利用Cre/loxP系统构建胰岛β细胞特异性敲除PDHA1基因的小鼠模型

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1985

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (31): 5023-5029.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1985

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利用Cre/loxP系统构建胰岛β细胞特异性敲除PDHA1基因的小鼠模型

王肖1，赖舒畅1，叶艳诗1，许雪娟1，白晓春2，沈洁1

(南方医科大学第三附属医院，1内分泌与代谢科， 2中心实验室，广东省广州市 510631)

收稿日期:2019-06-17 出版日期:2019-11-08 发布日期:2019-11-08
通讯作者: 沈洁，主任医师，教授，博士生导师，南方医科大学第三附属医院内分泌与代谢科，广东省广州市 510631
作者简介:王肖，女，1992年生，汉族，南方医科大学在读硕士，主要从事糖尿病发病机制的研究。
基金资助:
广州市科技计划项目(201604020007)，项目负责人：沈洁

Construction of islet beta cell-specific PDHA1 knockout mice by Cre/loxP system

Wang Xiao1, Lai Shuchang1, Ye Yanshi1, Xu Xuejuan1, Bai Xiaochun2, Shen Jie1

(1Department of Endocrine and Metabolism, 2Central Laboratory, the Third Affiliated Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510631, Guangdong Province, China)

Received:2019-06-17 Online:2019-11-08 Published:2019-11-08
Contact: Shen Jie, Chief physician, Professor, Doctoral supervisor, Department of Endocrine and Metabolism, the Third Affiliated Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510631, Guangdong Province, China
About author:Wang Xiao, Master candidate, Department of Endocrine and Metabolism, the Third Affiliated Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510631, Guangdong Province, China
Supported by:
the Guangzhou Science and Technology Program, No. 201604020007 (to SJ)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
Cre 重组酶：由大肠杆菌噬菌体P1中Cre基因编码表达的蛋白单体，可特异性识别细胞DNA序列上的loxP位点，根据loxP位点的排列方式介导标记基因的特异性重组反应。
loxP序列：由2个13 bp反向重复序列和中间间隔的8 bp序列共同组成，可与Cre重组酶特异性结合位点。当2个loxP序列位于同一条DNA链且方向相同时，Cre重组酶能够敲除2个loxP序列间的DNA片段。

摘要
背景：研究表明，2型糖尿病啮齿类动物模型及人体的丙酮酸脱氢酶复合体表达量降低，PDHA1基因缺陷也是导致丙酮酸脱氢酶复合体酶活性改变最常见的原因。
目的：构建并鉴定胰岛β细胞特异性敲除PDHA1基因小鼠，为后续探究PDHA1基因在糖尿病发病机制方面作用提供模型基础。
方法：实验方案经南方医科大学伦理委员会批准。利用Cre/loxP系统理论，将PDHA1loxp/loxp 小鼠与胰岛β细胞特异性表达Cre重组酶的小鼠进行数代杂交，3-4周龄小鼠通过PCR法鉴定筛选基因型，子2代中基因型为PDHA1loxp/loxpCre+/-小鼠即为实验所需要构建的模型小鼠。取4周龄PDHA1flox/floxCre+/-小鼠(?βKO小鼠组)与Cre+/-小鼠(对照组)各5只，给予相同的水和饲料，待8周龄时连续7 d注射腹腔注射他莫昔芬50 mg/kg诱导PDHA1基因敲除，观察3周后腹腔注射麻醉，取胰腺组织、脂肪组织、肝脏组织。采用qPCR法、Western Blot法、免疫组织化学法鉴定PDHA1基因敲除效果，观察小鼠表型。
结果与结论：①PCR基因扩增筛选出基因型为PDHA1loxp/loxpCre+/-小鼠；②qPCR法检验小鼠胰腺、脂肪、肝脏组织，证实敲除效果具有组织特异性，胰岛中βKO组小鼠PDHA1 mRNA的相对表达较对照组明显下降；③Western Blot检测及免疫组织化学法观察显示，βKO组小鼠PDHA1蛋白表达较对照组小鼠明显降低，证实敲除PDHA1基因效果明显；④结果说明，利用Cre/loxP系统成功构建胰岛β细胞特异性敲除PDHA1基因的小鼠模型，为动物水平上探究糖尿病发病机制提供新的靶点。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0003-2373-4448(王肖)

