基因强化骨组织工程中的病毒载体

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.02.021

摘要/Abstract

摘要：

背景：不同的基因输送策略也被应用到骨组织工程中以修复破坏的骨组织，作为最有效率的基因转运载体，病毒载体在骨组织工程中的应用方兴未艾。
目的：系统回顾和讨论目前基因强化骨组织工程中常用的病毒载体相关应用。
方法：利用PubMed数据库对2002年1月至2015年1月的相关文献进行了检索，检索的文章主要聚焦在病毒载体基因转导方法和其在骨组织工程中的应用。对腺病毒、反转录病毒、腺相关病毒和嵌合病毒在骨组织工程的相关应用及不足进行了讨论。总共24篇相关文献被纳入此篇综述。
结果与结论：总结了近年来病毒载体联合基因治疗促进骨组织再生的研究工作。讨论了包括装载目的基因的病毒载体联合种子细胞例如间充质干细胞植入支架材料修复骨缺损。研究表明，基因强化的骨组织工程比传统组织工程具有更多的优点；病毒载体介导的基因转染效率比普通载体更高；病毒载体介导的基因强化骨组织工程用于人体的安全性仍需要漫长的临床观察研究。病毒载体系统仍然是最有效的将外源基因转入种子细胞的手段之一。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 骨组织工程, 基因, 病毒, 病毒载体

Abstract:

BACKGROUND: Various gene-delivery strategies have be used to transfer targeted genes into damaged bone tissues. As the most efficient gene vector, viral delivery systems have been used in bone tissue engineering research.
OBJECTIVE: To thoroughly discuss the applications of different viral vectors in gene-enhanced bone tissue engineering.
METHODS: A computer-based online search was performed in PubMed database for the related articles from January 2002 to January 2015. This review centered on viral vector transduction methods and their use in bone tissue engineering. Adenovirus, retrovirus, adeno-associated virus and chimeric virus were all discussed. Advantages and limitations of different vectors and their applicability toward bone tissue engineering were presented in this article. A total of 24 articles were included for review.
RESULTS AND CONCLUSION: Current viral vectors for gene delivery in gene-enhanced bone tissue engineering are summarized, including recent work where combinatorial gene therapy is used to express groups of genes to stimulate bone regeneration. Future directions for this field are discussed, where viral vectors mediated gene expression systems will be combined with cells such as mesenchymal stem cells seeded in synthetic scaffolds to repair bone loss. Gene-enhanced bone tissue engineering has more advantages than traditional tissue engineering; viral vectors contribute to higher gene transfection efficiency than normal vectors. Long-term clinical observation is needed for the safety of viral vectors used in gene-enhanced tissue engineering in the body. Viruses are still the most efficient means by which exogenous genes can be introduced into seeds cells.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: Genes, Viruses, Gene Therapy

中图分类号:

R318

肖振涛，郭中凯，郭立新. 基因强化骨组织工程中的病毒载体[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(2): 272-276.

Xiao Zhen-tao, Guo Zhong-kai, Guo Li-xin . Different viral vectors in gene-enhanced bone tissue engineering[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(2): 272-276.

图/表（结果） 1

2.1 反转录病毒载体反转录病毒包括白血病病毒、慢病毒和泡沫病毒等，其借助于外膜蛋白中的表面蛋白(SU)与靶细胞表面受体的相互作用，吸附于靶细胞上，暴露跨膜蛋白(TM)中的融合肽段，并与靶细胞的细胞膜融合，病毒感染进入细胞中^[5-6]。在细胞浆，病毒的基因组能同细胞的基因组进行组合，并且能感染多种人与动物宿主细胞，具备成为基因载体的良好条件。

Anjos-Afonso等^[8]用携带GFP报告基因的来源于人类免疫缺陷病毒的慢病毒载体(pHRSINcPPT-SEW)，在人脾泡沫病毒长末端重复序列(LTR)控制下，用其转染经过纯化的小鼠骨髓基质干细胞，在MOI为50的时候，其转染效率达98%，在转染后的35-40 d测定发现大于96.5%的细胞仍表达绿色荧光蛋白，这也提示SFFV启动子并不能使转染细胞的报告基因沉默。为了评估此种反转录病毒是否对体外间充质干细胞的分化产生影响，研究人员通过诱导间充质干细胞往不同细胞类型方向分化研究发现，此种反转录病毒并未对间充质干细胞多向分化的潜力产生影响。

