体外构建组织工程骨-软骨复合组织

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.08.005

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (8): 1354-1361.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.08.005

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体外构建组织工程骨-软骨复合组织

邓天政¹，吕晶¹，杨捷绯²，柯杰¹

1解放军空军总医院口腔科，北京市 100142
2解放军空军指挥学院门诊部，北京市 100089

收稿日期:2012-09-10 修回日期:2012-10-09 出版日期:2013-02-19 发布日期:2013-02-19
通讯作者: 柯杰，主任医师，解放军空军总医院口腔科，北京市 100142 kejie630331@163.com
作者简介:邓天政☆，男，1977年生，天津市人，汉族，2008年解放军第四军医大学毕业，博士，主治医师，主要从事组织工程研究。dengtzh@163.com

In vitro fabrication of tissue engineering osteochondral composites

Deng Tian-zheng¹, Lü Jing¹, Yang Jie-fei², Ke Jie¹

1 Department of Stomatology, Air Force General Hospital of Chinese PLA, Beijing 100142, China
2 Outpatient Department, Air Force Command College of Chinese PLA, Beijing 100089, China

Received:2012-09-10 Revised:2012-10-09 Online:2013-02-19 Published:2013-02-19
Contact: Ke Jie, Chief physician, Department of Stomatology, Air Force General Hospital of Chinese PLA, Beijing 100142, China kejie630331@163.com
About author:Deng Tian-zheng☆, Doctor, Attending physician, Department of Stomatology, Air Force General Hospital of Chinese PLA, Beijing 100142, China dengtzh@163.com

摘要/Abstract

摘要：

背景：设计一体化、具有过渡结构的双层支架材料，复合软骨细胞、骨髓间充质细胞，有利于新生的骨与软骨组织之间形成良好界面。
目的：模仿自然骨-软骨基质构建复合支架，以软骨细胞和骨髓间充质干细胞为种子细胞，体外观察复合组织的成软骨及成骨能力。
方法：制备明胶-硫酸软骨素-透明质酸及明胶-陶瓷化骨多孔复合支架，构建自然骨-软骨基质复合支架，复合兔软骨细胞与骨髓间充质干细胞，分未成骨诱导与成骨诱导两组培养，并进行MTT、糖胺多糖含量、碱性磷酸酶活性检测，以及苏木精-伊红染色检测。
结果与结论：未成骨诱导与成骨诱导两组骨髓间充质干细胞增殖及糖胺多糖含量差异无显著性意义。未成骨诱导组碱性磷酸酶活性缓慢上升，成骨诱导组诱导后碱性磷酸酶活性迅速上升，14 d时达到稳定状态。两组苏木精-伊红染色结果无明显区别，均已形成含有双层组织的类似骨-软骨样组织，其间可见未降解支架形态，但由于基质形成不完善及支架未完全降解，此种结构不成熟，细胞分布不均匀，支架内部可见散在无细胞区域。证实采用两种细胞与双层结构的支架经体外分层复合能够形成组织工程骨软骨复合组织。

关键词: 生物材料, 组织工程骨材料, 明胶, 硫酸软骨素, 透明质酸, 复合支架, 组织工程, 骨软骨, 骨髓间充质干细胞, 碱性磷酸酶, 软骨细胞, 国家自然科学基金, 生物材料图片文章

Abstract:

BACKGROUND: To design an integrated and biphasic scaffold that is cocultured with chondrocytes and bone marrow mesenchymal cells is beneficial to form good interface between bone and cartilage tissue.
OBJECTIVE: To construct a bilayered scaffold based on imitating natural osteochondral matrix that is cocultured with chondrocyte and bone marrow mesenchymal stem cells as seed cells so as to observe the chondrogenic and osteogenic capacity of the composite tissue.
METHODS: Gelatin-chondroitin sulfate-hyaluronic acid and gelatin-ceramic bone porous scaffolds were prepared to be cocultured with chondrocytes and bone marrow mesenchymal stem cells for osteogenic induction or non-osteogenic induction. MTT, glycosaminoglycan, alkaline phosphatase and hematoxylin-eosin staining were detected.
RESULTS AND CONCLUSION: MTT results showed the bone marrow mesenchymal stem cell proliferation and glycosaminoglycan contents had no statistical difference between the osteogenic induction and non-osteogenic induction groups. Alkaline phosphatase activity increased gradually in the non-osteogenic induction group, but increased rapidly in the osteogenic induction group that became stable at 14 days. No significant difference was found in the results of hematoxylin-eosin staining between the two groups. Osteochondral-like tissues were found in the two groups with non-degradable scaffolds. Cell-free regions were scattered within the scaffolds owing to the incomplete matrix formation and scaffold degradation. This study proved that these two kinds of seed cells cocultured with the bilayer scaffold in vitro can form tissue engineering osteochondral composite tissues.

