低氧诱导因子1α基因修饰脐血间充质干细胞移植治疗脊髓缺血再灌注损伤

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.10.021

摘要/Abstract

摘要：

背景：脊髓缺血再灌注损伤目前尚无有效治疗手段，多数研究集中于干细胞移植治疗。

目的：观察肾下腹主动脉移植低氧诱导因子1α基因修饰的脐血间充质干细胞对脊髓缺血再灌注损伤大鼠的治疗作用。

方法：30只成年SD雌性大鼠随机分为3组：对照组，未转染组，基因转染组，每组10只。手术阻断肾下腹主动脉1 h后恢复脊髓再灌注，分别经腹主动脉置管推注1 mL 10%PBS，1 mL脐血间充质干细胞悬液， 1 mL低氧诱导因子1α修饰的脐血间充质干细胞悬液。术后1，6，12 d对大鼠进行BBB评分，Western blot法检测脊髓组织低氧诱导因子1α蛋白的表达，术后12 d行运动诱发电位测定。

结果与结论：与对照组比较，未转染组和基因转染组大鼠BBB评分均显著升高(P < 0.05)，脊髓组织低氧诱导因子1α蛋白表达明显上调(P < 0.05)，运动诱发电位潜伏期缩短(P < 0.05)，波幅增加(P < 0.05)。与未转染组比较，基因转染组BBB评分明显升高(P < 0.05)，脊髓组织低氧诱导因子1α蛋白表达上调(P < 0.05)，运动诱发电位潜伏期缩短(P < 0.05)，波幅增加(P < 0.05)，结果表明低氧诱导因子1α修饰的脐血间充质干细胞治疗脊髓缺血再灌注损伤效果更加显著。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 移植, 脐血间充质干细胞, 低氧诱导因子1α, 缺血再灌注损伤, 脊髓

Abstract:

BACKGROUND: There are no available therapies for spinal cord ischemia-reperfusion injury, and stem cell transplantation is a focused topics.

OBJECTIVE: To observe the therapeutic effect of hypoxia-inducible facotr-1α gene-modified umbilical cord blood mesenchymal stem cells (UC-MSCs) transplanted via the infrarenal abdominal aorta on spinal cord ischemia-reperfusion injury in rats.

METHODS: Thirty adult female Sprague-Dawley rats were randomly divided into three groups, with 10 rats in each group. The infrarenal abdominal aorta of rats was occluded surgically for 1 hour, and then the spinal cord reperfusion was restored. At 2 hours after reperfusion, 1 mL of 10% PBS, UC-MSCs suspension and hypoxia-inducible factor-1α-modified UC-MSCs suspension was injected via the infrarenal abdominal aorta, respectively, in the three groups. At 1, 6, 12 days after injection, Basso-Beattie-Bresnahan scores were recorded and western blot assay was used to detect hypoxia-inducible factor-1α protein expression in the spinal cord. The motor-evoked potential was determined at 12 days after injection.

RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, the Basso-Beattie-Bresnahan scores were significantly higher (P < 0.05), the expression of hypoxia-inducible factor-1α protein in the spinal cord tissue was significantly increased (P < 0.05), the motor-evoked potential latency was shortened (P < 0.05) and the amplitude was increased (P < 0 .05) in the untransfected group and transfection group. Compared with the untransfected group, the Basso-Beattie-Bresnahan scores were significantly higher (P < 0.05), the expression of hypoxia-inducible factor-1α protein in the spinal cord tissue was significantly increased (P < 0.05), the motor-evoked potential latency was shortened (P < 0.05) and the amplitude was increased (P < 0 .05) in the transfection group. Above all, umbilical cord blood mesenchymal stem cell transplantation modified by hypoxia-inducible factor 1α has better effects on spinal cord ischemia-reperfusion injury.

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Key words: Cord Blood Stem Cell Transplantation, Hypoxia-Inducible Factor 1, alpha Subunit, Reperfusion Injury, Spinal Cord

中图分类号:

R394.2

樊志刚，师瑞红. 低氧诱导因子1α基因修饰脐血间充质干细胞移植治疗脊髓缺血再灌注损伤[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(10): 1592-1596.