Sugiyama等^[9]构建了分别含鼠白血病病毒(RhMLV)启动子和巨细胞病毒(CMV)启动子的慢病毒载体，在启动子下游插入绿色荧光蛋白(EGFP)或骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)基因序列后转染鼠骨髓间充质干细胞，1周后细胞转染效率达到了90%，ELISA检查增强绿色荧光蛋白及骨形态发生蛋白2稳定表达水平持续8周以上。在此基础上，研究人员将转染Lenti-RhMLV-BMP-2后的骨髓间充质干细胞植入免疫缺陷小鼠的后肢肌肉中，3周后可以观察到植入部位明显的骨发生现象，而Lenti-RhMLV- EGFP和Lenti-CMV-BMP-2转染的骨髓间充质干细胞植入组几乎看不见骨发生，因此研究人员认为在MLV启动子控制下的携带骨形态发生蛋白2基因的慢病毒载体在体外能够长期诱导目的基因表达，在体内能有效促进骨的形成。

为了提高反转录病毒载体的转染效率，研究人员将病毒颗粒的外膜糖蛋白进行修饰，以重新决定其亲嗜性。Tober等^[10]用水泡性口炎病毒G蛋白代替Env蛋白包装反转录病毒核衣壳，构成假病毒转染骨髓间充质干细胞，结果细胞的转染效率明显提高。在此基础上研究人员再用RD114-GP代替Env蛋白，同VSV-GP进行对比实验后通过RT-PCR和FACS检测后发现，前者转染效率至少高出后者10倍以上，因此认为对外膜蛋白进行何种修饰对提高基因转染效率起着重要的作用。尽管反转录病毒是具备具有宿主细胞类型广泛、基因插入容量大的特点，特别是其整合入细胞基因组，使外源基因长期稳定表达的优点使其在遗传、肿瘤领域应用较广，但由于其可能与人体内源病毒发生重组、导致靶细胞基因突变甚至癌变等缺陷，故其在骨组织工程中的应用有所局限，近年来也慢慢被其他更安全的病毒载体取代。

2.2 腺病毒载体腺病毒是一种无包膜的DNA病毒，20世纪80年代，美国冷泉港实验室的Solnick首先报道应用腺病毒转移外源基因，此后腺病毒逐步发展成为一种重要的基因治疗载体系统。其主要优势在于基因转染效率高，病毒滴度高，并且易于制备和操作，外源基因独立于靶细胞染色体之外表达，不会引起细胞基因组的突变，因此腺病毒载体是目前骨组织工程中应用最为广泛的载体之一。组织缺损的基因治疗策略见图1^[11]。

国外很多研究都是利用腺病毒作为目的基因载体转染细胞后诱导细胞成骨分化或血管等组织发生，以达到修复组织缺损的目的。Partridge等^[12]构建了携带骨形态发生蛋白2基因的腺病毒载体AxCAOBMP-2，将其转染肌源性C2C12细胞后8 d后检测到细胞骨形态发生蛋白2蛋白分泌，将转染后的C2C12细胞复合到聚乳酸-羟基乙酸共聚物多孔支架上进一步培养，6周后检测碱性磷酸酶活性显著升高，Ⅰ型胶原阳性表达，提示C2C12细胞往成骨细胞分化。类似的实验，但是更侧重于载体和支架材料结合方面^[13]，实验构建了含CMV启动子的腺病毒携带骨形态发生蛋白2目的基因，将其转染入(人齿龈纤维原细胞)后分别与羟基磷灰石、聚乳酸、PPF-TCP材料支架复合后植入小鼠体内，4周后取出通过CT检查可观察到有不同程度的新骨形成，但是随着支架材料性质及孔径大小的不同骨发生的面积和密度也不相一致。

Ghasemi等^[14]用删除E1和E3区的5型腺病毒构建了AxCAKBMP-3b和AxCAOBMP-2，293细胞脂质体法扩增携带目的基因的病毒载体，将其分别和共同转染C2C12细胞，通过碱性磷酸酶测定，WesternBlot检测，影像学分析发现共同转染组诱导成骨效应远远高于其他单一载体转染组，因此认为骨形态发生蛋白3b和骨形态发生蛋白2在成骨方面可能有相互促进的作用。