Key words: biomaterials, tissue engineering bone materials, gelatin, chondroitin sulfate, hyaluronate, composite scaffolds, tissue engineering, osteochondral, bone marrow mesenchymal stem cells, alkaline phosphatase, chondrocytes, the National Natural Science Foundation of China, biomaterial photographs-containing paper

中图分类号:

R318

邓天政，吕晶，杨捷绯，柯杰. 体外构建组织工程骨-软骨复合组织[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(8): 1354-1361.

Deng Tian-zheng, Lü Jing, Yang Jie-fei, Ke Jie. In vitro fabrication of tissue engineering osteochondral composites[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(8): 1354-1361.

图/表（结果） 4

2.1 自然骨-软骨基质复合支架的理化性能定 扫描电镜下观察可见软骨层支架孔径大小及分布均较均匀呈多边形，孔间相互交通，孔径大小100-150 μm。骨层支架孔径呈板层状排列呈长方形，孔径大小300-400 μm，其上被覆薄层均匀致密胶原膜。软骨层孔隙率为(78.0±1.1)%，骨层孔隙率为(65.9±1.2)%。支架抗压性能结果显示，支架具有良好地韧性，随支架被压缩，未出现破碎，抗压强度最高达到250 N。

2.2 MTT检测骨-软骨支架复合种子细胞诱导前后的骨髓间充质干细胞活性 MTT法测定A值绘制的生长曲线结果显示，无诱导方案组与成骨诱导组细胞第3天开始明显增殖，第6天达到增殖高峰，并进入平台期，细胞增殖组间比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图1。

2.3 骨-软骨支架复合种子细胞诱导前后的糖胺多糖含量检测 无诱导方案组与成骨诱导组糖胺多糖含量第3天开始逐渐增高，第6天后达到高峰，7 d后糖胺多糖含量增高不明显，组间比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图2。

2.4 骨-软骨支架复合种子细胞诱导前后的碱性磷酸酶活性检测 无诱导方案组碱性磷酸酶活性缓慢上升；成骨诱导组诱导后，碱性磷酸酶活性迅速上升，14 d时达到稳定状态，见图3。

2.5 骨-软骨支架复合种子细胞诱导前后的苏木精-伊红染色 体外培养2周后行苏木精-伊红染色，两组结果无明显区别，见图4，均已形成含有双层组织的类似骨-软骨样组织，其间可见未降解支架形态，但由于基质形成不完善以及支架未完全降解，此种结构不成熟，细胞分布不均匀，支架内部可见散在无细胞区域。

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引言

炎症、肿瘤、外伤甚至人体体质量的增加可加大关节负载，导致骨关节炎、关节缺损等疾病。构建具有解剖形态的组织工程骨-软骨复合组织是组织工程研究领域的一大挑战，对修复关节部分甚至全部缺损具有重要的临床意义和应用前景，组织工程技术正向着解决此类疾病进行不断尝试。理想的骨-软骨复合组织应该模拟正常关节的主要结构，包括内部结构和表面形态^[1-2]。这种结构可以将自体软骨细胞和成骨细胞复合到三维支架中，从而能够为组织细胞间的接触生长提供相互支撑，并为后续的体内移植提供可能^[3-4]。以往有关骨-软骨复合组织构建的研究大部分只是为了证实骨-软骨复合组织构建的可能性^[5]，对其生物学性能等研究尚不深入。构建组织工程化骨-软骨复合组织的临床目的就是希望能够在体内形成有效的骨-软骨组织，从而能够发挥其应有功能^[6]。组织工程骨-软骨复合组织是组织工程领域中重要的研究方向之一，其组织构建与形成遵循组织工程的基本原理与方法，但由于是复合组织因此有其特殊性^[7]。组织工程骨-软骨复合组织的最终目标就是重建一个功能性的替代装置来修复缺损的正常组织，其在细胞及生化水平的组成，以及组织层次上还有生物力学方面和行为功能等方面都能够替代正常组织^[8]。正常的骨-软骨组织特性包括软骨和骨及周围组织，还要根据组织工程技术的需要进一步研究^[9]。