关键词: 糖尿病, PDHA1, Cre/loxP, β细胞, 基因

Abstract:

BACKGROUND: In rodent models of type 2 diabetes mellitus and human, the expression level of pyruvate dehydrogenase complex is decreased, and PDHA1 deficiency is the most common cause of changed pyruvate dehydrogenase complex activity.
OBJECTIVE: To construct and identify the inducible islet-specific PDHA1 knockout mice, so as to provide basis for the study on the role of PDHA1 in pathogenesis of diabetes mellitus.
METHODS: The study was approved by the Ethics Committee of Southern Medical University. By using Cre-loxP recombination system, PDHA1flox/floxCre+/- mice were generated by crossing PDHA1flox/flox mice with Cre+/- mice. Genotypic identification was performed by PCR at the age of 3-4 weeks and the PDHA1flox/floxCre+/- mice were the required mouse model. PDHA1flox/floxCre+/- mice (βKO group, n=5) and Cre+/- mice (control group, n=5) at the age of 4 weeks were selected and received the same water and feed. Tamoxifen (50 mg/kg) was intraperitoneally injected at the age of 8 week to induce gene knockout. Three weeks later, pancreatic tissue, adipose tissue, and liver tissue were removed under anesthesia. qPCR, western blot and immunohistochemical staining were applied to identify the PDHA1 knockout effect and to observe the mouse phenotype.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) PCR analysis selected PDHA1flox/floxCre+/- mice. (2) qPCR method was used to test the pancreas, fat and liver tissues of mice, and it was confirmed that the knockout effect had tissue specificity. The expression level of PDHA1 mRNA in islet in the βKO group was significantly lower than that in the control group. (3) The results of western blot and immunohistochemical scanning showed a significant decrease in PDHA1protein in the βKO group compared with the control group, suggesting the PDHA1 knockout effect was obvious. (4) In summary, the β cell-specific deletion of the PDHA1 gene is successfully constructed by Cre-loxP system, which provides a novel target for studying the pathogenesis of diabetes at animal level.

Key words: diabetes, PDHA1, Cre-loxP system, beta cells, gene

中图分类号:

王肖，赖舒畅，叶艳诗，许雪娟，白晓春，沈洁. 利用Cre/loxP系统构建胰岛β细胞特异性敲除PDHA1基因的小鼠模型[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(31): 5023-5029.

Wang Xiao1, Lai Shuchang1, Ye Yanshi1, Xu Xuejuan1, Bai Xiaochun2, Shen Jie1 . Construction of islet beta cell-specific PDHA1 knockout mice by Cre/loxP system[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(31): 5023-5029.

图/表（结果） 2

2.1 PDHA1^+/+、Cre^+/-小鼠基因鉴定情况将引进的4月龄的PDHA1^flox/flox纯合子小鼠自交，5个月后繁殖出29只小鼠，基因型均为PDHA1^flox/flox纯合子。将PDHA1^flox/flox小鼠与Cre^+/-小鼠杂交，繁殖F1代小鼠。根据孟德尔遗传定律，子代小鼠的基因表型为PDHA1^flox/-Cre^+/-或PDHA1^flox/flox(Cre纯合子小鼠具有胚胎致死性)。在子一代小鼠4周龄时PCR实验筛选基因型为PDHA1^flox/-Cre^+/-小鼠。部分小鼠鉴别结果见图1，2，扩增后的DNA分子在电场中向正极移动，根据分子量的差别，电泳后可呈现迁移位置的差异，条带类型对应基因型。进一步与PDHA1^flox/flox纯合子小鼠杂交，F2代小鼠再次PCR基因筛选，PDHA1^flox/floxCre^+/-小鼠即为所需要的模型小鼠。部分子代小鼠的基因型鉴定结果见图3。选取周龄相同、体质量相近的5只PDHA1^flox/floxCre^+/-小鼠为实验组(βKO组)，5只Cre^+/-小鼠为对照组。被选取小鼠在8周龄时，连续7 d注射药物他莫昔芬(50 mg/kg)进行诱导敲除。