Fan Zhi-gang, Shi Rui-hong . Hypoxia-inducible factor-1alpha gene-modified umbilical cord blood mesenchymal stem cells transplantation in the treatment of spinal cord ischemia-reperfusion injury [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(10): 1592-1596.

图/表（结果） 4

2.1 脐血间充质干细胞形态倒置显微镜下可见，培养初期胞体小且呈圆形(图1A)，6 d以后逐渐变为椭圆，胞体变大(图1B)，12 d(第3代)后向两级伸出凸起，为长梭形(图1C)。

2.2 脐血间充质干细胞流式细胞仪鉴定结果流式细胞仪检测结果显示，CD34、CD45的阳性率不足9%，提示大部分人脐血间充质干细胞不是造血干细胞。CD19和CD86阳性率少于10%，CD90、CD105阳性率高于70%，主要组织相容性复合体HLA-ABC的阳性率为90%以上，HLA-DR阳性率低于5%，结果提示人脐血间充质干细胞和骨髓间充质干细胞的细胞表型相似。

2.3 实验动物数量分析参与的实验大鼠共30只，全部进入结果分析，实验中无脱落。

2.4 动物行为学评价结果术后1 d各组大鼠肢体功能障碍最为显著，各组间评分差异无显著性意义(P > 0.05)；随着时间延长，与对照组相比，未转染组和基因转染组肢体功能存在不同程度恢复，BBB评分明显升高(P < 0.05)；在术后6 d和12 d时基因转染组BBB评分也显著高于未转染组(P < 0.05)，结果提示，经低氧诱导因子1α修饰的脐血间充质干细胞更能促进脊髓缺血再灌注损伤的恢复，见表1。

2.5 脊髓组织低氧诱导因子1α蛋白的表达与对照组比较，未转染组和基因转染组低氧诱导因子1α蛋白在1，6 d时表达上调(P < 0.05)；12 d时低氧诱导因子1α蛋白表达无明显改变(P > 0.05)；与未转染组比较，基因转染组低氧诱导因子1α蛋白在1，6 d时表达显著升高(P < 0.05)；12 d时低氧诱导因子1α蛋白表达无明显变化(P > 0.05)，即低氧诱导因子1α蛋白表达在第6天时到达高峰，提示低氧诱导因子1α作为一种缺氧状态下的保护因子，在移植治疗的初期对脊髓缺血再灌注损伤的重要性，见表2。

2.6 运动诱发电位测定结果与对照组比较，未转染组和基因转染组术后12 d运动诱发电位潜伏期缩短(P < 0.05)，而波幅增强 (P < 0.05)；与未转染组比较，基因转染组潜伏期缩短更为明显(P < 0.05)，波幅显著升高 (P < 0.05)，提示干细胞移植尤其是低氧诱导因子1α基因修饰的干细胞移植更加有利于脊髓缺血再灌注损伤的功能恢复，见表3。