实验制备的组织工程骨-软骨复合组织，利用自体骨髓间充质干细胞和软骨细胞复合至预先设计好的双层支架上，形成具有生物活性的骨-软骨组织。以此种方式制备的复合组织具有多中心矿化成骨及软骨细胞分泌基质并聚集的生物特点，可以在体外高效形成复合组织。该种方式制备的组织有多种因素影响其最终组织的形成，而双层支架与不同细胞间的作用与影响是其中关键因素。实验模拟天然骨-软骨基质成分制备明胶-硫酸软骨素-透明质酸-明胶-陶瓷化骨多孔复合支架，同时采用原代软骨细胞和矿化诱导后的第3代骨髓间充质干细胞，体外制备复合组织，观察其成软骨及成骨能力，以及双层结构间的组织形成及结合情况。

材料方法

设计：观察性实验。
时间及地点：于2012年3至12月在解放军空军总医院航空医学实验室完成。
材料：
实验动物：2周龄雄性SPF级新西兰大白兔4只，体质量0.4 kg，由解放军总医院动物实验中心提供，动物中心许可证号：SYXK(军)2002-004。
组织工程骨-软骨复合组织体外构建及生物学性能实验的主要仪器和试剂：
Main reagents and instruments used in the experiment of exploring in vitro construction and biological features of tissue engineering osteochondral composites:

实验方法：
种子细胞的分离培养：实验采用2周龄雄性SPF级新西兰大白兔。以兔耳原代软骨细胞和(同一只兔)第3代成骨诱导的骨髓间充质干细胞为种子细胞，实验方法及干细胞鉴定参照期实验和2006年国际间质组织干细胞委员会提出的鉴定标准^[10-11]，即：无菌条件下切取双侧耳软骨剪碎成1 mm³左右碎块，用0.2%Ⅱ型胶原酶37 ℃消化，200目网筛过滤后800 r/min离心5 min，弃上清细胞在DMEM/F12培养液内培养备用。无菌条件下获得上述兔股骨和肱骨，以DMEM/F12培养液将骨髓腔内骨髓组织完全冲出、沉淀、离心弃上清，用含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养液重悬细胞后，以1×10⁹L^-1细胞浓度接种于培养瓶中，培养箱内培养、传代至第3代后以诱导液(含体积分数10%胎牛血清， 10 mmol/L β-甘油磷酸钠，0.1 μmol/L地塞米松， 0.1 mmol/L抗坏血酸)成骨诱导。以流式细胞仪鉴定为间充质干细胞。
骨-软骨复合支架的制备：将新鲜小牛肋骨(北京市安定屠宰场)经脱脂、脱蛋白，置于马佛炉中缓慢加温至800 ℃，持续3 h后取出，冷却后浸入37 ℃、0.5%明胶溶液30 min，充分浸透后500 r/min离心1 min，作为骨层备用。参考Fan等[12]的制备方法，将0.5 g明胶粉剂、0.1 g硫酸软骨素粉剂和5 mg透明质酸钠加入7 mL三蒸水中，38 ℃下搅拌至溶解，并注入预先制备好的模具内，作为软骨层。待软骨层完全结固前将骨层支架插入，插入深度小于1 mm，室温下冷却后，放入-20 ℃冰箱过夜后行抽真空冻干。冻干后将复合支架浸入无水乙醇60 min，再置入体积分数70%，50%乙醇中各30 min，浸入含50 mmol/L碳化二亚胺的体积分数95%乙醇溶液中，室温交联24 h。三蒸水超声清洗3遍后真空冻干。使用前修整骨层与软骨层厚度，软骨层约2 mm，骨层不大于10 mm。
复合支架的表征：支架表面喷金后扫描电镜下观察孔隙大小、形状。采用改良的液体位移法测定支架的孔隙率。选用一带有刻度的试管，置入体积为V1的无水乙醇。将支架样本自分界处分开并切成合适大小浸入其中 5 min，接负压吸引脱气，使乙醇充盈于多孔支架的孔中，至无气泡逸出，记录此时乙醇体积(浸没支架)为V2。把浸满了乙醇的样品取出，剩余的乙醇体积为V3。按下式计算支架的孔隙率。

