2.1  实验动物数量分析  实验选用大鼠60只，分为6组，实验过程无脱失，全部进入结果分析。

2.2  大鼠实验后肝指数  实验后各组大鼠体质量无显著差异；与普通饮食对照组相比，高脂饮食组肝脏湿质量、肝指数(肝脏湿质量/体质量)显著升高(P < 0.05)^[14]；与高脂饮食组相比，高脂饮食安慰剂组上述指标无显著变化，而高脂饮食运动组、高脂饮食大蒜素组、高脂饮食运动联合大蒜素组的肝脏湿质量、肝指数均显著下降(P < 0.05)，其中高脂饮食运动联合大蒜素组明显小于高脂饮食运动组、高脂饮食大蒜素组(P < 0.05)。见表1。

2.3  大鼠肝组织苏木精-伊红染色形态学观察及非酒精性脂肪肝活动度积分  普通饮食对照组大鼠肝组织结构正常，肝小叶清晰可见，肝细胞排列整齐，细胞核呈圆形、位于细胞中央，核膜完整。高脂饮食组及高脂饮食安慰剂组为重度脂肪肝：肝小叶结构不清晰，肝细胞中出现大量大小不等的脂滴、呈弥漫性脂肪变性，肝细胞有气球样变，肝小叶内有明显炎症细胞浸润；高脂饮食运动组与高脂饮食大蒜素组为中度脂肪肝：肝小叶结构不够清晰，可见有脂肪变性、但不如高脂饮食组及高脂饮食安慰剂组明显，肝细胞出现气球样变，肝小叶内出现炎症细胞浸润；高脂饮食运动联合大蒜素组为轻度脂肪肝：肝小叶结构清晰，肝细胞脂肪变性比较轻微，肝细胞无明显气球样变，肝小叶内无明显炎症细胞浸润^[15]。见图1。各组大鼠肝组织各项病变得分及非酒精性脂肪肝活动度积分比较详见表2。

2.4  大鼠血清肝功能指标水平  与普通饮食对照组相比，高脂饮食组谷丙转氨酶、谷丙转氨酶浓度显著升高(P < 0.05)；与高脂饮食组相比，高脂饮食安慰剂组上述肝功指标的异常水平没有明显改善，而高脂饮食运动组、高脂饮食大蒜素组、高脂饮食运动联合大蒜素组的则得到明显改善(P < 0.05)；此外，高脂饮食运动联合大蒜素组谷丙转氨酶、谷丙转氨酶浓度又显著低于高脂饮食运动组、高脂饮食大蒜素组(P < 0.05)。见表3。

2.5  大鼠血脂水平  与普通饮食对照组相比，高脂饮食组总胆固醇、三酰甘油及游离脂肪酸浓度显著升高(P < 0.05)；与高脂饮食组相比，高脂饮食安慰剂组上述指标的异常变化无明显改善，而高脂饮食运动组、高脂饮食大蒜素组、高脂饮食运动联合大蒜素组的明显改善(P < 0.05)；此外，高脂饮食运动联合大蒜素组总胆固醇、三酰甘油及游离脂肪酸浓度又均低于高脂饮食运动组、高脂饮食大蒜素组(P < 0.05)。见表4。

2.6  大鼠肝组织的血红素加氧酶1活性、丙二醛含量  与普通饮食对照组相比，高脂饮食组大鼠肝组织血红素加氧酶1活性显著下降、丙二醛含量显著上升(P < 0.05)；与高脂饮食组相比，高脂饮食安慰剂组上述指标水平的异常变化无显著改善，而高脂饮食运动组、高脂饮食大蒜素组得到明显改善(P < 0.05)；另外，高脂饮食运动联合大蒜素组血红素加氧酶1活性要显著高于高脂饮食大蒜素组(P < 0.05)，高脂饮食运动联合大蒜素组丙二醛含量分别显著低于高脂饮食运动组、高脂饮食大蒜素组(P < 0.05)。见表5。

