2.1   丝素蛋白支架的制备   依据人肠黏膜上皮绒毛结构和生理特性进行设计，采用聚二甲基硅氧烷制作模具，旨在模拟体内人小肠上皮的解剖形状。结合生理条件下的肠绒毛的尺寸、间距和制作工艺的精度，模具的尺寸为针长600 μm，底部直径230 μm，针尖间距600 μm。绒毛高度与绒毛宽度比约为2.6，与WANG 研究团队[14]所制作的模型比例相一致(图2A)。将可溶性丝素蛋白颗粒溶于超纯水中，均匀浇注在模具上，真空干燥箱中排出气泡、通风橱中干燥，得到具有三维结构的拓扑丝素蛋白支架。经乙醇浸泡后诱导β-折叠结构的形成，裁剪至直径为10 mm的圆形备用。扫描电镜检测拓扑丝素蛋白支架的表面形貌，支架表面具有锥体形突起，类似小肠绒毛，见图2B。
2.2   肠黏膜上皮细胞-神经干细胞共培养基的筛选   采用CCK-8法检测肠上皮细胞增殖情况，结果显示A组和B组间细胞活力无显著差异，C组培养第9天的细胞活力显著低于B组(P < 0.01)；采用CCK-8法检测人诱导神经干细胞增殖情况，结果显示，E组、F组培养3，5 d的细胞活力高于D组(P < 0.05)，E组培养7，9 d的细胞活力高于D组(P < 0.05)，见图3A。根据CCK-8检测结果，采用神经分化培养基与DMEM培养基体积比1∶1作为共培养基，进一步共培养肠上皮细胞和人诱导神经干细胞。
倒置相差显微镜观察共培养基中各细胞随着时间而产生的形态变化，发现肠上皮细胞的形态规整，细胞伸








展呈多角形，培养至第3天细胞紧密排列形成铺路石状；单独培养的人诱导神经干细胞和与肠上皮细胞共培养的人诱导神经干细胞均有突触伸出，见图3B。进一步采用免疫荧光染色检测共培养基条件下，人诱导神经干细胞中β-微管蛋白表达，结果显示人诱导神经干细胞分化为β-微管蛋白阳性表达的神经元，并可见梭形或圆形的神经元胞体和细长的突触，见图3C。上述结果说明，在共培养基条件下，3种细胞生长、神经干细胞分化状态良好，最终确定共培养基为神经分化培养基与DMEM培养基等体积混合。
2.3   肠黏膜上皮-神经细胞共培养模型的形态学表征   将人诱导神经干细胞接种于支架表面，倒置相差显微镜下可见人诱导神经干细胞分化，并且在胶原内伸出突触，培养至第5天时突触逐渐变长交织形成神经网络，并且随着培养时间的增加，人诱导神经干细胞突触增多且增长(图4A)。将人诱导神经干细胞培养至第7天，加入Caco-2和HT29-MTX-E12细胞共培养3 d，可见肠上皮细胞在人诱导神经干细胞上密集排列，形成连续完整的单层(图4A)。
进一步对接种于丝素蛋白支架中的细胞进行形态学表征。扫描电镜观察结果显示，单独人诱导神经干细胞培养组和肠上皮细胞-人诱导神经干细胞共培养组中的人诱导神经干细胞形成突触，共培养组中肠上皮细胞呈鹅卵石状，沿支架增殖并延拓扑结构迁移(图4B-i)。苏木精-伊红染色显示，单独人诱导神经干细胞培养组人诱导神经干细胞生长于胶原层内，肠上皮细胞-人诱导神经干细胞共培养组中肠上皮细胞增殖形成单层覆盖于胶原层之上(图4B-ii)，模拟人体生理状态下黏膜下神经丛和肠上皮细胞的解剖学位置。进一步采用Live/Dead细胞活性染色检测两组中的细胞活性，结果显示3种细胞活性良好(绿色荧光标记)，少见凋亡细胞(红色荧光标记)，并且人诱导神经干细胞形成细长的突触(图4B-iii)。为了进一步评估人诱导神经干细胞的分化情况，对单独人诱导神经干细胞培养组和肠上皮细胞-人诱导神经干细胞共培养组进行β-微管蛋白免疫荧光染色，结果显示两组中神经元均相互连接形成神经网络，共培养组中神经元突触数目更多且更细长(图4B-iv)，提示与肠上皮细胞共培养可能促进神经元的分化。以上结果表明，实验成功构建了小肠黏膜下神经丛模型，肠上皮细胞和人诱导神经干细胞生长状态良好，并且人诱导神经干细胞可分化为β-微管蛋白阳性表达的神经元。
