科大学动物实验中心提供。脂肪和髓核细胞取自同一只大鼠。

实验方法：

细胞分离、培养与鉴定：

脂肪间充质干细胞的分离培养：无菌条件下切取大鼠腹股沟处脂肪，PBS洗涤3次，剪成1 mm³大小碎块，用0.1%的Ⅰ型胶原酶37 ℃消化2 h，1 000 r/min离心 10 min，弃上清。PBS洗涤3次，加入体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液，按细胞浓度为1×10⁴ L^-¹接种于 25 cm²培养瓶中，置于37 ℃、体积分数为5% CO₂培养箱培养。每3 d换液1次，倒置显微镜观察细胞生长情况。原代培养细胞达到80%-90%融合时，加入0.25%胰蛋白酶消化，计数后按1︰2分瓶传代。

髓核间充质干细胞的分离培养：无菌条件下取出尾段脊柱，收集胶冻状髓核组织并用眼科剪剪成 1 mm³左右碎块，用0.2%Ⅱ型胶原酶37 ℃消化2 h，PBS洗涤3次；再用0.25%胰蛋白酶37 ℃消化15 min，PBS洗涤3次，100目滤网过滤。加入含体积分数为10%胎牛血清的低糖DMEM培养液终止消化，PBS洗涤3次，加入体积分数为10%胎牛血清的低糖DMEM培养液，按细胞浓度为 1×10⁴ L^-¹接种于25 cm²培养瓶中，置于37 ℃、体积分数为5% CO₂培养箱培养。每3 d换液1次，倒置显微镜观察细胞生长情况。原代培养细胞达到80%-90%融合时，加入0.25%胰蛋白酶消化传代，计数后按1︰2分瓶传代。

流式细胞术进行表面免疫表型鉴定：分别取脂肪、髓核来源第3代间充质干细胞，胰蛋白酶消化，每管取1 mL浓度为1×10⁸ L^-¹的细胞，PBS洗涤，弃上清用于标记。每种细胞均设同型对照(IgG1-PE抗体)，其余测定管中分别加入荧光单克隆抗体CD105、CD90、CD29、CD45、CD44、CD34、CD24(荧光染料均为PE)，混匀后室温避光孵育 30 min，PBS清洗，重悬于500 μL PBS(含10 g/L多聚甲醛)，BACKMAN FC500型流式细胞仪检测。根据同型对照的荧光强度设定阴性细胞群阈值，观察各组阳性细胞表达率及荧光强度。

向类髓核细胞诱导分化能力比较：

实验分组：实验分为6组，分别为脂肪间充质干细胞对照组、脂肪间充质干细胞无因子诱导组、脂肪间充质干细胞诱导组、髓核间充质干细胞对照组、髓核间充质干细胞无因子诱导组、髓核间充质干细胞诱导组。

诱导组培养基：①脂肪间充质干细胞完全诱导培养基：SD大鼠脂肪来源干细胞成软骨分化基础培养基 97 mL、Dexamethasone 10 μL、Ascorbate 300 μL、ITS+ Supplement 1 mL、Sodium Pyruvate 100 μL、Proline 100 μL、转化生长因子β1 1 mL。②髓核间充质干细胞完全培养基：SD大鼠骨髓来源干细胞成软骨分化基础培养基97 mL、Dexamethasone 10 μL、Ascorbate 300 μL、ITS+Supplement 1 mL、Sodium Pyruvate 100 μL、Proline 100 μL、转化生长因子β1 1 mL。

无因子诱导组培养基：各诱导组培养液去除其中转化生长因子β1。

对照组培养基：含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基。

向类髓核细胞诱导分化方法：分别取脂肪、髓核来源第3代间充质干细胞，胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，细胞计数板计数，转移到15 mL离心管中，1 000 r/min离心5 min，弃上清，每7.5×10⁵个细胞用1 mL不完全诱导液重悬，1 000 r/min离心5 min，弃上清，用完全诱导液以5× 10⁸ L^-¹的细胞浓度重悬，每0.5 mL细胞悬液分装入15 mL离心管中，1 000 r/min离心5 min，将离心管盖拧紧后松开半圈，置 37 ℃、体积分数为5%CO₂、饱和湿度培养箱中静置24 h。每两三天完全换液，换液后轻弹离心管底部，使细胞球悬浮。每两三天换液1次，按照时间分组连续诱导14 d。