近年来，由于高脂饮食及运动缺乏，使得血脂异常及非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver，NAFLD)发病率呈逐年上升趋势^[1]。非酒精性脂肪肝可发展为肝纤维化、肝硬化等^[2-3]。因此，进一步探寻非酒精性脂肪肝的防治措施具有重要意义。耐力运动具有调节血脂异常及预防非酒精性脂肪肝等的作用，但其机制有待进一步研究。此外，大蒜素(Allicin)具有降脂、抗氧化及防治心血管疾病、护肝、抗菌、抗病毒、抗肿瘤等多种功效^[4-9]；因此，大蒜素在抗非酒精性脂肪肝上可能有重要应用前景，但此类研究目前并不多见。研究试图观察规律的中强度耐力运动与大蒜素在抗高脂饮食大鼠脂肪肝形成作用中是否具协同效应，并对其相关机制进行初步探讨。研究以期丰富非酒精性脂肪肝的预防理论体系，并为非酒精性脂肪肝的有效预防提供参考方法。

1.1  设计  随机对照动物实验。

1.2  时间及地点  实验于2018年4月至11月在广西师范大学体育学院基础实验室完成。

1.3  材料  

1.3.1  实验动物  成年雄性SD大鼠60只，SPF级，体质量(346±47)g，由广西医科大动物中心提供。大鼠自购回后以普通饮食适应性喂养1周。

1.3.2  高脂饲料及大蒜素  高脂饲料组成：普通饲料 85.5%，猪油7%，胆固醇2%，胆酸盐0.5%，白糖5%，由南京安立默科技有限公司提供；大蒜素：购自浙大药业有限公司，将大蒜素用蒸馏水配制成质量浓度为3 g/L的溶液，按30 mg/(d•kg)剂量对大鼠灌胃给药^[5]。

1.3.3  实验用主要试剂  谷丙转氨酶、谷草转氨酶及游离脂肪酸试剂盒(购自南京建成)；三酰甘油、总胆固醇试剂盒(购自北京北化康泰临床试剂有限公司)；瑞典TECAN 酶标仪(Infinite M 1000型)；上海棱光722 S型可见光分光光度计；RIPA、BCA、ECL试剂(上海碧云天)；BSA试剂(美国Sigma )；TBST (北京索莱宝)；一抗(美国Abzoom)；羊抗兔IgG抗体(二抗)(北京奥博星)；鼠抗辣根过氧化物酶标记的IgG抗体(二抗)(北京中杉金桥)。

1.4  实验方法

1.4.1  动物分组  60只大鼠随机分为普通饮食对照组(n=10)、高脂饮食组(n=10)、高脂饮食安慰剂组(n=10)、高脂饮食运动组(n=10)、高脂饮食大蒜素组(n=10)及高脂饮食运动联合大蒜素组(n=10)。

1.4.2  大鼠高脂饮食脂肪肝模型建立  参考文献[7]建立大鼠高脂饮食脂肪肝模型。根据实验设计，普通饮食对照组大鼠采用普通饲料喂养，其余组大鼠采用高脂饲料喂养，均自由饮食；每日清晨对高脂饮食大蒜素组、高脂饮食运动联合大蒜素组大鼠进行大蒜素液灌胃，按30 mg/(d • kg) 剂量给药；高脂饮食安慰剂组则用同等体积剂量的蒸馏水灌胃。此外，高脂饮食运动组、高脂饮食运动联合大蒜素组大鼠在小动物跑台上按坡度为5°、转速为12 m/min的参数参加耐力跑锻炼，该跑步参数对应的运动强度大约为 60%最大摄氧量强度，属于中等强度^[10-11]；每天跑30 min、每天1次、每周6 d(周日休息)，共7周。

1.5  主要观察指标

1.5.1  血清样本制备及其指标检测  末次实验后大鼠隔夜禁食12 h，称质量并记录；大鼠腹腔注射2%戊巴比妥纳麻醉后，腹主动脉取血5 mL，台式冷冻离心机离心(4 ℃，3 500 r/min，15 min)后取血清，-70 ℃冰箱中保存，用于谷丙转氨酶、谷草转氨酶与总胆固醇、三酰甘油及游离脂肪酸等水平的检测。血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶水平采用卡门氏法检测；三酰甘油、总胆固醇采用酶法测定，游离脂肪酸采用化学比色法测定。

1.5.2  肝组织形态学样本制备及其观察  冰水浴中迅速摘取大鼠肝脏，称质量，在PBS中清洗并用滤纸吸干，然后在肝最大叶边缘1 cm处取一块肝组织置于体积分数10%甲醛中固定24 h，石蜡包埋，逐级脱水，制成5 μm厚石蜡切片，苏木精-伊红染色，置于日本Olympus生物显微镜(BX 45型)下观察并拍照，并计算非酒精性脂肪肝活动度积分(non-alcoholic fatty liver disease activity score，NAS) ^[12]。