将支架制成直径1.0 cm，厚度0.5 cm样品，在生物材料试验机上进行压缩形变实验，压缩速度为 0.5 mm/min，观察材料抗压性能。
支架复合细胞：将第3代诱导后的骨髓间充质干细胞以2×10⁹L^-1的细胞浓度复合于支架骨层，大体观察见骨层被完全浸透，孵箱内培养，1 h后倒置材料，根据有无诱导方案分为2组：①无诱导方案组：含体积分数10%胎牛血清，584 mg/L L-谷氨酰胺，50 mg/L维生素C，100 U/mL青霉素，100 U/mL链霉素的DMEM/F12培养液培养，置37 ℃，饱和湿度，体积分数5%CO₂培养箱内培养。②成骨诱导组：含体积分数10%胎牛血清，10 μg/L β-甘油磷酸钠，0.1 μmol/L地塞米松， 0.1 mmol/L抗坏血酸的DMEM/F12培养液培养，置37 ℃，饱和湿度，体积分数5%CO₂培养箱内培养。然后按照分组将不同培养液置入培养皿内，使液平面恰好位于骨软骨支架连接处。此时取原代软骨细胞按照5×10¹⁰L^-1的浓度复合于软骨层，1.5 h后，再次注入培养液使支架完全浸没其中。常规换液、培养，每周取3块组织行相关检测。
MTT检测支架对细胞增殖的影响：按照培养液与两组材料体积之比为10 mL/cm³，在无诱导方案组与成骨诱导组材料中分别加入常规DMEM/F12培养液及成骨诱导培养液，于37 ℃下静置24 h制备两组支架浸提液。取第3代骨髓间充质干细胞，制成浓度为1.5×10⁷L^-1的细胞悬液，接种入96孔板，各孔加入200 μL细胞悬液，复种10孔，培养24 h，使细胞贴壁，然后弃原培养液，更换为支架浸提液；对照组10孔不更换培养液。
按照前期研究方法行MTT检测^[4]：即按细胞数1×10⁷L^-1/孔接种于96孔板中，每组3孔，每日测3孔取平均值，连测10 d。其中无诱导方案组与成骨诱导组培养液从共培养培养皿中吸取。吸出检测孔培养液，加入MTT 20 μL/孔，继续培养6 h，加入DMSO 150 μL/孔，振荡10 min，酶联检测仪上以492 nm波长测吸光度(A)值。
糖胺多糖检测：采用阿利新蓝法测定糖胺多糖含量。两组支架接种细胞后1，3，5，7，10，14 d，分别将支架置于胰蛋白酶中37 ℃水浴中消化6 h，将细胞充分消化后离心，将离心后的细胞溶于50 μL裂解液，4 ℃下0.5 h，充分裂解，以硫酸骨素为标准品，紫外分光光度计制作标准曲线，阿利新蓝法检测上清液中糖胺多糖含量，以第3代骨髓间充质干细胞为对照。
碱性磷酸酶活性检测：复合支架接种细胞后1，3，5，7，10，14 d，分别将4块复合组织置于10 mL离心管内，加入细胞消化液1 mL，置于37 ℃水浴中消化6 h。彻底消化后冰浴，超声破碎机处理细胞5次，6 s/次，1 000 r/min离心5 min，取上清按碱性磷酸酶试剂盒说明进行，酶标仪测A值^[13]。最后根据以下公式计算碱性磷酸酶活性，以第3代骨髓间充质干细胞为对照。

