2.1  细胞形态  倒置显微镜观察分离纯化的第3代成骨细胞，该细胞为单层细胞，且细胞形态多样，大多呈现三角形、单核、梭形以及多边形等，有较多突起，以“铺路石”样排列，细胞紧密排列如图1符合成骨细胞特点。

2.2  成骨细胞中丙二醛和超氧化物歧化酶水平变化  与空白组比较，模型组成骨细胞裂解液中丙二醛的含量显著升高，超氧化物歧化酶含量明显降低(P < 0.05)；左归丸组成骨细胞裂解液中丙二醛含量明显低于模型组(P < 0.05)，超氧化物歧化酶含量明显高于模型组。见表1。

2.3  茜素红染色  汇合时的细胞大多呈现出多层重叠生长的情况，局部细胞会堆集成灶状，经茜素红染色钙结节程橘红色。结果表明，左归丸组比模型组成骨细胞矿化能力明显增加，见图2。诱导21 d时空白组碱性磷酸酶活力明显强于其余2组(P < 0.05)，左归丸组碱性磷酸酶活力显著强于模型组(P < 0.05)，见图3。

2.4  各组对成骨细胞中HO-1和Nrf2蛋白表达影响  与模型组比较，空白组可以明显降低HO-1和Nrf2表达(P < 0.05)，左归丸组相比于模型组能够显著增加HO-1和Nrf2蛋白的表达(P < 0.05)，表明左归丸能够增加成骨细胞氧化损伤过程中HO-1和Nrf2蛋白的表达。见图4。

骨质疏松症是一种多种病因引起的破骨细胞和成骨细胞失衡，是以单位体积内骨组织量减少为特点的代谢性骨病变，在临床经常表现为骨脆性增加、骨折率提高，严重影响患者生活质量^[1-2]。骨质疏松类疾病分为原发性、继发性及特发性，其中原发性骨质疏松中由绝经引发的骨质疏松一直是发病率的首位，成为影响患者生存的重要社会问题。2016年中国骨质疏松症总患病率为12.4%，总人数已超过1.6亿，预计到2020年，中国的骨质疏松患者和低骨量患者人数将增加至2.8亿人^[2]。最新研究发现氧化应激在骨质疏松症中发挥着重要作用。氧化应激反应是指机体活性氧(ROS)或活性氮清除不足，机体的氧化/还原失衡，从而导致组织和细胞发生氧化损伤的病理过程。氧化应激反应可诱导成骨细胞凋亡，抑制成骨细胞自噬^[3-4]。目前抗骨质疏松的研究正逐渐以氧化应激为中心^[5]。当氧化应激反应将骨组织的破骨细胞和成骨细胞动态平衡打破时即产生骨质疏松^[6]，因此，抗氧化损伤药物可能成为一种新型的治疗骨质疏松药物。

中医学认为骨质疏松属于“骨痹”“骨痿”“骨枯”等范畴。《素问·痿论》曰：“肾者水脏也，今水不胜火，则骨枯而髓虚，故足不任身，发为骨痿”。肾精亏虚，左归丸是中医经典方剂之一，为“阳中求阴”的代表方，具有滋肾补阴的功效和纯补无泻的特点。用于治疗肾阴虚型绝经后骨质疏松，能够显著改善绝经后骨质疏松患者的骨密度，缓解其临床症状，抑制破骨细胞骨吸收、降低骨转换^[7]。同时研究发现左归丸对去势大鼠骨组织胶原蛋白具有调控作用，影响骨钙素含量，促进骨形成，抑制骨吸收，从而发挥抗骨质疏松作用^[8]。因此，研究通过观察左归丸对成骨细胞氧化损伤模型中超氧化物歧化酶和丙二醛水平、成骨细胞增殖和分化能力、核因子E2相关因子2(nuclear factor-E2 related factor 2，Nrf2)和血红素加氧酶(heme oxygenase-1，HO-1)蛋白表达影响，探讨左归丸治疗骨质疏松的作用及机制。

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1.1  设计  细胞学实验观察。

1.2  时间及地点  实验于2018年1至5月在哈尔滨医科大学附属第二医院实验中心完成。

1.3  材料

1.3.1  实验动物  清洁级4周龄SD大鼠20只，体质量140- 180 g，购于黑龙江中医药大学动物实验中心，饲养温度(23±2) ℃；相对湿度(55±15)%；风速0.1-0.2 m/s。SD乳鼠用于成骨细胞分离，实验动物合格证号SCK黑2015004。

1.3.2  药物与试剂  胎牛血清、MEMα培养基、青霉素-链霉素混合液和胰酶(Hyclone，美国)，CCK8(同仁，CK04，日本)，HO-1(Abcam，ab13248，美国)，Nrf2(Abcam，ab137550，美国)，抗GAPDH抗体购苏州瀛睿生物技术有限公司，维生素C(sigma，A4403，美国)、β-甘油磷酸钠(sigma，Sigma-50020，美国)、地塞米松(sigma，D4902，美国)。茜素红染液(索莱宝，G1452，中国)，PNPP(大连美伦，MB3188，中国)，H₂O₂(Sigma，323381)。