SYBR green法荧光定量PCR分析：诱导完成后，以Trizol法提取各组细胞总RNA，测定RNA浓度，按照RT试剂盒说明书将RNA反转录为cDNA，按照SYBR green荧光定量RT-PCR试剂盒说明，反应体系为：2×SYBR Premix Ex Taq 10 μL，Rox DyeⅡ 0.4 μL，上游引物 0.8 μL，下游引物 0.8 μL，cDNA 2 μL，去离子水6 μL。反应条件：90 ℃预变性10 s，随后90 ℃变性5 s，60 ℃延伸40 s，共40个循环。

采用??Ct法，即以β-actin为内参照基因，计算各样品?Ct(目的基因Ct-内参基因Ct)，设定某一正常对照?Ct值为校正样品，计算??Ct(各样品?Ct-校正品?Ct)，某样品的目的基因mRNA相对表达量(RQ)可用如下公式计算：RQ=2^-^??Ct，每一样品均设2个重复孔，计算其均值。每次PCR反应后均进行熔解曲线分析以确认扩增产物的特异性。

目的基因和内参照基因的引物序列如下：蛋白多糖(ACAN)引物序列如下：上游引物5’-CCA CTG GAG AGG ACT GCG TAG-3’，下游引物5’- GGT CTG TGC AAG TGA TTC GAG -3’。Ⅱ型胶原(COL2A1)引物序列如下：上游引物5’-GGA AGA GTG GAG ACT ACT GGA TTG AC-3’，下游引物5’-TCC ATG TTG CAG AAA ACC TTC A-3’。Sex-determining region Y box 9 (SOX-9)引物序列如下：上游引物5’- AGG AAG CTG GCA GAC CAG TAC C-3’，下游引物5’- GGG TCT CTT CTC GCT CTC GTT CA-3’。内参基因β-actin引物序列如下：上游引物：5’- TCC TAG CAC CAT GAA GAT C-3’，下游引物：5’-AAA CGC AGC TCA GTA ACA G-3’。

主要观察指标： ①脂肪间充质干细胞与髓核间充质干细胞的形态。②脂肪间充质干细胞与髓核间充质干细胞表面免疫表型。③脂肪间充质干细胞与髓核间充质干细胞诱导后Ⅱ型胶原、蛋白多糖、SOX-9基因的表达。

统计学分析：应用SPSS 21.0统计软件进行统计分析。多个样本均数比较采用单因素方差分析，两组均数比较采用LSD-t 检验。检验水准为α=0.05。

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讨论

椎间盘退变在骨科临床实践中较为常见，易引发腰腿痛。传统手术治疗方法虽在一定程度上缓解患者痛苦，但改变了脊柱结构生物力学，加快了邻近椎体进行性退变等并发症^[6]，且不能从根本上修复椎间盘髓核细胞退变等原有组织生理状态^[7]。

近年来，通过细胞或髓核移植等生物学治疗方法修复椎间盘退变成为脊柱外科基础研究的热点之一。大量体内外研究表明，干细胞在延缓甚至逆转椎间盘退变方面具有巨大潜力。在许多动物实验中，利用干细胞注射的方法观察其在小鼠、大鼠、兔、犬、猪、牛的退变椎间盘模型中的作用，均得到了令人兴奋的结果^[8-21]。经注射入退变椎间盘的干细胞不但能够生存、增殖，而且其中一部分可向类椎间盘细胞分化，促进了椎间盘中基质的合成，使其高度及含水量显著增加^[8^，¹⁴^，^2-23]。虽然干细胞修复退变椎间盘的作用机制仍没有被全面的了解，但是一些学者推测，干细胞向类椎间盘细胞的分化作用是其中一项主要机制^[24]。髓核细胞外基质主要由胶原纤维和蛋白聚糖构成，髓核细胞的主要功能是分泌胶原蛋白和酸性黏多糖^[25]，其中Ⅱ型胶原占大部分，它和聚集蛋白聚糖、SOX-9被认为是髓核细胞的特征性标志^[26]，且在国内外众多学者的研究当中作为干细胞向类髓核细胞诱导分化的评定标准^[4-5,21]。转化生长因子β是体外诱导干细胞向类髓核细胞分化最常用的方法之一。Risbud等^[27]以包含转化生长因子β1的培养基在低氧条件下将固定在海藻酸水凝胶上的骨髓间充质干细胞体外诱导分化为类髓核细胞表型，这些细胞表达蛋白多糖、Ⅱ型胶原、SOX9等髓核细胞主要的转录产物^[26]，证实了转化生长因子β具有在体外诱导干细胞向类髓核细胞分化的能力。Feng等^[18]在低氧条件下观察了转化生长因子β1结合3D支架诱导兔骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化的情况，结果显示髓核相关基因如蛋白多糖、Ⅱ型胶原、SOX-9表达上调，髓核特异性标志物HIF-1α持续表达，细胞外基质黏多糖和Ⅱ型胶原的沉积增多。本研究将两种不同来源的干细胞分别在含转化生长因子β1的培养基中培养，两种细胞均表现出蛋白多糖、Ⅱ型胶原、SOX9表达增高，证实转化生长因子β1具有在体外将SD大鼠脂肪间充质干细胞向类髓核细胞诱导分化的作用，且表明其作用对于髓核间充质干细胞同样有效。

脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干细胞是两种广泛应用于组织工程的种子细胞，许多动物实验及体外研究均表明这两种来源的干细胞拥有修复退变椎间盘的潜能^[12-14^，^28-29]。然而，骨髓间充质干细胞在临床应用中又存在诸多问题，如细胞采集率低、采集方式创伤较大、穿刺部位的疼痛与感染等。相对于骨髓间充质干细胞，脂肪间充质干细胞拥有取材方便，提取方法简单、体外增殖能力强、对供体造成的创伤相对小、获得的细胞数量较大，且不涉及伦理问题等优点。Clarke等^[5]将人骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞分别在含有转化生长因子β3、GDF5或GDF6三种不同的诱导液中培养14 d，结果显示转化生长因子β3、GDF5和GDF6细胞因子均可促进人骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞向类髓核细胞分化，而且相对于转化生长因子β3和GDF5，GDF6可以带来更高的髓核细胞标志物表达、蛋白多糖与Ⅱ型胶原表达比例，更多的黏多糖沉积，而脂肪间充质干细胞相对于骨髓间充质干细胞作用更加明显。还有学者发现脂肪间充质干细胞比骨髓间充质干细胞更能耐受无血清引起的凋亡，其增殖能力更强^[30]，这些研究结果显示脂肪间充质干细胞比骨髓间充质干细胞更适合应用于组织工程椎间盘的研究与应用。

2010年，Blanco等^[31]发现在退变椎间盘组织中存在具备多项分化潜能、形态均一的纺锤梭形细胞，并证实这些细胞几乎符合国际细胞治疗协会(international society for cellular therapy，ISCT)有关间充质干细胞的所有界定标准^[32]，这为髓核来源间充质干细胞作为一种内源性干细胞应用于退变椎间盘的修复提供了可能。关晓明等^[33]发现在先天脊柱侧凸及椎间盘退变患者的椎间盘组织中均存在髓核间充质干细胞，相对于退变组，侧凸组的髓核间充质干细胞具有更强的细胞代谢活性及增殖能力，两组细胞成脂、成软骨分化能力无差别，然而，与Blanco等^[31]的结果类似，两组细胞均无成脂分化能力。本实验在转化生长因子β1诱导条件下，将髓核间充质干细胞与脂肪间充质干细胞在体外向类髓核细胞分化的能力进行对比分析，结果显示，培养14 d后两种细胞诱导组Ⅱ型胶原、蛋白多糖、SOX-9基因表达水平较对照组均有明显升高，其中Ⅱ型胶原与SOX-9基因的表达水平在髓核间充质干细胞诱导组明显高于脂肪间充质干细胞诱导组。这表明脂肪间充质干细胞与髓核间充质干细胞均具有在转化生长因子β1诱导下向类髓核细胞分化的能力，而髓核间充质干细胞相对于脂肪间充质干细胞其软骨相关基因表达更高，更适合作为组织工程髓核研究的种子细胞。髓核间充质干细胞作为椎间盘内源性干细胞，为将来无创刺激内源性干细胞进行椎间盘退行性病变的修复提供了可能。

椎间盘拥有以低氧、低糖、低pH、高渗透压为特点的内环境。有研究显示，脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干细胞缺乏在体外模拟椎间盘高渗透压环境中生存、增殖、合成细胞外基质的能力^[34-35]，那么存在于椎间盘髓核组织内的髓核间充质干细胞对椎间盘中这种苛刻环境的适应能力是否更强？在这种低氧、低糖、低pH、高渗透压的环境下，其生存、增殖以及向类髓核细胞诱导分化的能力是否更强？这些都有待于进一步的研究。

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中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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脂肪与髓核来源间充质干细胞在转化生长因子β1诱导下向类髓核细胞分化

Mesenchymal stem cells derived from adipose and nucleus pulposus tissue differentiate towards nucleus pulposus-like cells induced by transforming growth factor-beta 1

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