苏木精-伊红染色：按照分组，将组织复合后2周以 40 g/L多聚甲醛固定，脱矿后梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡包埋，切片机上切片，厚度5-8 μm。再次用二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，即可用苏木精、伊红染色。染色后脱水透明树胶封固，镜下观察。
主要观察指标：自然骨-软骨基质复合支架接种骨髓间充质干细胞与软骨细胞成骨诱导前后的成软骨及成骨能力。
统计学分析：采用SPSS 15.0软件包进行统计分析，所有数据以x(_)±s表示。组间比较采用独立样本t 检验； P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

近期研究表明，组织工程骨软骨复合支架的研究与应用已逐渐深入，成为该领域的重要研究方向^[14]。实验构建复合支架的前期实验中讨论了其基本生物学性能，比较符合本实验的要求。复合组织制备早期通常使用单相载体材料，按照不同层次复合成骨细胞及软骨细胞并最终形成骨软骨复合组织。但由于骨和软骨组织对支架材料的理化及生物学性能具有不同要求，因而后期多数学者选择合适的骨和软骨支架，然后分别复合不同的种子细胞，在不同培养环境下培养，单独形成组织工程骨和软骨，随即在体外将二者结合构成复合骨-软骨，进行体内外的移植培养最终形成组织工程骨-软骨复合组织^[15]。然而通过不断的研究分析，此种构建方式存在诸多问题，例如：①复合组织中骨、软骨结合部结合不佳。②软骨层软骨和宿主正常关节软骨整合不佳。③组织工程软骨形成质量稍差：透明软骨含量少，无正常关节软骨中不同的细胞层次，尤其缺少软骨组织浅面的扁平细胞层。④最为重要的是组织工程骨-软骨复合组织在较短观察期内，在其形态学、化学组成成分等方面显示出骨和软骨样组织结构特点，但该种组织的生物学特性及功能、生物力学性能、是否能长期存在并发挥功能而不引起相关并发症等还需深入研究才能证实^[16]。基于上述原因很多学者认为改善骨-软骨复合组织的支架结构和双层组织界面形成情况，设计整体化、含有过渡区的复层支架对组织形成将更加有利^[17]。实验根据这种理念设计复层支架，在骨、软骨支架结合区设计过渡区，从而尽量避免复层支架在体内外移植培养时出现界面分层或结合不良，并为新生的骨和软骨组织之间形成良好结合提供空间基础。在满足上述要求同时这些支架材料还必须具备组织工程支架的各项性能要求，如强度适宜、孔径大小合适、可降解等。在制备组织工程骨软骨复合组织中的一个主要问题是：双层支架结构之间的结合及怎样保持这种结合长期有效的问题^[18]。实验为了解决这一问题，在双层支架制备过程中使用了同一种材料-明胶，将双层复层结构有机的结合在一起。

实验采用常规灌注成型技术构建三维多孔可降解支架结构，该技术的显著优势在于能够根据实验要求以及材料特性，可以控制支架形态特征、孔径大小、分布、孔隙率等，能够在较短时间内构建出具有精确解剖外形的多孔三维支架^[19]。研究结果显示该方法制备的支架具有优良的空间结构特点和组织细胞相容性，是组织工程骨-软骨复合组织的理想支架。利用复层支架制备组织工程骨-软骨组织，软骨层支架复合原代软骨细胞，骨层支架复合成骨诱导的第3代骨髓间充质干细胞，复合后将上述组织培养于成骨诱导体系中。本实验使用两种同种自体细胞，经苏木精-伊红染色及糖胺多糖含量、碱性磷酸酶活性检测分析，结果显示成骨诱导体系体外培养复合组织能够使骨层支架内细胞持续向成骨细胞转化，对植入的原代软骨细胞无显著影响，但不采用成骨诱导体系培养复层组织其骨层支架内细胞成骨能力明显低于成骨诱导体系组。成骨诱导体系对软骨细胞无诱导作用可能的原因是由于软骨细胞已经具备终末分化细胞特性，常规的矿化诱导体系不足以产生诱导分化作用，而且关节软骨细胞和骨细胞在正常生理环境中之所以能够保持各自特点而存在除了其微环境能够保持其特性外，与他们都属于终末细胞有关，基于上述原因认为软骨细胞在矿化体系中可以保持自身特性。