2.2 qPCR法验证敲除效果的组织特异性用qPCR技术分别检测了胰岛、肝脏、脂肪组织中PDHA1 mRNA的相对表达，结果见图4。两组小鼠在肝脏、脂肪组织中PDHA1的mRNA相对表达水平并无明显差异；而在胰岛中βKO组小鼠PDHA1 mRNA的相对含量明显下降(P < 0.01)。证实PDHA1的敲除效应具有胰岛特异性。

2.3 Western Blot、免疫组织化学实验验证PDHA1的敲除效应

2.3.1 Werstern Blot实验结果见图5A。敲除小鼠PDHA1蛋白表达较对照组小鼠明显降低，说明在实验中，利用Cre-Loxp系统原理成功将小鼠胰腺组织中的PDHA1基因敲除，使其蛋白转录和翻译水平下降，表达量降低。因为仅敲除胰腺β细胞中的PDHA1基因，所以在胰腺总蛋白中仍存在部分PDHA1蛋白表达。

2.3.2 免疫组织化学结果见图5B。观察胰岛细胞团可以发现，PDHA1蛋白主要分布于小鼠胰腺的腺管细胞中，在胰岛中也有分布。βKO组小鼠胰岛中PDHA1的表达降低，提示βKO组小鼠胰岛细胞中PDHA1基因敲除成功。此外，实验发现βKO组小鼠体积部分增大，胰岛内细胞排列松散，内有空泡存在，提示PDHA1的敲除作用引起了胰岛β细胞形态的改变，为后续的进一步研究奠定基础。

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引言

糖尿病是一组以慢性血糖升高为主要特征的代谢疾病群，与遗传、自身免疫、环境因素息息相关^[1-2]，其病因主要包括胰岛β细胞的质量受损及功能障碍^[3]，靶组织对于胰岛素敏感性降低等。糖尿病可引起全身碳水化合物、蛋白质和脂肪等代谢异常，继而引发多系统损害^[4]，给社会和家庭带来严重的负担。

近几年来，线粒体能量代谢障碍在糖尿病的影响逐渐被广大科研工作者所重视^[5-6]。丙酮酸脱氢酶复合体(pyruvate dehydrogenase complex，PDHc)存在于线粒体基质中^[7-8]，其主要作用是介导细胞质中的丙酮酸转运进线粒体膜内，并不可逆的将其催化为乙酰辅酶a，后续进入三羧酸循环，彻底氧化分解为水和二氧化碳，同时产生大量的腺嘌呤核苷三磷酸，为细胞和生命的正常维持提供能量^[5-6，9]。当氧气不足或异常病理状态时，丙酮酸脱氢酶复合体的活性减弱，丙酮酸的有氧氧化效率降低，继而乳酸堆积，导致葡萄糖能量代谢障碍，引发后续一系列的代谢性疾病，包括肥胖、2型糖尿病、癌症等^[10]。这两种状态互相竞争互为补充，其中最关键的控制节点为丙酮酸脱氢酶复合体丙酮酸脱氢酶复合体。因此，丙酮酸脱氢酶复合体被认为是能量和代谢稳态的关键调控因子，是联系糖代谢和能量代谢的重要“枢纽”。

丙酮酸脱氢酶复合体主要由丙酮酸脱氢酶(E1)，二氢硫辛酰胺转移酶(E2)、以及二氢硫辛酰胺脱氢酶(E3)组成^[11-12]。丙酮酸脱氢酶E1是由2个a亚单位(pyruvate dehydrogenase E1 a subunit，PDHA1)和2个β亚单位组成的异构四聚体；可使丙酮酸去羧基并将乙酰基(CoA)转移至E2上发挥作用，是3种酶中最重要的一种，对丙酮酸脱氢酶复合体的调控起到了决定性的作用^[13]。PDHA1基因缺陷也是导致丙酮酸脱氢酶复合体酶活性改变最常见的原因^[6]，PDHA1蛋白表达的正常与否决定着线粒体内能量代谢是否能正常进行。