参考文献

[1]Mauney MC, Blackbourne LH, Langenburg SE,et al. Prevention of spinal cord injury after repair of the thoracic or thoracoabdominal aorta.Ann Thorac Surg. 1995;59(1): 245-252.
[2]Hall ED, Braughler JM.Role of lipid peroxidation in post-traumatic spinal cord degeneration: a review.Cent Nerv Syst Trauma. 1986;3(4):281-294.
[3]Dietz V, Curt A.Neurological aspects of spinal-cord repair: promises and challenges.Lancet Neurol. 2006;5(8):688-694.
[4]Ballard VL.Stem cells for heart failure in the aging heart.Heart Fail Rev. 2010;15(5):447-456.
[5]袁传顺,陆超,陈吉庆. 骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的可塑性研究[J].医学综述,2007,13(5):321-323.
[6]步星耀,黄志起,张永福.骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤的研究现状[J].中国临床康复,2006,10(21):183-185.
[7]Gong G, Yuan LB, Hu L,et al.Glycyrrhizin attenuates rat ischemic spinal cord injury by suppressing inflammatory cytokines and HMGB1.Acta Pharmacol Sin. 2012;33(1): 11-18.
[8]王涛,谢百发,李露斯. 大鼠脊髓缺血再灌注损伤后炎性细胞因子的变化及其意义[J].中国临床康复,2006,10(28):88-90.
[9]Majmundar AJ, Wong WJ, Simon MC.Hypoxia-inducible factors and the response to hypoxic stress.Mol Cell. 2010; 40(2):294-309.
[10]Xiaowei H, Ninghui Z, Wei X,et al.The experimental study of hypoxia-inducible factor-1alpha and its target genes in spinal cord injury.Spinal Cord. 2006;44(1):35-43.
[11]孙艳,段芳龄,陈香宇,等. 体外诱导人脐血间充质干细胞向肝细胞样细胞分化的研究[J].胃肠病学和肝病学杂志,2004,13(3): 239-243.
[12]王君,张振,张玉明,等.大鼠低氧诱导因子-1α基因转染骨髓间充质干细胞的实验研究[J].现代生物医学进展,2010,10(20): 3838-3841.
[13]肖博晗,陈强,杨东旭,等.髓缺血再灌注损伤模型改进的研究[J].中国实验诊断学,2009,13(6):747-749.
[14]Basso DM, Beattie MS, Bresnahan JC.Descending systems contributing to locomotor recovery after mild or moderate spinal cord injury in rats: experimental evidence and a review of literature.Restor Neurol Neurosci. 2002;20(5):189-218.
[15]赵俊暕,陈乃耀,石峻,等.人脐血间充质干细胞移植对创伤性脑损伤大鼠VEGF分泌及血管新生的影响[J].中国神经免疫学和神经病学杂志,2013,20(4):267-273.
[16]郑志娟,庄文欣,付文玉. 人脐带间充质干细胞的研究进展[J].解剖科学进展,2008,14(1):100-104.
[17]田晓宁.脐血干细胞的特性及其临床应用[J].中国组织工程研究与临床康复,2009,13(36):7197-7200.
[18]Bjugstad KB, Teng YD, Redmond DE Jr,et al.Human neural stem cells migrate along the nigrostriatal pathway in a primate model of Parkinson's disease.Exp Neurol. 2008;211(2): 362-369.
[19]Sanders RD, Xu J, Shu Y,et al.Dexmedetomidine attenuates isoflurane-induced neurocognitive impairment in neonatal rats.Anesthesiology. 2009;110(5):1077-1085.
[20]Sanders RD, Sun P, Patel S,et al.Dexmedetomidine provides cortical neuroprotection: impact on anaesthetic-induced neuroapoptosis in the rat developing brain.Acta Anaesthesiol Scand. 2010;54(6):710-716.
[21]Pucilowska J, Puzerey PA, Karlo JC,et al.Disrupted ERK signaling during cortical development leads to abnormal progenitor proliferation, neuronal and network excitability and behavior, modeling human neuro-cardio-facial-cutaneous and related syndromes.J Neurosci. 2012;32(25):8663-8677.
[22]Brusnahan SK, McGuire TR, Jackson JD,et al.Human blood and marrow side population stem cell and Stro-1 positive bone marrow stromal cell numbers decline with age, with an increase in quality of surviving stem cells: correlation with cytokines.Mech Ageing Dev. 2010;131(11-12):718-722.
[23]孔令胜,于如同,聂冬丽,等. HIF-1α基因修饰神经干细胞移植对大鼠损伤脊髓NF200和GFAP表达的影响[J].中国临床神经外科杂志,2009,14(8):483-487.
[24]Le QT, Giaccia AJ.HIF-alpha, a gender independent transcription factor.Clin Cancer Res. 2003;9(7):2391-2393.
[25]Semenza GL. HIF-1, O(2), and the 3 PHDs: how animal cells signal hypoxia to the nucleus.Cell. 2001;107(1):1-3.
[26]Himes BT, Neuhuber B, Coleman C,et al. Recovery of function following grafting of human bone marrow-derived stromal cells into the injured spinal cord.Neurorehabil Neural Repair. 2006;20(2):278-296.
[27]Hofstetter CP, Schwarz EJ, Hess D,et al.Marrow stromal cells form guiding strands in the injured spinal cord and promote recovery.Proc Natl Acad Sci U S A. 2002;99(4):2199-2204.
[28]Li Y, Chopp M.Marrow stromal cell transplantation in stroke and traumatic brain injury.Neurosci Lett. 2009;456(3): 120-123.
[29]Chen J, Zhang ZG, Li Y,et al.Intravenous administration of human bone marrow stromal cells induces angiogenesis in the ischemic boundary zone after stroke in rats.Circ Res. 2003;92(6):692-699.