在构建组织工程骨-软骨复合组织的过程中，组织支架能够模仿机体天然状态，提供具备三维结构的组织支架，具备适宜的孔隙率，为细胞附着其中、增殖、分化、物质交换，引导骨样及软骨样组织形成，同时为细胞分泌的细胞因子提供必要的附着点^[20]。实验在体外环境中培养形成骨软骨样组织，能够在体内环境中异位形成骨软骨组织。通过实验观察制备的组织工程骨软骨复合组织中，不同组织结合部能够复合成整体结构，同时具有紧密联结但结构不成熟的类骨-软骨样组织。两实验组苏木精-伊红染色可以观察到复合组织表层是由成纤维样细胞构成的软骨膜，其下方是相对较成熟的软骨样细胞及基质，软骨细胞均匀分布在基质内，软骨层下方可见大量成骨样细胞及骨基质。免疫组织化学染色可见在骨及软骨基质中有大量被染成棕黄色的Ⅰ型、Ⅱ型胶原；对照组未发现上述现象。

实验采用原代软骨细胞和第3代矿化诱导的骨髓间充质干细胞作为种子细胞，能够模拟体内微环境^[21]。此外，通过前期实验可以认为，软骨细胞和骨髓间充质干细胞共培养状态下能够将骨髓间充质干细胞诱导为软骨细胞，而且诱导方式是非接触诱导，即主要通过软骨细胞分泌的细胞外因子对骨髓间充质干细胞产生诱导作用^[22]，进一步分析认为：如果将两种细胞混合即细胞间广泛接触，那么软骨细胞对骨髓间充质干细胞的诱导作用将更强。其原因是两种细胞接触后不但细胞因子产生诱导作用，细胞外基质及细胞间连接也会同时形成明显的诱导作用，从而使骨髓间充质干细胞向成熟的软骨细胞转化，而且及有可能表现出不同分化阶段的软骨细胞，比如在正常关节软骨中可以看到的钙化软骨带、肥大带、增殖带等细胞及组织结构。此外，实验采用静态、分时、分层复合细胞方法；另外本实验复合支架中有过渡区存在，可以有大量骨髓间充质干细胞与软骨细胞不直接接触甚至远离软骨细胞，这就使得软骨细胞对骨髓间充质干细胞的诱导作用减弱，这样在矿化诱导环境中就会有大量骨髓间充质干细胞向成骨细胞方向转化，而且骨髓来源的骨髓间充质干细胞在非诱导环境中具有自发向成骨细胞转化趋势。

实验证实了采用两种细胞与双层结构的支架经体外分层复合，能够形成组织工程骨软骨复合组织。采用原代软骨细胞与明胶-硫酸软骨素-透明质酸复合制备软骨层，第3代矿化诱导的骨髓间充质干细胞与明胶-陶瓷化骨复合制备骨层，复合后各种理化检测可发现组织形成与实验预期相符，并与其他一些相关研究接近^[23-25]。组织工程骨-软骨复合组织制备的研究还处在起步阶段^[26-27]，实验提供的结果为下步制备具有解剖形态的双层结构奠定了实验基础。虽然前期的很多项研究明确了组织工程骨软骨复合组织构建的可行性^[28-30]，但制备的骨软骨样复合组织仅具有生物化学及形态学方面的特征，其生物学功能特点及能否在体内长时间发挥功能而不发生变性、退变等其他并发症仍需进一步研究证实。

基金资助：国家自然科学基金项目(30900314)。
作者贡献：柯杰进行实验设计，实验实施为吕晶，实验评估为邓天政，资料收集为杨捷绯，邓天政成文，柯杰审校，邓天政对文章负责。
利益冲突：课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组织直接或间接的经济或利益的赞助。
伦理要求：实验过程中对动物的处置符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。
作者声明：文章为原创作品，数据准确，内容不涉及泄密，无一稿两投，无抄袭，无内容剽窃，无作者署名争议，无与他人课题以及专利技术的争执，内容真实，文责自负。

体外构建组织工程骨-软骨复合组织

In vitro fabrication of tissue engineering osteochondral composites

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