既往研究表明，2型糖尿病啮齿类动物模型及人体的丙酮酸脱氢酶复合体表达量降低^[^7，^14]，提示丙酮酸脱氢酶复合体在糖尿病的发生发展中起到重要作用。但多数研究主要集中在细胞和分子层面^[1⁵^]，且目前国内外关于PDHA1在胰腺β细胞中的影响探究尚不深入。为了进一步了解丙酮酸脱氢酶复合体在体内胰岛β细胞中的作用，作者通过Cre-LoxP系统原理^[1⁶^-1⁷^]，选取PDHA1^loxp/loxp小鼠与胰岛β细胞特异性表达Cre重组酶的Ins1-Cre/ERT小鼠进行数代杂交，成功构建可诱导性胰岛β细胞特异性敲除PDHA1的小鼠。为探究2型糖尿病的潜在发病机制提供动物模型，为糖尿病的治疗提供新的分子靶点。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计构建可诱导性胰岛β细胞敲除PDHA1基因的转基因小鼠，进行鉴定并观察。

1.2 时间及地点实验于2017年9月至2018年12月在南方医科大学第三附属医院广东省重点实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 PDHA1^loxp/loxp小鼠B6.129P2- Pdha1tm1Ptl/JJAX#017443小鼠(以下简称PDHA1小鼠)，由美国JACKSON实验室引进；条件性胰岛β细胞特异性表达：Cre重组酶小鼠B6.Cg-Tg (Ins1-cre/ERT)1Lphi/J 小鼠(JAX # 024709，以下简称Cre小鼠)由上海茂生生物有限公司代理从美国 JACKSON 实验室所引进。所有小鼠繁殖饲养于南方医科大学第三附属医院重点实验室，层流动物房内。提供充足的饲料与洁净水，室内温度在20-22 ℃，湿度范围40%-60%，12 h光照，昼夜交替。动物实验经过南方医科大学伦理委员会审核(NO. L2015069)。

1.3.2 试验用主要试剂鼠尾裂解液(A/B液)：A液(0.5% SDS、0.1 mol/L NaCl、0.05 mol/L EDTA、0.01 mol/L Tris-HCl pH 8.0、蛋白酶K 100 mg/L)，B液(NaOH 1 mol/L)； DNA Marker(Thermo Scientific)；PDHA1引物及Cre引物由上海生物工程有限公司合成；EB类似物(GR501-01)、PCR mix及qPCR mix均购于南京诺唯赞生物科技有限公司；PDHA1一抗(Abcam)、荧光二抗(Abcam)、insulin一抗(Santa Cruz)；琼脂糖粉末(BioFROXX)、PVDF膜(BIO-Rad)、DAPI(Invitrogen)；其他常用试剂如脱脂奶粉、EDTA、PBS粉末、TBS粉末、Tris-HCl、HCl、NaOH等均为国产(广州)。其他常用材料：免疫组织化学笔，枪头(NEST)等。

1.3.3 试验用主要仪器实验室pH计STARTER 3100(美国OHAUS)、倒置荧光显微镜(含图像采集系统)IX53(日本奥林巴斯)、凝胶化学发光成像机(含图像分析系统)(香港GeneGnome)、组织研磨机XHF-D(宁波SCIENTZ)。

1.4 实验方法

1.4.1 胰岛β细胞特异性敲除PDHA1小鼠模型的构建流程基于Cre-LoxP系统理论，选取PDHA1^loxp/loxp小鼠与Cre^+/-小鼠交配，基因PCR扩增筛选出F1代小鼠基因型为PDHA1^loxp/-Cre^+/-。 F1代小鼠再与PDHA1^loxp/loxp小鼠交配，再次基因筛选得到PDHA1^loxp/loxpCre^+/-小鼠即为实验需要构建的敲除动物模型基因型。Cre重组酶在药物他莫昔芬的诱导下，可特异性切除2个LoxP锚定位点间的序列。因此通过控制外源性注射他莫昔芬的注射时间，可在特定时间点得到可诱导性的胰岛β细胞PDHA1基因敲除小鼠。所有动物均在层流动物房饲养繁殖，房间内温度22-25 ℃，湿度40%-70%，人工造光昼夜交替各12 h，提供充足的水和维持饲料，每4 d换1次垫料。