引言

脊髓缺血再灌注损伤是指在脊髓和主动脉瘤等手术过程中因脊髓血管结构的破坏和脊髓水肿而导致脊髓缺血，局部神经元和胶质细胞缺血缺氧，发生中心性坏死^[1]。恢复血液再灌注后，局部组织因自由基释放、电解质紊乱及炎症反应，出现微循环障碍，细胞缺血缺氧加重，形成恶性循环^[2]，最终导致脊髓结构和功能严重障碍^[3]。脊髓缺血再灌注损伤目前尚无有效治疗手段，多数研究集中于干细胞移植治疗，脐血间充质干细胞(human umbilical cord blood mesenchymal stem cells，HUMSCs)是从脐血中分离出来，较祖细胞更原始，有更强的增殖分化能力^[4]，在体内和体外都能分化为中枢神经系统细胞^[5]，是目前用于治疗神经疾病包括脊髓损伤^[6]、脑损伤、脑缺血、老年痴呆等的常用细胞。脐血间充质干细胞免疫原性低，不易触发免疫反应或引起移植物抗宿主病，因此正逐步成为骨髓间充质干细胞的理想替代物，有更大的应用潜能。

动物实验发现炎性反应以及氧化应激反应在脊髓缺血再灌注损伤中起着重要作用^[7-8]。而低氧诱导因子1α (hypoxia-inducible factor-la，HIF-1α)是一种核转录因子，在低氧环境中表达量增加，可提高组织对缺氧的耐受，还可促进红细胞生存和新生血管生成^[9]。有研究表明，促进脊髓损伤大鼠脊髓组织低氧诱导因子1α表达及其靶基因上调，以增强神经细胞对缺氧的耐受，从而减轻脊髓损伤^[10]。本实验观察低氧诱导因子1α基因修饰的脐血间充质干细胞移植治疗脊髓缺血再灌注损伤的效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2014年7至10月在郑州大学干细胞研究中心完成。

材料：

实验动物：雌性SD大鼠30只，清洁级，体质量220- 250 g，用于脊髓缺血再灌注损伤造模，购自河南省实验动物中心，实验中对动物的处置符合动物伦理学要求。

实验方法：

脐血间充质干细胞的分离培养：脐血来自于郑州市妇幼保健医院产妇志愿捐献的足月妊娠顺产婴儿，参照文献[11]采用密度梯度离心法获取脐血间充质干细胞，将分离的细胞以5×10⁹ L^-¹接种于含体积分数为20%胎牛血清的DMEM/F12培养液中培养。取第3代细胞用于后续实验。

脐血间充质干细胞的鉴定：将第3代脐血间充质干细胞调整为细胞浓度1×10⁶ L^-¹的细胞悬液，用流式细胞仪进行细胞表面标志的测定。细胞分别与鼠抗人的FITC-CD90、PE-CD86、FlTC-CD45、PE-CD19、FITC-CD105、PE-HLA-DR、FITC-HLA-ABC和PE-CD34抗体反应，在 4 ℃的暗室中放置30 min。以鼠抗人PE/FITC-IgG1为平行对照。数据用Cell Quest软件处理。