2.4   肠黏膜上皮-神经细胞共培养对上皮细胞的影响   为明确与人源诱导神经干细胞共培养后，肠上皮细胞功能的改变，结果见图5。
采用免疫荧光染色检测单独肠上皮细胞培养组与肠上皮细胞-人诱导神经干细胞共培养组肠上皮细胞中微绒毛蛋白、蔗糖酶-异麦芽糖酶、紧密连接蛋白1、E-钙黏蛋白以及杯状细胞的标志性黏蛋白2表达情况，见图5A。结果显示，两组均能表达微绒毛蛋白、蔗糖酶-异麦芽糖酶、紧密连接蛋白1、E-钙黏蛋白和黏蛋白，但相较于单独肠上皮细胞培养组，肠上皮细胞-人诱导神经干细胞共培养组中紧密连接蛋白1蛋白表达增加。
紧密连接蛋白1检测能够反映肠上皮细胞的屏障功能，其表达越高说明肠上皮细胞屏障功能越完整。碱性磷酸酶是一种表达于肠纹状缘的酶，可水解单磷酸盐，用于评估肠上皮细胞分化过程[15]。蔗糖酶-异麦芽糖酶为肠上皮细胞中负责将蔗糖和异麦芽糖分解为葡萄糖和麦芽糖的关键酶，该酶表达升高有助于肠上皮细胞功能成熟。RT-qPCR检测结果显示，肠上皮细胞-人诱导神经干细胞共培养组中紧密连接蛋白1、蔗糖酶-异麦芽糖酶与碱性磷酸酶mRNA表达均高于单独肠上皮细胞培养组(P < 0.001，P < 0.01，P < 0.01)，见图5C。阿利新蓝染色结果显示，肠上皮细胞-人诱导神经干细胞共培养组肠上皮细胞具有分泌黏液的功能，见图5B-i。碱性磷酸酶染色结果显示，两组均具有碱性磷酸酶活性，其中肠上皮细胞-人诱导神经干细胞共培养组碱性磷酸酶表达强于单独肠上皮细胞培养组，见图5B-ii。
以上结果说明，相较于单独肠上皮细胞培养组，肠上皮细胞-人诱导神经干细胞共培养模型可以有效促进肠上皮细胞紧密连接蛋白1的表达，形成更紧密的上皮屏障，并促进肠上皮细胞黏液分泌及肠黏膜功能成熟。

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肠道神经系统因能与中枢神经系统相互作用被誉为“第二大脑”，其功能主要包括调节肠道收缩、血管张力、激素分泌、上皮屏障通透性等[1]。在人体发育过程中，大部分肠道神经系统起源于背侧神经管的迷走神经嵴细胞，在胚胎第4周左右向腹侧迁移，定植于前肠；随后，神经嵴细胞大量增殖并向尾部迁移，在妊娠7周左右定植于消化道[2]。如果肠道神经嵴细胞未能正常迁移、增殖、存活并分化，就会导致肠神经系统的结构和功能缺陷，出现先天性巨结肠[3]；此外，肠道神经疾病是炎症性肠病等消化系统疾病的常见并发症，并经常继发于帕金森病、糖尿病和神经退行性疾病[4]。
目前对肠道神经相关疾病的病因知之甚少，究其原因在于缺乏用于研究肠道神经性疾病的生理病理模型，导致肠道神经性疾病相关的诊断和治疗进展异常艰难和缓慢。现有的二维细胞培养模型、动物模型和类器官模型因缺乏微生物相互作用、存在种属发育差异、肠道稳态发育不成熟等问题，在深入理解肠道神经系统的作用时存在一定局限性[5-6]。而继WORKMAN等[7]首次结合人肠道类器官和多能干细胞来源的神经嵴细胞构建了类似于肌间神经丛和黏膜下神经丛的结构开始，功能性肠道神经系统组织工程研究受到广泛关注。借助组织工程手段模块化、分区设计形成复杂的体外肠道神经系统模型并维持培养，对于理解神经通信网络对肠道的调控作用提供了新的手段[8]。另外，依托微流控芯片装置可实现生理相关的肠道-器官相互作用，为弥补临床前和临床研究之间的差距提供了有价值的平台[9-10]。