1.4.2 鼠尾DNA的提取及基因型鉴定

(1)碱裂解法提取鼠尾DNA：小鼠于三四周龄时麻醉后用眼科剪剪取小鼠尾部长3.0-4.0 mm，移入1.5 mLEP管中，加入100 μL鼠尾裂解液A液，金属水浴锅100 ℃加热1 h，后加入100 μL鼠尾裂解液B液，震荡混匀后放置至室温，提取上清液-20 ℃保存。

(2)PCR扩增及琼脂糖凝胶成像分析：按照下述配比混合PCR扩增反应体系(20 μL)：2*Taq Plus Master Mix (10 μL)， PDHA1基因上下游引物各2 μL(Cre基因引物及Cre内参引物各1 μL)(10 μm)、样品DNA 2 μL，加ddH₂O补足反应体系。

反应条件：①PDHA1基因第1阶段94 ℃预变性2 min；94 ℃变性20 s、65 ℃退火15 s、68 ℃延伸10 s，10个循环；第2阶段94 ℃变性15 s、50℃退火15 s、72 ℃延伸 10 s，28个循环；第3阶段72 ℃延伸2 min；10 ℃保存备用；②Cre基因第1阶段94 ℃预变性2 min；94 ℃变性 20 s、65 ℃退火15 s、68 ℃延伸10 s，10个循环；第2阶段94 ℃变性15 s、60 ℃退火15 s、72 ℃延伸10 s，28个循环；第3阶段72 ℃延伸2 min；10 ℃ 保存备用。将2种基因的PCR扩增产物进行2%琼脂凝胶电泳(140 mV)，上样量6 μL，DNA marker 4 μL，40 min后凝胶发光成像机拍摄并分析结果。具体引物信息见表1。

1.4.3 胰岛β细胞特异性敲除PDHA1的小鼠模型诱导 PCR基因鉴定后，选取4周龄、体质量相似的PDHA1^flox/floxCre^+/-小鼠(简称为 βKO小鼠)与Cre^+/-小鼠(简称为对照小鼠)各5只，均培养于层流动物房内，给予相同的水和饲料。用玉米油配置他莫昔芬溶液5 g/L，分装后-20 ℃避光储存。在小鼠成年(8周龄)后，对两组小鼠连续7 d注射药物他莫昔芬(50 mg/kg)进行诱导敲除，继续层流动物房饲养观察3周。

1.4.4 标本处理小鼠用2%的戊巴比妥(80 mg/kg)腹腔注射麻醉行安乐死。延腹部正中线剪开皮毛，暴露腹腔，取材胰腺组织、脂肪组织、肝脏组织。①提取胰岛细胞、脂肪、肝脏组织总RNA：将组织放入液氮快速冷冻，在无RNAase的研钵中，加入少量液氮进行研磨，使组织成粉末状。用1.5 mL无RNAase的离心管收集组织粉末并标记。向1.5 mL无RNAase的离心管中约加入1 mLTrizol溶液(按每 25 mg组织样品加入Trizol溶液500 μL)。在4 ℃ 12 000×g离心，5 min后，取上清液至新的无RNAase离心管；②提取胰腺组织的蛋白：将组织放入液氮研磨，向研磨后的EP管中加入混有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液(RIPA Lysis Buffer)1 mL，测完蛋白浓度后加入SDS-PAGE loading buffer 溶液，-80 ℃冰箱保存备用；③固定脱水包埋：将胰腺组织放入40 g/L多聚甲醛中，4 ℃固定24 h，取适当大小的组织块放入包埋盒中，细流水冲洗6 h。脱水后进行石蜡包埋。

1.4.5 qPCR分析胰岛、脂肪、肝脏组织中PDHA1 mRNA相对表达用紫外分光光度计测定胰岛、脂肪、肝脏组织总RNA在A₂₆₀及A₂₈₀值，选取A₂₆₀/A₂₈₀比值介于1.8-2.0间的RNA进行反转录。合成cDNA作为模板进行qPCR反应，反应体系为模板cDNA 2 μL，PDHA1上下游引物各0.4 μL，GAPDH上下游引物各0.4 μL，ddH₂O 7.2 μL。反应条件为95 ℃ 10 s， 60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共计45个循环，每个样品3个复孔。

