神经营养因子3纳米微球载体基因工程转染许旺细胞

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.08.006

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (8): 1362-1366.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.08.006

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神经营养因子3纳米微球载体基因工程转染许旺细胞

宗海斌¹，贾金领²，董玉珍²，周慧聪²

1新乡医学院基础医学院机能实验室，河南省新乡市 453003
2 新乡医学院第一附属医院骨外科，河南省卫辉市 453100

收稿日期:2012-04-21 修回日期:2012-05-30 出版日期:2013-02-19 发布日期:2013-02-19
通讯作者: 董玉珍，博士，副主任医师，副教授，新乡医学院第一附属医院骨外科，河南省卫辉市 453100 dongyuzhen1998@163.com
作者简介:宗海斌，男，1969年生，上海市人，汉族，1992年河南理工大学毕业，讲师，主要从事神经损伤后的再生与康复研究。 laohai0044@163.com

Transfection of Schwann cells with neurotrophic factor-3 nanoparticles

Zong Hai-bin¹, Jia Jin-ling², Dong Yu-zhen², Zhou Hui-cong²

1 Skill Laboratory of Basic Medical Science of Xinxiang Medical College, Xinxiang 453003, Henan Province, China
2 Department of Orthopedics, the First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical College, Weihui 453100, Henan Province, China

Received:2012-04-21 Revised:2012-05-30 Online:2013-02-19 Published:2013-02-19
Contact: Dong Yu-zhen, Doctor, Associate chief physician, Associate professor, Department of Orthopedics, the First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical College, Weihui 453100, Henan Province, China dongyuzhen1998@163.com
About author:Zong Hai-bin, Lecturer, Skill Laboratory of Basic Medical Science of Xinxiang Medical College, Xinxiang 453003, Henan Province, China laohai0044@163.com

摘要/Abstract

摘要：

背景：纳米微球基因转染技术携带或增强种植细胞可持续稳定延长其释放，保持其活性和作用时间。
目的：观察纳米微球载体转染神经营养因子3基因修饰的许旺细胞对坐骨神经缺损的促进和修复作用。
方法：采用纳米微球载体将神经营养因子3基因转染入体外培养的新生Wistar大鼠许旺细胞。取Wistar成年大鼠80只制作坐骨神经缺损模型，将4种不同的移植物注入细胞外基质凝胶-聚乳酸聚羟基乙酸共聚物管桥接管内：空白对照组未注入其他任何物质，细胞组注入许旺细胞，基因组注入神经营养因子3基因，实验组注入神经营养因子3基因修饰的许旺细胞。
结果与结论：术后坐骨神经及肌纤维横截面积染色比较，实验组优于细胞组、基因组(P < 0.01)，细胞组、基因组均优于空白对照组(P < 0.01)，细胞组、基因组组间比较差异无显著性意义(P > 0.05)。表明神经营养因子3基因转染许旺细胞移植，可相互促进，再造神经再生的微环境，促进并修复缺损坐骨神经缺损。

关键词: 生物材料, 纳米生物材料, 基因工程, 纳米微球载体, 神经营养因子3, 许旺细胞, 神经缺损, 省级基金, 生物材料图片文章

Abstract:

BACKGROUND: The technology of nanoparticle carrier transferring gene can carry or enhance plant cell
sustainable stability, extend its release and maintain its activity and duration.
OBJECTIVE: To explore the effects of nanoparticle carrier with neurotrophic factor-3 on transfection of Schwann cells in facilitating and repairing sciatic nerve defects.
METHODS: The neurotrophic factor-3 genes were transfected to the Schwann cells of newborn Wistar rats with nanoparticle carrier. Eighty adult Wistar rats were selected to make the sciatic nerve defect model. Then four kinds of grafts were injected into the pipe bridge takeover of extracellular matrix gel-poly( lactide-co-glycolide): the blank control group was not injected with other substances, the cell group was injected with Schwann cells, the gene group was injected with neurotrophic factor-3 gene, and the experimental group was injected with neurotrophic factor-3 gene modified Schwann cells.
RESULTS AND CONCLUSION: The staining of sciatic nerve and muscle fiber cross-sectional area was better in the experimental group than in the cell group and gene group (P < 0.01), which was better in the cell and gene groups than the blank control group (P < 0.01); but, there was no significant difference between the cell group and gene group (P > 0.05). It indicated that neurotrophic factor-3 gene modified Schwann cells transplantation can reconstruct the microenvironment of nerve regeneration and promote repair of sciatic nerve defects.

Key words: biomaterials, nano-biomaterials, genetic engineering, nanoparticle carrier, neurotrophic factor-3, Schwann cells, nerve defects, provincial grants-supported paper, biomaterial photographs-containing paper

中图分类号:

R318

宗海斌，贾金领，董玉珍，周慧聪. 神经营养因子3纳米微球载体基因工程转染许旺细胞[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(8): 1362-1366.