受RUDOLPH等[11]的启发，此次研究采用微加工技术对丝素蛋白材料的构形进行调整，制备了能模拟肠黏膜中指状绒毛结构的支架系统，采用人结直肠腺癌细胞Caco-2和人结肠癌细胞HT29甲氨蝶呤诱导分化的成熟杯状细胞HT29-MTX-E12构建肠黏膜上皮模型，并加入人诱导神经干细胞模拟小肠黏膜下神经丛，构建神经化肠黏膜组织工程模型，为后期深入探究肠道神经系统对上皮细胞之间的相互作用提供研究基础，为可移植的组织工程化功能性肠道体外构建奠定实验基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1   设计   体外组织工程构建与观察实验，组间比较采用t检验。
1.2   时间及地点   实验于2022年10月至2023年3月在大连医科大学组织学与胚胎学实验室完成。
1.3   材料
1.3.1   细胞   小鼠胚胎成纤维细胞、人结直肠腺癌细胞Caco-2购于ATCC细胞库；人结肠癌细胞HT29甲氨蝶呤诱导分化成熟杯状细胞HT29-MTX-E12购于ECACC细胞库；人诱导神经干细胞购于Sciencell公司。
1.3.2   实验试剂和仪器   胎牛血清(Gemini)；高糖DMEM培养基、敲除DMEM培养基、血清替代物KOSR、谷氨酰胺、TrypLE温和酶、神经基础培养基、B27添加剂(Gibco)；成纤维生长因子、DAPI(Peprotech)；多聚甲醛、抗体稀释液、中性树胶、青链霉素混合液、胰蛋白酶-EDTA消化液、非必需氨基酸、戊二醛(Solarbio)；丝裂霉素、洋红(Sigma-Aldrich)；异丙醇、无水乙醇、二甲苯(科密欧)；Trizol试剂(Ambion Life Technologles)；Live/Dead染色试剂盒、FITC标记小鼠抗人紧密连接1抗体、羊抗小鼠二抗(Invitrogen)；Ⅰ型胶原、基质胶(Corning)；PrimeScriptTM RT Master Mix试剂盒、SYBR® Premix Ex Taq™Ⅱ 试剂盒(TaKaRa)；Alexa Fluor®647标记小鼠抗人β-微管蛋白抗体、小鼠抗人微绒毛抗体(BD Pharmingen)；小鼠抗人E-钙黏蛋白抗体(Proteintech)；小鼠抗人蔗糖酶-异麦芽糖酶抗体、小鼠抗人黏蛋白2抗体(Santa Cruz)；可溶性丝素蛋白(苏州丝美特生物技术有限公司)；阿利新蓝染色试剂盒(北京雷根生物技术有限公司)；碱性磷酸酶染色试剂盒(南京建成科技有限公司)；细胞培养箱、超净工作台(Thermo  Fisher)；微量核酸测定仪(Nanodrop 2000)；荧光显微镜(Keyence)；qPCR仪(BIO-RAD)；真空干燥箱(上海一恒仪器)；冷冻干燥机(宁波新芝生物)；扫描电镜(Zeiss)。
1.4   实验方法   
1.4.1   人诱导神经干细胞的培养   将小鼠胚胎成纤维细胞培养于100 mm2的皿中，观察细胞融合度约为90%(细胞数量约为6×106)时吸弃培养基，加入8 mL含体积分数10%胎牛血清、1%青链霉素混合液以及10 μg/mL丝裂霉素的高糖DMEM培养基培养2.5-3.0 h，弃培养基，PBS洗3次。胰酶消化小鼠胚胎成纤维细胞后，以3×104/cm2的密度平铺到0.1%明胶包被30 min的60 mm2培养皿中，置于细胞培养箱中静置过夜。