1.4.6 Western blot 检测两组小鼠胰腺组织PDHA1蛋白表达取小鼠的胰腺组织，液氮冰冻后研磨机粉碎，加入RIPA裂解液提取组织总蛋白。取胰腺蛋白样品，10% SDS-PAGE制胶电泳恒流32 mA，70 min。PVDF膜转模(恒压100 mV，75 min)，5%脱脂奶粉(TBST缓冲液配制)封闭1 h后，PDHA1及GAPDH一抗稀释液4 ℃摇床孵育过夜，TBST缓冲液洗3次，每次5 min；辣根过氧化物酶标二抗室温孵育2 h，洗脱3次，每次3 min。ECL化学发光法显像，曝光时间可按照发光信号的强弱进行调整，测定灰度值。

1.4.7 免疫组织化学染色定位PDHA1蛋白在胰岛中的分布及表达小鼠的胰腺组织用40 g/L多聚甲醛固定24 h，将石蜡包埋后的蜡块放置在-20 ℃冰箱冰冻2-4 h，取出后进行切片，厚度为3.0-4.0 μm。脱蜡水化后，将载玻片放入枸盐酸缓冲液中，60 ℃，14-16 h取出，PBS洗涤3次，每次5 min。滴加体积分数3%H₂O₂溶液，37 ℃ 烘箱15 min，PBS洗涤3次，每次5 min。封闭后滴加PDHA1一抗(稀释比例1∶500)，4 ℃孵育14 h。滴加二抗孵育2 h后PBS洗涤3次，每次5 min。DAB染色5 min后，苏木精染细胞核。梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，光学显微镜下观察。

1.5 主要观察指标 ①PDHA1小鼠与Cre小鼠杂交后，子代小鼠鼠尾PCR基因型鉴定结果；②qPCR检测胰岛、脂肪、肝脏组织中PDHA1 mRNA相对表达；③Western blot 检测两组小鼠胰腺组织PDHA1蛋白表达；④免疫组织化学染色定位PDHA1蛋白在胰岛中的分布及表达。

1.6 统计学分析采用SPSS 22.0软件对所有数据进行统计分析，两组样本间数据分析采用两独立样本t 检验分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

PDHA1作为调控线粒体丙酮酸脱氢酶复合物丙酮酸脱氢酶复合体的关键性因素^[10^，¹⁸^]，在糖酵解后介导丙酮酸氧化的中枢代谢进程起到不可或缺的影响，也对葡萄糖代谢β细胞分泌胰岛素过程起到至关重要的作用。葡萄糖通过丙酮酸脱氢酶复合体丙酮酸脱氢酶复合体的调控转化为乙酰辅酶A，进入三羧酸循环生成ATP，当丙酮酸脱氢酶复合体的活性降低时，可通过其他途径转化为葡萄糖、甘油、脂肪酸和非必需氨基酸。这种转化是不可逆的，是葡萄糖转化为ATP进而氧化磷酸化提供能量的必经之路，也体现出细胞处理及转化的能力^[1⁴^]。在心脏中敲除PDHA1基因，小鼠心脏结构重塑，心肌舒张功能受损^[¹⁹^]。在代谢方面，研究者发现肥胖患者及2型糖尿病患者心脏中PDH活性降低，肥胖性心肌病中PDH通量受损^[2⁰^-2¹^]，导致葡萄糖代谢的丙酮酸转化为乙酰辅酶A的量减少，最常见的为心室重构及心脏舒张功能受损^[¹⁹^]。在骨骼肌中，禁食及饥饿状态下的人类和啮齿类动物骨骼肌PDH E1的活性降低^[2²^]，有氧运动时机体也会通过调节PDH的活性促进ATP的生成^[2³^]。实验证明，在INS-1 832/13细胞系中激活PDH的活性会导致β细胞胰岛素分泌增多^[2⁴^]，证明PDH与β细胞糖代谢相关。由此可见，PDH在细胞组织的生长、发育、生理状态的维持方面都有着不可替代的作用。但目前对于PDHA1的研究主要集中在细胞和分子水平，无法分析动物胰岛β细胞敲除PDHA1基因后对β细胞形态和功能的影响。因此此次实验主要通过调控药物他莫昔芬注射时间，构建成年小鼠β细胞特异性敲除PDHA1基因的模型。