为了进一步提高腺病毒在组织工程中感染的效率和靶向性，研究人员根据腺病毒的结构特点建立CAR(细胞表面腺病毒受体)非依赖的特异感染途径，通过分子生物学手段对腺病毒的衣壳蛋白进行修饰。Naghdi等^[15]对5型腺病毒的衣壳蛋白knob结构域的HI环处融合一段Arg-Gly-Asp (RGD)肽段，构建AxCAhlacZ-F/RGD(实验组)后和野生型腺病毒AxCAhlacZ- F/wt(对比组，lacZ为报告基因)，用二者转染间充质干细胞后发现前者在ED25(达到25%细胞有效转染时的感染复数)为后者的1/10，意味着在相同MOI时实验组的转染效率远高于对比组。用骨形态发生蛋白基因取代lacZ进行间充质干细胞转染，ELISA测定发现AxCAhBMP2-F/RGD组目标蛋白定量比AxCAhBMP2- F/wt高21倍。在此基础上，研究人员将转染AxCAhBMP2-F/RGD的间充质干细胞复合羟基磷灰石支架植入小鼠皮下，并设立对照组进行异位诱导成骨实验，进行相关指标测定和统计分析，认为实验组成骨效果远优于对照组。由此认为经过修饰后的Adv-F/RGD有可能成为骨组织工程中高效的基因载体。与反转录病毒相比，腺相关病毒的优势在于导致基因突变概率显著降低，与腺相关病毒相比，腺病毒的优势在于容易制备，并且外源基因容量更大，因此尽管腺病毒存在免疫原性强、基因组结构复杂等缺点，但目前仍然是最广为应用的载体之一。

2.3 腺相关病毒腺相关病毒是一种细小病毒的单链DNA病毒，大多数人血清均为腺相关病毒阳性，但并不致病。其包含rep和cap二个基因，分别编码病毒复制和装配所必须的蛋白。在感染后可以特异性地整合到人细胞19号染色体q13.3和qter之间的位点。腺相关病毒的复制依赖于腺病毒或疱疹病毒的存在，并需要腺病毒E1和E4蛋白的刺激。由于其介导的外源基因可以整合到人染色体上进行长期稳定表达，并可感染多种非分裂期的类型细胞，并具备免疫原性和毒性低，致病性弱的诸多优点，近年来成为研究的热点^[16-18]。

Jazwa等^[19]构建了单侧后肢缺血的SD大鼠模型，分别动脉注射AAV-VEGF，AAV-lacZ和PBS，4周后注射AAV-VEGF组肌肉氧分压与后侧正常肢体接近，提示缺血侧血供改善。一次动脉注射后4周及8周在SD大鼠后侧肢体肌肉均可检测到血管内皮生长因子目的基因表达，然而通过RT-PCR进行DNA扩增可以发现在远处组织也能检测到病毒基因表达，提示该法可能造成病毒基因的系统扩散，但是病毒基因的表达水平似乎与血清中血管内皮生长因子的水平无关。

Tu等^[20]将AAV2中病毒开放读取框架(ORF)删除，插入鸡β-actin启动子、CMV增强子、WPRE增强子，包括病毒复制必须的CIS在内的长约145bp长度的表达元件插入ITRs制备pAM/CAG-WPREBGH-polyA。然后将全长大鼠骨形态发生蛋白4 cDNA克隆至pAM/CAG- WPREBGH-polyA载体XhoI和EcoRI两个位点之间，PCR扩增。在PCR亚克隆，骨形态发生蛋白4 cDNA序列5’末端连接Kozak序列加强骨形态发生蛋白4基因表达。将构建好的携带骨形态发生蛋白4目的基因的AAV2载体转染C2C12细胞，并以增强绿色荧光蛋白基因设立对照组。转染6 d后进行观察，发现实验组细胞显型往成骨细胞方向分化，而对照组则往成肌细胞方向分化。同时进行碱性磷酸酶活性pNPP量化测量并进行统计分析，认为实验组碱性磷酸酶活性远远高于对照组活性。就生物安全性而言，腺相关病毒在目前已知的病毒载体中有着无可比拟的优越性，但其主要缺点是在于由于成熟病毒颗粒的产生需要腺病毒或疱疹病毒的协助，因此得到高滴度纯化的腺相关病毒较为困难，此外病毒对外源基因的容量较小，仅为4.1-4.9 kb。这两点局限了腺相关病毒作为载体的应用。