人诱导神经干细胞用人诱导神经干细胞增殖培养基(敲除DMEM+20%血清替代物KOSR+1%谷氨酰胺+20 ng/mL成纤维生长因子+1%青链霉素混合液)培养，按细胞数量2×106接种于含有小鼠胚胎成纤维细胞滋养层的培养皿中，置于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中。每3 d更换液1次，当细胞融合度达到80%-90%时按1∶3传代。
1.4.2   肠上皮细胞的培养   Caco-2细胞和HT29-MTX-E12细胞培养于含体积分数10%胎牛血清+1%青链霉素混合液+1%非必需氨基酸的DMEM培养基中，置于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中。每两三天天换液一次，当细胞融合度约达90%时按1∶3传代。
1.4.3   人诱导神经干细胞和肠上皮细胞共培养基的筛选  当人诱导神经干细胞融合度达到80%-90%时，弃去培养基，加入1 mL TrypLE温和酶消化1 min，收集细胞悬液，1 500 r/min离心5 min后弃上清，加入3 mL神经分化培养基(神经基础培养基+2% B27添加剂+1%谷氨酰胺+1%青链霉素混合液)重悬细胞沉淀，按细胞数量1×105接种于培养皿中，置于细胞培养箱中培养，隔天换液。将200 μL第14代人诱导神经干细胞悬液接种于96孔培养板内，细胞密度为1.5×105/孔，分3组培养，分别加入神经分化培养基、神经分化培养基与DMEM培养基(二者体积比为1∶1)、神经分化培养基与DMEM培养基(二者体积比为1∶2)，体积均为100 μL。
将200 μL的Caco-2细胞和HT29-MTX-E12细胞悬液以3∶1的比例接种于96孔板内，细胞总密度为5×103/孔，分3组培养，分别加入DMEM培养基、神经分化培养基与DMEM培养基(二者体积比为1∶1)、神经分化培养基与DMEM培养基(二者体积比为2∶1)，体积均为
100 μL。实验分组情况见表1。



CCK-8检测：培养1，3，5，7，9 d，吸弃孔内的培养基，加入含10% CCK-8的完全培养基100 μL，孵育2 h后吸取上清液，用酶标仪测量450 nm处的吸光度值，计算细胞活力。细胞活力(%)=(实验组吸光度值-空白组吸光度值/对照组吸光度值-空白组吸光度值)×100%，对照组为A组、D组，空白组仅加入培养基无细胞。
人诱导神经干细胞的分化：根据CCK-8检测筛选出合适的共培养基后，将第14代人诱导神经干细胞(细胞密度为1.5×105/孔)与第20代Caco-2细胞(细胞密度为3.75×103/孔)和第20代HT29-MTX-E12细胞(细胞密度为1.25×103/孔)共接种于96孔板内，共培养3 d后，倒置显微镜下观察细胞形态变化，并进一步进行β-微管蛋白免疫荧光染色(染色步骤在后文一并说明)，鉴定人诱导神经干细胞分化情况。
1.4.4   拓扑丝素蛋白支架的设计及制备   依据人小肠黏膜上皮绒毛结构和生理特性进行设计，委托台州微芯医药科技有限公司制作聚二甲基硅氧烷模具[绒毛高度=(437±98) μm，绒毛宽度=(149±41) μm，绒毛高度与绒毛宽度比约为2.93[12-13]]。