1.5.3  Western Blotting检测肝细胞血红素加氧酶1蛋白定量  另取肝最大叶边缘1 cm处的一块肝组织，液氮处理后置-80 ℃冰箱中保存备用。使用时，称取适量肝组织，按组织(质量)：裂解液(体积)为20 mg∶200 μL这一比例加入 RIPA裂解液，再按要求加入PMSF(Amresco公司)裂解至没有明显沉淀后静置半小时，离心(12 000 r/min，4 ℃)  10 min 取上清，采用BCA法对上清液中肝细胞总蛋白进行定量^[13]。然后取5 μL上清液进行0.15 g/mL的SDS-PAG E 蛋白电泳(80 V恒压)，完毕后转移分离条带(65 V恒压，    4 ℃，2 h)至PVDF膜上，室温下BSA封闭1 h，加兔抗血红素加氧酶1多克隆抗体(1∶1 000)或鼠抗人β-actin单克隆抗体(1∶1 000)，4 ℃温度下反应过夜；TBST洗膜    10 min×3，加二抗即羊抗兔IgG抗体(1∶3 000)或鼠抗辣根过氧化物酶标记的IgG抗体(1∶3 000)，避光室温摇床1 h，再次TBST洗膜10 min×3。ECL法显影，Gel-pro analyzar 软件分析电泳条带灰度面积值，计算目的条带值/β-actin 条带值。

1.5.4  肝组织匀浆制备及其指标测定  称取部分冻存肝组织，按组织(质量)：裂解液(体积)为=1 mg∶5 μL这一比例加入预冷的Tris/HCl(pH 7.4) 缓冲液，制成200 g/L组织匀浆，过滤并采用2 000 r/min的转速离心20 min×2，取上清再以120 000 r/mim 的转速离心90 min，用磷酸钾缓冲液制成微粒体悬浮液。采用双缩脲法对其总蛋白浓度进行定量后，使用双波长分光光度计测定其血红素加氧酶1(Haem oxyge non-alcoholic fatty liver disease activity scoree-1，HO-1)活性。另取约30 mg的冻存肝组织，称质量，按照组织(质量)：裂解液(体积)为=1 mg∶10 μL加入预冷的NaCl，制成100 g/L组织匀浆，3 500 r/min离心    10 min，取上清，考马斯亮蓝法测定总蛋白，硫代巴比妥酸法测定丙二醛含量。所用试剂购自南京建成。

1.6  统计学分析  实验数据均采用x(_)±s表示。统计分析采用SPSS for windows 17.0统计分析软件完成，普通饮食对照组、高脂饮食组组间比较采用独立样本t 检验，各高脂饮食组间比较采用析因设计方差分析。以P < 0.05作为差异具有显著性的标准。

3.1  高脂饮食大鼠血三酰甘油、游离脂肪酸、总胆固醇浓度升高及脂质过氧化反应增强与脂肪肝  非酒精性脂肪肝是指与过量饮酒无关的脂肪肝，长期高脂饮食容易诱发非酒精性脂肪肝。因为高脂饮食可导致机体血脂异常及肝脏活性氧水平增加。

由于血液三酰甘油升高，则生成更多的游离脂肪酸，游离脂肪酸入肝内致肝细胞内游离脂肪酸浓度升高，于是肝脏内游离脂肪酸重新合成三酰甘油并沉积于肝脏；游离脂肪酸还具有细胞毒性，可直接损害线粒体膜，使线粒体膜通透性升高，引发肝细胞变性坏死^[16]。此外，肝脏做为血液总胆固醇代谢唯一器官及储存的主要器官，当血液总胆固醇浓度升高时，肝脂肪代谢紊乱，进而导致肝脏脂肪沉积。但是，至今非酒精性脂肪肝的具体发生机制也没明确，目前多数学者认为氧化应激与脂质过氧化反应的“二次打击”是一个重要机制^[17]。丙二醛作为细胞脂质过氧化反应的主要终极产物，可用于衡量体内脂质过氧化水平；脂质过氧化反应可导致脂肪变性的肝细胞进一步出现炎症，从而诱发非酒精性脂肪肝。此外，丙二醛自身可水解载脂蛋白B-100，抑制三酰甘油生成极低密度脂蛋白胆固醇，并进一步抑制肝脏向肝外输出脂肪酸，导致肝脏脂肪堆积；丙二醛还可通过激活转录因子诱导活性的生成，进一步导致肝细胞的损伤及坏死^[18-19]。血红素加氧酶1做为肝脏内重要的抗氧化酶系，对维持肝脏活性氧水平、减少脂质过氧化有重要作用；可见血红素加氧酶1功能降低，将导致体内活性氧生成增多，损害肝细胞，诱发非酒精性脂肪肝^[20]。