2.4 嵌合病毒载体如上所述，现有的病毒载体在基因转导中都有不尽如人意之处，因此，近年来开始出现尝试将两种或两种以上的病毒载体的结构进行组合，形成嵌合病毒载体，充分利用这些病毒的优点，来提高基因转导和表达效率^[21-23]。Chen等^[24]将携带骨形态发生蛋白2目的基因的AAV-BMP2(5×10¹¹VP)和AAV-BMP2/ Ad-BMP2(鸡尾酒载体系统，AAV：5×10¹¹ VP，Ad：5×10⁸ VP)分别进行SD鼠后肢肌肉内注射，8周用X射线结合ImageQuan分析注射部位骨形成的面积及密度，发现AAV-BMP2/Ad-BMP2组成骨面积是AAV-BMP2组的2倍，骨密度是其3倍。同时通过免疫组化检测目的基因蛋白表达，发现“鸡尾酒病毒载体系统”仍然具有腺相关病毒长时间表达目的基因骨形态发生蛋白2的优点。此外，研究人员还进行了淋巴细胞检测，两组注射部位都未出现明显CD4⁺和CD8⁺T淋巴细胞浸润。由此他们认为低浓度的腺病毒辅助腺相关病毒能够获得更好的成骨效果并且具备良好的生物安全性。

Yang等^[25]构建能表达Rap和Cap的重组I型单纯疱疹病毒HSV-1后用其感染BHK-21细胞，然后再用纯化pSNAV-hBMP7质粒转染BHK-21包装细胞，组成HSV-1/AAV-BMP7嵌合载体，克服了前者不能兼容外源启动子的缺点，又避免了后者包装效率低，制备困难的不足。用其转染C2C12细胞，12 d后能够检测到骨钙素分泌和Cbfal mRNA 表达上调。28 d后能够检测到细胞产生骨形态发生蛋白7蛋白，碱性磷酸酶检测阳性。证明HSV1/AAV-BMP7嵌合载体可以稳定的表达目的基因，促使成肌细胞来源的C2C12细胞往成骨细胞系转化。目前嵌合病毒载体更多的用于其他医学领域，在骨组织工程方面的应用研究方兴未艾。

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引言

由于创伤、疾病、肿瘤等原因造成的骨缺损需要更有效的方法予以修复，但是无论是现有的还是新兴的治疗方法治疗骨缺损仍然有许多不足之处。随着现代基因强化组织工程的飞速发展，骨缺损可以通过基因治疗的手段予以修复。

基因强化组织工程(Gene-enhanced Tissue Engineering)是利用基因工程技术将目的基因转入人工组织的细胞或基质，使转染细胞或基因修饰后的基质表达目的基因编码的细胞因子，从而实现人工组织功能化^[1-3]。其与传统组织工程相比的优势在于能够克服生长因子单纯同支架材料与种子细胞复合修复组织缺损存在易受血液稀释、酶解、释放时间及浓度不易控制等缺陷，是组织工程近年来的研究方向，其关键技术环节之一在于基因载体能否成功、高效的将目的基因转导进入种子细胞。

在国外基因强化组织工程的初期探索中，研究人员将不同的基因转导策略运用到了组织工程中，在早期研究人员将含目的基因的载体直接通过血管注入实验动物体内，从而使其在全身组织分布，这种基因转导策略针对的是修复不能直接或难于直接接触的体内组织，但是其缺陷显而易见：①基因表达效率低。②达到治疗目的所需载体滴度大。③高滴度的载体可能对机体带来危害。④不能有效修复某些没有血供的组织(如软骨和半月板)^[4]。基于上述原因，目前在组织工程研究中的基因转导策略主要为局部基因转导，其可以分为体内和体外两种方法。前者通过将带有目的基因的载体直接注射进入血管或局部组织以获得目的基因在组织的表达，但仍有无法控制基因表达的风险；体外法是将目的基因通过载体转导入不同细胞内，将细胞进行培养体外，再将细胞微囊化或同支架材料复合后植入体内组织^[3]。与体内法相比，体外法具有安全、高效等优点，是实验及应用研究的主要趋势。但无论体内还是体外法，合适的基因载体都是不可或缺，故对其的研究也相应成为基因强化组织工程领域的热点。

目前基因强化组织工程中所用的载体分为病毒载体和非病毒载体两类，与非病毒基因载体相比，病毒载体由于其具有转移效率高、可整合调控等优点而在基因强化组织工程得到了广泛应用，目前用做基因转移的载体病毒有RNA病毒(反转录病毒)和DNA病毒两类，后者又包括腺病毒、腺相关病毒(Adeno-associated virus，AAV)、单纯疱疹病毒等^[5-7]。不同类型的病毒载体在治疗应用种具有不同的优势和缺点，研究者可依据基因转移和表达的不同要求加以选择。文章仅对近年病毒载体在骨组织工程中的相关应用作一综述。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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