称取0.6 g可溶性丝素蛋白颗粒溶于9.4 mL超纯水中，混匀后于4 ℃冰箱中过夜溶解，得到60 g/L丝素蛋白溶液。将丝素蛋白溶液均匀浇注在聚二甲基硅氧烷模具上，放入真空干燥箱中(室温、真空度为0.09 MPa)10 min以排出气泡，重复3次，使溶液填满针孔，补充丝素蛋白溶液填满模具，置于通风橱中干燥24 h，得到具有三维拓扑结构的丝素蛋白支架。体积分数75%乙醇浸泡支架2 h，诱导β-折叠结构的形成，在超纯水中水洗支架过夜，体积分数75%乙醇再次浸泡灭菌，打孔器裁剪成直径为10 mm的圆形，室温下储存。扫描电镜下观察支架形貌。
1.4.5   神经化肠黏膜模型的构建   神经化肠黏膜模型的构建流程，见图1。将制备好的丝素蛋白支架在体积分数75%乙醇中浸泡灭菌，Ⅰ型胶原和基质胶按体积比1∶1混合包被支架待用。消化第15代人诱导神经干细胞悬液并计数，加入胶原重悬细胞，将5×105个细胞混合2.0 g/L胶原接种于支架表面(48孔板内)，于37 ℃细胞培养箱放置2 h；加入神经分化培养基培养7 d，加入第21代肠上皮细胞Caco-2细胞与第21代HT29-MTX-E12细胞，二者密度分别为6.72×105，2.24×105/孔，更换为神经分化培养基与DMEM培养基(二者体积比为1∶1)，维持培养3 d，隔天换液。神经化肠黏膜模型设为实验组，同时将单独人诱导神经干细胞接种于丝素蛋白支架(上述构建神经化肠黏膜模型中，加入神经分化培养基培养7 d)或单独肠上皮细胞接种于丝素蛋白支架(培养3 d)设为对照。培养期间，倒置相差显微镜下观察细胞形态变化。
1.4.6   Live/Dead细胞活性染色   收集实验组与对照组样品，用PBS清洗后加入Live/Dead细胞活性染液于37 ℃避光孵育2 h，置于Keyence荧光显微镜下观察、拍照。活细胞因产生钙黄绿素呈绿色荧光，死亡细胞因细胞膜受损被红色荧光染色。
1.4.7   苏木精-伊红染色  收集实验组与对照组样品，40 g/L多聚甲醛固定24 h，石蜡包埋、切片、脱蜡后，苏木精染色液染色2.0-3.0 min，1%盐酸乙醇分色，1%氨水返蓝，伊红染色液染色2 min。完成染色的切片经乙醇脱水、二甲苯透明、中性树脂封固后，置于光学显微镜下观察、拍照。
1.4.8   阿利新蓝染色   收集实验组与对照组样品，40 g/L多聚甲醛固定24 h，石蜡包埋、切片、脱蜡后在阿利新蓝(A)酸化液中浸泡5 min，阿利新蓝(B)染液染色30 min，流水冲洗3 min。经梯度乙醇脱水、二甲苯透明后中性树胶封固，置于光学显微镜下观察、拍照。
1.4.9   碱性磷酸酶染色   收集实验组与对照组样品，用40 g/L多聚甲醛固定24 h，石蜡包埋、切片、脱蜡后行碱性磷酸酶染色，光学显微镜下观察、拍照。
1.4.10   免疫荧光染色   收集实验组与对照组样品，PBS清洗3次，40 g/L多聚甲醛中4 ℃过夜。用PBS洗3次，0.5% Triton X-100溶液破膜2 h。用PBS洗3次，1%牛血清白蛋白于摇床上封闭2 h。弃去封闭液，避光条件下加入一抗[Alexa Fluor®647标记小鼠抗人β-微管蛋白抗体(1∶200)、小鼠抗人微绒毛抗(1∶100)、小鼠抗人E-钙黏蛋白抗体(1∶200)、小鼠抗人蔗糖酶-异麦芽糖酶抗体(1∶50)、小鼠抗人黏蛋白2抗体(1∶50)、FITC标记小鼠抗人紧密连接蛋白1抗体(1∶200)]于4 ℃孵育过夜。PBS清洗样品3次后，避光条件下加入羊抗小鼠二抗(1∶200)于37 ℃孵育2 h。PBS洗3次，避光条件下加入DAPI(2 μg/mL)染色液室温孵育30 min，置于Keyence荧光显微镜下观察、拍照。