Zong Hai-bin, Jia Jin-ling, Dong Yu-zhen, Zhou Hui-cong. Transfection of Schwann cells with neurotrophic factor-3 nanoparticles[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(8): 1362-1366.

图/表（结果） 5

2.1 许旺细胞纯度检测 神经营养因子3经纳米微球载体转染第3代许旺细胞后，细胞生长速度加快，突起互相结网明显，成片分布、首尾相连，胞体大部呈双极形，胞体及突起呈棕褐色，少量纤维细胞为淡染或者透明的蓝色，见图1A。而正常培养的第3代许旺细胞开始萎缩呈椭圆形，数目明显减少，部分死亡细胞漂浮在培养液表面，见图1B。

2.2 基因转染前后许旺细胞神经营养因子3水平检测结果 神经营养因子3转染组于不同时期神经营养因子3水平高于对照组(P < 0.01)，见图2。

2.3 各组大鼠腓肠肌肌肉组织学检查结果 术后1，4周各组腓肠肌横截面积结构无明显变化。术后8周时，实验组腓肠肌横截面积结构清晰、肌纤维粗大，呈正常肌肉结构；空白对照组则肌纤维萎缩变细，肌束间结缔组织增生，细胞组、基因组两组腓肠肌横截面积介于空白对照组、实验组之间，实验组均优于细胞组、基因组(P < 0.01)，后两组组均优于空白对照组(P < 0.01)，而细胞组、基因组相比差异无显著性意义(P > 0.05)。术后12周时，实验组肌横截面积结构更清晰、肌纤维更接近正常，空白对照组萎缩更明显，见图3。

2.4 各组坐骨神经光镜下观察结果 术后12周光镜观察实验组再生神经纤维密集、规则，有较多的营养血管分布，而周围瘢痕纤维少见；空白对照组则神经纤维稀疏，有较多的瘢痕纤维组织，营养血管较少见。细胞组、基因组两组的变化介于空白对照组、实验组之间，两者差别不大，见图4。

空白对照组再生轴突数、髓鞘厚度、神经纤维平均直径均低于细胞组、基因组(P < 0.01)，细胞组、基因组差异无显著性意义(P > 0.05)；细胞组、基因组又显著低于实验组(P < 0.01)，见表1。

参考文献

引言

材料方法

设计：随机对照实验，基因工程、分子生物学、干细胞、免疫组织化学观察。
时间及地点：于2010年1月至2011年1月在新乡医学院第一附属医院神经学科中心完成。
材料：
实验动物：成年Wistar大鼠，雌雄不拘，体质量180-200 g；新生3 d龄Wistar大鼠2只，体质量80-100 g，由新乡医学院动物实验中心提供，许可证号：SCXK(豫)2006-0001。
试剂和仪器：
Reagents and instruments:

实验方法：
许旺细胞的获取：取3 d龄新生Wistar大鼠，用戊巴比妥钠(30 mg/kg)行腹腔内注射麻醉后，显微镜下切取双侧坐骨神经，采用胰酶和胶原酶消化法、贴壁法培养、纯化、1∶3传代后，留取第3代的许旺细胞实验用。
纳米微球-质粒(pcDNA3)-NT3载体及移植复合体的构建：人真核细胞质粒(pcDNA3)-NT3基因取25 μL以磷酸盐缓冲液稀释至50 μL，与10 mmol/L纳米微球50 μL涡旋振荡混匀，静置30 min，加0.8 mL无血清培养液至纳米微粒-DNA混合液中，按说明操作将培养液G418筛选(质量浓度为200 mg/L)，每3 d换液1次，共筛选12 d。转染入已鉴定的许旺细胞(按照生物公司试剂说明进行)，继续细胞培养、扩增、鉴定，构建神经移植复合体。
神经营养因子3质粒转入前后许旺细胞纯度的检测：转染前许旺细胞分别经过G418的多次筛选，观察转染前后许旺细胞生长速度，并经倒置相差显微镜观察生长形态和死亡情况。
转染基因前后神经营养因子3含量的测定：分别于神经营养因子3转染后3 d、1周、2周、4周、6周、8周取标本，与转染前标本作为实验组和对照组对比。标本用 40 g/L多聚甲醛溶液4 ℃固定2 h，经生理盐水洗涤等后续处理，置入300 g/L蔗糖溶液过夜，在空气中干燥 30 min。采用ABC法染色后，采用Tiger图像分析仪对各组进行定量评价。
动物模型制作及分组干预：取Wistar成年大鼠80只，行腹腔内注射麻醉后消毒、铺巾，在16倍显微镜下游离左侧坐骨神经，切断并切除远端10 mm长的神经干制成坐骨神经缺损的模型。随机分为4组，每组20只：空白对照组进行细胞外基质与PLGA管桥接修复坐骨神经缺损；细胞组行1×10⁸L^-1许旺细胞、细胞外基质凝胶与PLGA桥接修复；基因组行神经营养因子3基因、细胞外基质凝胶与PLGA桥接修复；实验组行神经营养因子3基因修饰的许旺细胞(1×10⁸L^-1)、细胞外基质凝胶与PLGA桥接修复。方法为将许旺细胞、神经营养因子3分别与等体积的细胞外基质混合后，用微量注射器抽取20 μL注入PLGA桥接管内。
肌纤维横截面积的检测：术后1，4，8，12周4组各取大鼠5只，取腓肠肌组织标本用40 g/L多聚甲醛溶液4 ℃固定2 h，经生理盐水洗涤等处理，组织在固定冰冻切片厚约5 μm，常规苏木精-伊红染色，采用TJTY-300图像分析测量肌纤维横截面积。
坐骨神经组织甲苯胺蓝染色光镜观察：术后12周切取大鼠坐骨神经移植体远端的神经段，经固定后，制成厚约20 μm半薄切片，用甲苯胺蓝染色，作光镜观察采用图像分析，计数有髓神经纤维数目、轴突直径、髓鞘厚度，然后进行统计学比较。
主要观察指标：各组坐骨神经组织学观察及肌纤维横截面积比较。
统计学分析：采用SPSS 12.0统计软件包进行分析。数据均以x(_)±s表示。单因素方差分析Turkey进行多样本均数的两两比较；组间比较采用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