低氧诱导因子1α基因转染细胞：将第3代脐血间充质干细胞用0.25%胰酶消化离心后，加入无血清培养基，制备成1 mL单细胞悬液(1×10⁹ L^-¹)，加入足量pcDNA3.1- HIF-1α质粒(约2 μg)充分混匀，用细胞电融合仪电穿孔转染(电压180 V，脉宽40 μs)^[12]。转染后放入孵箱中培养48 h，移植当天，用无血清培养基重悬细胞，调整细胞浓度为1×10¹² L^-¹，置于冰上待移植用。同时制备细胞浓度为1×10¹² L^-¹的单纯脐血间充质干细胞悬液，置于冰上待移植用。

脊髓缺血再灌注损伤模型的制备和分组：成年雌性SD大鼠30只，随机分为对照组、未转染组和基因转染组，每组10只。所有动物以3.6%的水合氯醛(10 mL/kg)腹腔内注射麻醉，术中根据大鼠体动和呼吸情况半量追加水合氯醛以维持麻醉效果。大鼠左侧后肢根部消毒去毛，剪开皮肤显露股动脉，向股动脉穿刺置入24号动脉套管针，接压力传感器，

监护仪检测股动脉平均压。采用肾下腹主动脉阻断法制备脊髓缺血再灌注损伤模型^[13]，纵向切开左侧腹部皮肤，钝性分离后腹膜，显露并游离左肾动脉及其上、下各1.5 cm长的腹主动脉，以4号丝线结扎肾下腹主动脉，阻断血供 60 min后开放。阻断时，以股动脉压力波形消失、远端动脉压≤10 mm Hg (1.33 kPa)为标准；开放时以股动脉压力波形恢复为标准。脊髓再灌注5 min后，将股动脉套管针推至肾下腹主动脉，暂时夹闭右侧股动脉，对照组向套管针内缓慢推注10% PBS 1 mL，未转染组向套管针内推注 1 mL脐血间充质干细胞悬液(1×10⁶个)，基因转染组推注 1 mL 低氧诱导因子1α修饰的脐血间充质干细胞悬液(1×10⁶个)。术毕认真检查手术部位，没有渗血后逐层缝合。所有大鼠术后每天腹腔注射青霉素20×10⁴ U预防感染。

神经行为学评价：采用Basso等^[14]提出的BBB评分体系于术后1，6，12 d对各组大鼠进行行为学评估，包括0-21级，完全功能缺失为0分，完全功能正常为21分，评价内容包括大鼠后肢运动、躯干位置及稳定性、步态、协调性、爪的置放、足趾间隙以及尾的位置等。由2位熟悉评分标准的非本组实验人员完成评分，评分时间为10 min，评分后取平均值。

Western blot法检测脊髓组织低氧诱导因子1α表达：治疗后1，6，12 d每组各取2只大鼠处死，冰上切取L₂_-₅脊髓组织，用冰生理盐水洗去残血，液氮中冻存备用。加入组织裂解液，冰浴1 h，冰上制成匀浆，将匀浆液移入1.5 mL EP管中，15 000×g离心15 min。取上清，用酶标仪测定蛋白浓度。上清液中加入1/4体积的5×上样缓冲液，95 ℃加热5 min，冰浴5 min。取20 μg总蛋白上样液进行SDS-PAGE，上样后40 V恒电压电泳，待溴盼蓝至浓缩胶与分离胶交界处，换恒电压100 V电泳，使溴盼蓝全部电泳出分离胶底部。全湿转式将分离胶上的蛋白转移至硝酸纤维素膜上。硝酸纤维素膜在室温下用脱脂奶粉封闭1 h，兔抗低氧诱导因子1α单克隆抗体(稀释度1∶1 000)4 ℃孵育过夜。PBS洗3次×10 min，加二抗室温孵育，在摇床上剧烈摇动1 h，PBS洗3次×10 min，显色液显色。采用Image J图像分析软件分析条带灰度值，以目的条带灰度值与β-actin灰度值的比值反映低氧诱导因子1α表达。