1.4.11   RT-qPCR检测   收集实验组与对照组样品，PBS清洗3次后加入Trizol试剂，提取总RNA，使用微量核酸测定仪测定所提取RNA浓度。依据PrimeScriptTM RT Master Mix试剂盒说明书进行反转录，合成cDNA，反应条件为：37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s。以cDNA为模板，依据SYBR® Premix Ex Taq™Ⅱ试剂盒说明书进行PCR扩增，扩增条件为：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性3 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，循环数40。引物序列如表2。实验中以GAPDH为内参、使用2-ΔΔCt法计算紧密连接蛋白1、蔗糖酶-异麦芽糖酶、碱性磷酸酶的相对表达量。每组样品至少设置 3个复孔，并进行3次独立重复实验。

1.4.12   扫描电镜检测   收集样品， 2.5%戊二醛中固定过夜，经乙醇梯度脱水后进行冷冻干燥，喷金后于扫描

电镜下观察、拍照。

1.5   主要观察指标   神经化肠黏膜共培养模型中的细胞活性、人诱导神经干细胞分化以及神经干细胞对肠黏膜上皮组织学特性、屏障功能以及黏液分泌的影响。
1.6   统计学分析   使用Image J软件进行数据处理，计算平均吸光度度值，采用GraphPad Prism 8软件进行统计学分析及作图。研究中计量资料采用 x±s描述，采用未配对t检验比较两个均值之间的差异。P < 0.05认为差异有显著性意义。该文统计学方法已经通过大连医科大学生物统计学专家审核。

肠道是人体重要的器官之一，具有消化、吸收、内分泌调节、免疫调节、代谢转化等一系列复杂的生理功能[16-18]。肠管的管壁主要包括黏膜层、黏膜下层、肌层以及外膜4层，黏膜层作为承担消化、吸收和免疫屏障的主要功能部位，在肠道稳态调节过程中起到重要的作用[19-20]。
肠道屏障损伤与炎症性肠病、短肠综合征、癌症等密切相关[21-22]。肠神经系统是机体内最大的外周神经系统，由神经元和胶质细胞组成[1]。肠神经系统分为2种类型：一种为存在于纵肌层和环肌层之间的肌层神经丛，其主要功能为调控肠道平滑肌的收缩和舒张，促进肠道的蠕动；另一种为存在于黏膜下的黏膜下神经丛，其主要功能为控制肠道的分泌和吸收[23]。近年来，肠神经系统作为区别于中枢神经系统独立存在的系统，其作用受到广泛关注[24]。研究表明，与肠道炎症相关的肠神经系统损伤可能是肠道功能持续改变的基础，保护肠神经元可以减轻炎症反应[25]。可见，肠神经系统在肠道生理及病理性过程中均扮演重要角色。功能性组织工程化肠道可为肠道发育及疾病研究提供理想的生理与病理模型，在临床也具有广泛应用前景，成为基础医学和临床转化研究领域关注的重点。