Cre-loxP重组系统是一种条件性的、诱导性的基因打靶技术，已被广泛应用于基因的基础研究中，通过Cre重组酶介导的位点在特异性的时间或空间对目的基因进行敲除^[1⁶^，²⁵^]。其基本原理为同源重组技术，是指发生在非姐妹染色单体之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子或分子之内的重新组合，重组后的染色体可以产生新的表达状态，如序列间颠倒、交换、易位、缺失等^[1⁷^]。现在科研中最常使用的是他莫昔芬tamoxifen诱导的Cre突变体，其在有他莫昔芬存在的状态下，Cre重组酶才能介导锚定基因重组。Cre重组酶是一种特异性位点重组酶^[2⁶^]，能介导两个34 bp的LoxP之间的位点特异性重组，使LoxP位点间的序列位点或基因被删除^[2⁷^]。因Cre的纯合子小鼠具有胚胎致死性，此次研究利用PDHA1^loxp/loxp小鼠与Cre^+/-杂合子小鼠杂交繁殖数代后PCR技术筛选，成功得到基因型为PDHA1^loxp/loxp Cre^+/-小鼠，后续用他莫昔芬溶液进行诱导性敲除，发现敲除小鼠在毛发、体型、繁殖能力方面与正常小鼠无差异，可能是因为此次敲除基因效应只存在于胰岛β细胞中，其他组织及器官对PDHA1基因的缺乏有补偿性作用。此次实验在小鼠中构建胰岛β细胞特异性敲除PDHA1基因的小鼠，通过调控他莫昔芬诱导剂的注射时间，实现在成年后(8周)雄鼠中诱导特定基因的敲除。目前国内外研究对于在成熟小鼠中诱导胰腺特异性敲除PDHA1基因的动物模型非常稀少，一是因为制作敲除基因小鼠的模型生长繁殖时间较长，小鼠饲养繁殖条件较高；二是涉及到PDH的机制错综复杂，研究难度较大；此外，对于胰腺组织的研究对实验设备的相求相对较高，因此这也是国内首次在成熟的小鼠中诱导胰腺β细胞PDHA1基因敲除小鼠。

此外，部分Cre重组酶的启动子可能并不完全符合区域及组织的特异性，所以在构建的敲除小鼠肝脏、胰岛、脂肪组织中检测了PDHA1 mRNA相对含量，初步从mRNA水平验证了PDHA1基因在胰岛中转录水平明显降低。继而用Western blot法对胰腺组织中PDHA1蛋白含量进行检测，结果发现，敲除小鼠PDHA1蛋白水平较对照组明显降低，但仍存在部分目的蛋白的表达，考虑可能是因为敲除效应仅存在于胰岛β细胞中，PDHA1蛋白在胰腺其他组织中仍有部分表达。后续用免疫组织化学等方法观察敲除组小鼠胰腺组织，发现PDHA1蛋白在胰腺中主要表达于腺管细胞中，胰岛中也有表达，且敲除小鼠胰岛β细胞中PDHA1无表达，提示诱导性敲除PDHA1的转基因小鼠造模成功。此外，实验发现，敲除小鼠胰岛β细胞体积部分增大，胰岛细胞团排列疏松，内含空泡。提示PDHA1的敲除作用引起了胰岛β细胞形态的改变，为后续的进一步研究奠定基础。

线粒体能量代谢在2型糖尿病中起到的作用逐渐被人们所认知^[10^，²⁸^]，线粒体代谢在控制胰岛素和β细胞释放中的关键作用，意味着可以通过控制线粒体功能的相关机制，缓解甚至可能逆转2型糖尿病的发病进程。这是国内首次在成年小鼠胰岛β细胞中诱导性敲除PDHA1基因，为深入了解线粒体丙酮酸代谢在糖尿病中的作用提供了实验模型。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

利用Cre/loxP系统构建胰岛β细胞特异性敲除PDHA1基因的小鼠模型

Construction of islet beta cell-specific PDHA1 knockout mice by Cre/loxP system

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