周围神经损伤后48 h便可以发生神经元的变化，促进休眠状态的许旺细胞分裂和增生，释放轴突诱导因子，合成和释放多种神经营养和蛋白活性因子等。但实验说明纤维蛋白在坐骨神经损伤后沉积，改变了细胞外基质的组成，抑制许旺细胞的迁移^[2]。Vander zee等^[3-4]将许旺细胞移植至周围神经损伤部位可诱导感觉和运动神经轴突发芽，而且局部胶质细胞分泌的神经营养因子在局部可以诱导许旺细胞向损伤部位迁移。失神经支配的最大变化是神经营养因子丢失后肌肉形态结构等发生改变。外源性神经营养因子3是神经元在胚胎期及发育期成活和发育所必需的蛋白质，促进神经嵴细胞进行有丝分裂并诱导其分化，防止神经元程序性死亡可阻止轴突和运动终板退变，调节发育的神经肌肉突触的功能^[5]。Baker等^[6-7]研究发现提高神经元内外源性神经营养因子3水平可以加强运动神经元的营养，并上调神经营养因子3的TrkC受体表达；还能减少脑损伤后骨骼肌细胞凋亡和继发性损伤。

但神经营养因子3生物活性蛋白在体内极易被稀释或降解失活、吸收率低。基因工程为神经营养因子的临床应用提供了新的思路和途径^[8]。纳米微球是一种用于药物和基因治疗的控释体系转运载体，可以携载各种基因片断，保护基因不被核酸酶降解，提高靶向性，可持续稳定延长其释放并保持其活性和作用时间，起到了载负生物因子使之与周围组织均匀接触、诱导周围细胞增殖分化、作为组织生长支架促进组织生长的三重作用。体外降解和模拟释药实验表明合成的纳米微球具有可降解性，稳定、无毒、易包裹浓缩，高生物亲和性，实现基因治疗的特异性，同时具有允许基因缓慢释放，有效延长作用时间，转染效率高，无免疫排斥反应等特点^[9-10]。

实验结果显示：经纳米微球载体神经营养因子3基因成功转染入许旺细胞，并检测转染后纯度远高于转染前的第3代许旺细胞，两者比较差异有显著性意义 (P < 0.05)。检测运动神经传导速度、轴突再生的相关形态学及肌纤维横截面积等指标，表明实验组较基因组及细胞组的结果要优良得多，后两组相比则无明显差异；而此3组均优于空白对照组。研究认为神经营养因子3能有效促进许旺细胞的增殖，具有相互促进作用，能促进神经再生和延缓修复肌肉萎缩。因此，应用纳米微球作为载体将神经营养因子3基因成功高效转入许旺细胞，再造神经再生的微环境，为从基因和组织工程技术方面治疗脑中枢、脊髓和周围神经损伤提供了理论基础。

基金资助：2010年河南省教育厅自然科学研究计划课题(2010A320010)。
作者贡献：董玉珍进行实验设计，实验实施为宗海斌、贾金领、董玉珍、周慧聪，实验评估为董玉珍、周慧聪，资料收集为宗海斌、董玉珍、周慧聪，宗海斌成文，董玉珍审校，董玉珍对文章负责。
利益冲突：课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组织直接或间接的经济或利益的赞助。
伦理要求：实验过程中对动物的处置符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。
作者声明：文章为原创作品，数据准确，内容不涉及泄密，无一稿两投，无抄袭，无内容剽窃，无作者署名争议，无与他人课题以及专利技术的争执，内容真实，文责自负。

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Transfection of Schwann cells with neurotrophic factor-3 nanoparticles

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