目前肠黏膜上皮模型的体外构建已经屡见不鲜，许多研究团队采用多种技术手段对这一模型进行构建，但是肠道神经系统作为肠黏膜上皮机械屏障功能的重要影响因素之一，在体外肠黏膜上皮模型的构建中却鲜少提及。PUZAN等[26]采用Transwell体系在体外构建神经化肠黏膜模型，但是平面培养细胞不能模拟体内的微环境，细胞生长及功能与在三维环境中有很大区别。MANOUSIOUTHAKIS等[8]尝试在体外构建神经化三维肠上皮模型，但是此模型缺少模拟人体内肠道黏膜上皮的特殊生理几何结构，即绒毛结构，而绒毛长度、密度以及对化学信号反馈的变化在研究肠道神经系统和肠上皮黏膜之间的相互作用中扮演着十分重要的角色[27-28]。
因而，此次研究尝试构建一个具有三维绒毛结构且将神经-上皮细胞整合共培养的模型，通过微加工技术对丝素蛋白支架的构形进行调整，制备具有能模拟肠黏膜中指状突起的支架系统，该支架借助丝素蛋白良好的生物力学性能、加工性能和生物相容性优势[11，29]，利用聚二甲基硅氧烷模具的塑形能力，经干燥脱模获得，操作简单便捷，为模拟小肠绒毛创造良好的支架条件。
此次研究对体外神经化肠黏膜上皮三维模型构建过程中的关键因素种子细胞进行优化。虽然小肠神经胶质细胞已成为反映小肠神经功能的代表性细胞，但该细胞主要是起支持和调节神经元的作用，不具备人诱导神经干细胞的多能性，不能够完整地模拟肠黏膜神经丛神经细胞的发育过程。另外，人诱导神经干细胞来源相对稳定，可以通过精确控制培养条件实现标准化的细胞培养，并且不存在种属差异。与MANOUSIOUTHAKIS团队[8]所选择的种子细胞相一致，此次研究采用先接种人诱导神经干细胞后接种肠上皮细胞的构建策略，与人神经系统和肠道系统的发育一致，肠上皮细胞和人诱导神经干细胞的加入使模型体系更加趋近于生理状态的黏膜下神经丛，该神经丛靠近肠上皮细胞，直接接收和传递来自肠上皮层的信息。在肠上皮细胞中，人结直肠腺癌细胞Caco-2能够自发分化形成类似于小肠上皮细胞的形态和功能。Caco-2细胞间会形成紧密连接，具有极性，能够表达多种小肠纹状缘酶，如碱性磷酸酶、蔗糖酶-异麦芽糖酶等，这些酶在小肠的消化和吸收过程中发挥关键作用。人结肠癌细胞HT29甲氨蝶呤诱导分化的成熟杯状细胞
HT29-MTX-E12主要模拟肠杯状细胞，可分泌黏液形成黏膜屏障的重要组成部分，对于保护肠道上皮以及分泌黏液有重要意义。此次研究模型中的丝素蛋白支架具备绒毛结构，将Caco-2细胞和HT29-MTX-E12细胞以3∶1比例混合接种，用于模拟生理条件下小肠吸收上皮和杯状细胞的比例[8，30]，这一手段使得该模型能更好地模拟小肠黏膜上皮细胞和神经细胞之间的密切解剖关系。最新研究表明，小肠神经胶质细胞是肠神经系统的重要组成部分，在支持和调节神经元中发挥重要作用[31-32]。但小肠神经胶质细胞提取过程相对复杂，受小鼠体内肠道微生物群落、局部免疫微环境等多种因素影响，并且和人肠道微环境存在种属差异。因此，此次研究选用具有多能性的人诱导神经干细胞，通过诱导分化形成神经元和神经胶质细胞，能够更完整地模拟小肠黏膜神经丛内干细胞到成熟神经细胞的发育过程。但此次研究主要检测的是神经元相关分子标志物，对分化的神经胶质细胞检测较少，将在后续研究中进一步探究。
在丝素蛋白拓扑结构模拟的肠神经系统中，维持肠黏膜内的屏障功能是肠黏膜修复的基础。与单独肠上皮细胞培养组相比，肠上皮细胞-人诱导神经干细胞共培养组肠上皮细胞的紧密连接蛋白1表达增强，紧密连接蛋白1基因表达水平升高，表明在三维拓扑支架上与人诱导神经干细胞共培养，有助于肠上皮细胞屏障功能的完善。该结果与之前报道的神经细胞可能通过改善紧密连接蛋白的表达调节细胞通透性的研究结果相一致[33]。另外，与人诱导神经干细胞共培养后，肠上皮细胞蔗糖酶-异麦芽糖和碱性磷酸酶表达增多，提示神经细胞的存在一定程度上促进了上皮细胞黏膜屏障功能的提升和细胞功能的成熟。此次研究使用丝素蛋白支架制备的生物工程肠道，为消化和吸收能力下降的肠衰竭综合征患者提供了一种潜在的可移植组织来源，但其在组织修复和黏膜再生的证据尚不完善，有待在动物体内进一步验证[34-35]。