因此，此次研究中，高脂饮食可致大鼠血三酰甘油、游离脂肪酸、总胆固醇浓度升高，肝脏血红素加氧酶1活性下降、脂质过氧化反应(丙二醛含量)增强，肝脏出现脂肪变性及功能障碍。这表明血三酰甘油、游离脂肪酸、总胆固醇浓度升高及肝脏脂质过氧化反应增强可以导致脂肪肝^[21-22]。

3.2  耐力运动联合大蒜素对高脂肪饮食大鼠血三酰甘油、游离脂肪酸及总胆固醇浓度的干预作用与肝保护   适当强度的耐力运动可以改善大鼠血脂代谢异常，加强肝脏对总胆固醇的代谢作用及脂肪酸的β-氧化，提高脂蛋白脂肪酶活性、加速水解三酰甘油，提高骨骼肌对游离脂肪酸的利用^[23-26]。此次研究的中强度耐力运动可以抵抗高脂饮食大鼠血液三酰甘油、游离脂肪酸、总胆固醇浓度及肝指数等的增加，减少肝脏发生脂肪样变及保护肝脏功能，发挥抗非酒精性脂肪肝形成作用；另外，大蒜素也有类似效应。大蒜素做为一种具有多重保健功效的生物活性物质，其降脂作用一方面可能是通过增加脂质分解来抑制肝脏总胆固醇、脂肪酸等合成酶来实现，另一方面可能是通过促进各脂蛋白间的代谢与转化来实现^[27-28]；关于大蒜素降脂作用的具体分子机制还需要进一步实验研究。此次研究中，可能由于中强度耐力运动和大蒜素在降低高脂饮食大鼠血液三酰甘油、游离脂肪酸及总胆固醇浓度方面有协同效应，因此二者在抗非酒精性脂肪肝形成方面具有协同作用。

3.3  耐力运动联合大蒜素对高脂肪饮食大鼠肝脏脂质过氧化反应的干预作用与肝保护   此次研究发现，高脂饮食导致大鼠肝脏脂质过氧化反应水平升高，而中强度耐力运动和大蒜素均可改善这一异常情况，且具有协同效应。以往有研究证实，耐力运动可经PKC-Nrf2途径诱导肝脏血红素加氧酶1蛋白表达及并增强其活性^[29]，结合此次研究中肝脏血红素加氧酶1的蛋白表达及活性变化，可以认为：中强度耐力运动通过提高肝脏血红素加氧酶1的蛋白表达及活性，来控制高脂饮食大鼠肝脏脂质过氧化反应；而大蒜素未诱导肝脏抗氧化酶如血红素加氧酶1的蛋白表达，可见大蒜素是做为一种外源性抗氧化剂来控制高脂饮食大鼠脂质过氧化反应。如此一来，中强度耐力运动与大蒜素在抗高脂饮食大鼠肝脏脂质过氧化反应方面具有协同效应。由于脂质过氧化反应的“二次打击”是非酒精性脂肪肝(形成的一个重要机制，因此，中强度耐力运动与大蒜素抗脂质过氧化反应的协同效应，可能是二者协同预防非酒精性脂肪肝发生的机制。

结论：①高脂饮食可引起大鼠血液 三酰甘油、游离脂肪酸及总胆固醇浓度升高，引起肝脏血红素加氧酶1活性下降及脂质过氧化反应水平升高，最终导致脂肪肝；②中强度耐力运动和大蒜素对高脂饮食大鼠诱导血脂异常、肝脏脂质过氧化反应水平增加及非酒精性脂肪肝的发生具有协同抵抗效应。

耐力性运动，又称有氧运动，是运动处方最主要和最基本的运动手段。在治疗性运动处方和预防性运动处方中，主要用于心血管、呼吸、内分泌等系统的慢性疾病的康复和预防，以改善和提高心血管、呼吸、内分泌等系统的功能。在健身、健美运动处方中，耐力性(有氧)运动是保持全面身心健康、保持理想体重的有效运动方式。