运动诱发电位测定：治疗后12 d，将各组受试动物(每组4只)清醒状态俯卧位固定于检查台上，磁力板中心置于大脑皮质运动区，表面电极通过导电膏黏附于大鼠耳朵作为地线，记录电极置于待检侧腓肠肌，正负电极间距为 1 cm。采用TMS刺激仪，以40%的刺激量单次刺激大脑皮质运动区，信号采集系统自动记录波形。重复刺激3-5次，将磁刺激后有可重复的波形存于电脑中并打印，标记潜伏期和波幅。

主要观察指标： ①术后1，6，12 d各组大鼠BBB评分。②术后1，6，12 d各组大鼠脊髓组织低氧诱导因子1α蛋白的表达。③术后12 d各组大鼠运动诱发电位。

统计学分析：采用SPSS 13.0统计学软件进行分析，正态分布的计量资料以x(_)±s表示，组间及组内比较采用单因素方差分析，检验标准为α=0.05。

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讨论

脐血中含有丰富的造血干细胞和间充质干细胞^[15]，是近几年来发现的一类具有与骨髓干细胞相同的多向分化潜能的原始祖细胞，并且脐血来源间充质干细胞容易获取、能有效表达外源基因。与其他来源干细胞相比，脐血来源更广泛，脐血中淋巴细胞的免疫功能不够成熟，免疫原性较弱，移植物抗宿主病发生率较低^[16-17]，脐血中间充质干细胞也易于分离^[18-21]。

有研究将含有低氧诱导因子1α的pcDNA3.1质粒转染入脐血间充质干细胞后^[22]，转染效率约为34%，可满足实验要求。本研究参照文献[23]，选择细胞量为1× 10⁹ L^-¹脐血间充质干细胞于脊髓缺血再灌注损伤早期进行动脉注射移植，为治疗脊髓缺血再灌注损伤提供了新的路径。

低氧诱导因子1α作为低氧应答时基因表达和维持细胞内氧环境稳定的调节中枢^[24-25]，是一种具有转录活性的核蛋白，它与增强脊髓组织细胞的缺氧耐受能力，促进脊髓新生血管形成的机制密切相关。脐血间充质干细胞易于进行转基因操作并可携带多个外源基因且有高水平的表达，是进行基因治疗的良好载体。有研究表明，脐血间充质干细胞可分泌神经营养因子和提供具有保护和修复作用的细胞外基质^[26]，本研究早期移植低氧诱导因子1α基因转染的脐血间充质干细胞，其神经行为学较未转染组和对照组都有显著改善，低氧诱导因子1α蛋白的表达也较未转染组和对照组有明显提高，在6 d时达到高峰，可见低氧诱导因子1α蛋白有利于早期对缺血缺氧组织的保护，12 d时低氧诱导因子1α蛋白表达量的下降可能与缺血组织血液供应的恢复有关，这些结果提示低氧诱导因子1α基因修饰的脐血间充质干细胞减轻大鼠脊髓缺血再灌注损伤的效应强于脐血间充质干细胞。

间充质干细胞移植后可在损伤脊髓中存活、生长和分化，并形成神经连接促进神经功能恢复^[27]，其机制涉及：①间充质干细胞可自分泌或者旁分泌神经营养因子，产生神经细胞保护作用，促进损伤的神经功能恢复^[28]。②间充质干细胞可分化为神经元，修复损伤组织，新生的神经元可大量合成低氧诱导因子1α，减轻脊髓组织损伤^[29]。③间充质干细胞还可提高轴突的再生能力，阻止脱髓鞘，促使髓鞘再生和脊髓修复。低氧诱导因子1α基因修饰的脐血间充质干细胞移植至脊髓组织，低氧诱导因子1α基因可大量合成蛋白，减轻了脊髓组织损伤，

综上所述，经肾下腹主动脉移植脐血间充质干细胞能明显促进脊髓缺血再灌注损伤大鼠的功能恢复，但是脐血间充质干细胞移植入体内后是一个复杂的微环境，研究尚处于初级阶段，其作用的可控性、具体机制、脐血间充质干细胞和低氧诱导因子1α的脊髓保护作用是否有协同作用及二者共同的促修复通路有哪些等等问题还有待进一步细致深入的研究。