需要指出是，此次研究所构建的神经化共培养模型尚缺乏对神经电生理刺激的检测，与中枢神经系统相比，对肠神经系统电路及其电生理学的了解较少。目前已知肠神经系统功能障碍与胃肠道功能紊乱等疾病有关，但确切的电生理学机制尚不清楚。已有研究团队尝试对肠神经系统产生的信号进行了采集，RAKHILIN等[36]采用植入式设备在小鼠体内对肠神经系统活动进行了光学和电记录，Goto等[37]应用双光子激发荧光显微镜实现了体内肠上皮和肠神经系统的观察。借助以上技术有望对神经元进行成像，作为评估正常肠道以及糖尿病和帕金森病小鼠模型中肠道神经功能和功能障碍的手段。此次研究中所选用的种子细胞并未含有和免疫相关的细胞类型，如潘氏细胞和巨噬细胞，并未检测巨噬细胞相关指标，对于神经免疫调节的探讨尚不够深入。现有研究表明，小肠神经胶质细胞和巨噬细胞的相互作用可能在神经免疫调节中发挥关键作用[38-39]。肠道干细胞或隐窝在基质胶以及多种生长因子中培养可不断增殖，并且能够分化成肠道干细胞和潘氏细胞等多种细胞类型[40]，而免疫细胞和干细胞之间的串扰在调节肠道上皮细胞分化和黏膜的完整性中起关键作用[41]。课题组目前正将肠道类器官作用优化的种子细胞来源，以探究肠道神经的免疫调节。
综上，此次研究以肠黏膜上皮细胞和人诱导神经干细胞为种子细胞，以带有拓扑绒毛结构的丝素蛋白为支架，成功构建了神经化肠黏膜共培养模型，结果显示肠黏膜上皮-神经共培养有利于肠黏膜上皮细胞功能成熟和屏障功能的形成。该研究工作为可移植的组织工程化功能性肠道的体外构建奠定实验基础，同时所构建的神经化肠黏膜可为肠道的病理生理性研究提供新的模型工具。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

#br# 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程#br#

此次研究用微加工技术对丝素蛋白材料的构形进行调整，制备具有能模拟肠黏膜中指状绒毛结构的支架系统，采用人结直肠腺癌细胞Caco-2和人结肠癌细胞HT29甲氨蝶呤诱导分化成熟杯状细胞HT29-MTX-E12构建肠黏膜上皮模型，并加入人诱导神经干细胞模拟小肠黏膜下神经丛，构建肠黏膜上皮-神经细胞共培养模型体系，筛选肠黏膜上皮-神经细胞共培养体系的培养基为人诱导神经干细胞分化培养基与上皮细胞培养基等比例混合。该模型中，人诱导神经干细胞与胶原混合在丝素蛋白支架上定植，神经元分化并形成突触，并且对上皮细胞的屏障功能和黏液分泌具有调控作用。研究成功构建了神经化肠黏膜组织工程模型，将为后期深入探究肠道神经系统对上皮细胞之间的相互作用提供研究基础，为可移植的组织工程化功能性肠道的体外构建奠定实验基础。#br# 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程#br#

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