1.3.3  药材提取  左归丸药材均由黑龙江中药大学附属第一医院药剂科提供，熟地黄24 g、山药12 g、山萸肉12 g、枸杞子12 g、菟丝子12 g、川牛膝9 g、龟甲胶12 g、鹿角胶12 g。以上中药加入30倍量的水煎煮浓缩成含生药含量为5.88 g/mL。此药物浓度按照人日用临床剂量(每日1剂， 生药含量为105 g/剂)，经人-大鼠体表面积比值折算，浓缩8倍而成^[9]。

1.4  实验方法

1.4.1  左归丸含药血清制备  取SD大鼠20只随机分为空白组和左归丸组，左归丸组每天早晚2次灌胃给予左归丸  2 mL，空白组给予同体积的生理盐水，连续给药7 d，于末次给药后1 h，乙醚麻醉，无菌条件下，经腹主动脉采血, 4 ℃放置1 h后，3 000 r/min，离心8 min，分离血清，经 56 ℃水浴灭活308 min，用0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌后，-80 ℃冰箱保存备用。

1.4.2  乳鼠颅骨成骨细胞分离^[10]  在无菌条件下进行SD乳鼠颅骨成骨细胞分离操作。颅骨将结缔组织去除，PBS重复吹打清洗两三次，需要清洗至头骨呈现透明状，清洗完毕后将其剪成小组织块，随后将小组织块置于离心管(1.5 mL)中，同时向离心管中加入3倍体积1%的胰酶，将离心管置于恒温摇床(37 ℃)中进行15-20 min振荡消化，使离心管内的血清能终止消化，消化终止后将其静置于4 ℃环境下5 min，弃上清，同时向其中加入Collagenase I(0.2%)，加入相关试剂后，将离心管置于恒温摇床(37 ℃)中振荡消化60 min，在培养基消化终止后，对其进行反复吹打，同时过滤去除骨碎片，收集滤液，离心(1 000 r/min，10 min)，弃上清，置于培养箱中培养；在培养箱中培养2 d后需要更换箱内的培养液，随后每两三天更换1次，通过倒置显微镜对细胞生长情况以及细胞状态进行仔细观察。

1.4.3  成骨细胞氧化损伤模型的建立及分组  取对数生长期细胞，调整细胞浓度为1×10⁸ L^-1 ，接种于96孔培养板，于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养24 h后，加入含有300 μmol/L H₂O₂培养24 h，建立氧化损伤模型^[11]。设空白组(正常培养细胞)、模型组(300 μmol/L H₂O₂)、左归丸组(300 μmol/L H₂O₂+10%左归丸含药血清)。

1.4.4  测定成骨细胞中丙二醛、超氧化物歧化酶水平  取各实验组细胞裂解液，应用Direct Detect Spectrometer- Sample Measuring红外微定量分析仪直接检测蛋白浓度，按照试剂盒说明书要求处理样品，测定其活性及含量。

1.4.5  钙化结节染色(茜素红法)^[12]  首先在矿化诱导培养基培养下(100 nmol/L抗坏血酸，10 mmol/L β-甘油磷酸，7 mol/L地塞米松)对第3代细胞进行矿化诱导，各组分别加入相应试剂，设空白组(正常培养细胞)、模型组(300 μmol/L H₂O₂)、左归丸组(300 μmol/L H₂O₂+10%左归丸含药血清)，对细胞诱导处理21 d后丢弃培养液，使用PBS反复冲洗培养板，随后对培养板进行固定15 min (体积分数95%乙醇)，注意需要用双蒸水反复冲洗3次，用0.1%茜素红-Tris-HCl(pH 8.3)进行染色处理，在37 ℃环境下孵育1 h以上，双蒸水冲洗3次。采取PNPP法测定碱性磷酸酶活性，连续培养21 d后舍弃培养液，用PBS漂洗，同时对其进行3次以上的反复冻融(1% Triton X-100)，在磷酸盐底物中对细胞裂解物孵育30 min，之后加入NaOH(1 mol/L)药剂终止反应。

1.4.6  Western blot检测成骨细胞中HO-1和Nrf2蛋白表 达^[13]  选取处于对数期的成骨细胞作为实验材料，接种在6孔培养板上(2×10⁴个/孔，2 000 μL/孔)，细胞贴壁后舍弃上清液，根据分组情况进行药物干预处理。药物干预后，提取细胞总蛋白，定量蛋白含量，用SDS-PAGE(12.5%)进行电泳分离，分离后在二氟乙烯((PVDF)膜上将其转移，使用脱脂奶粉的Tris-HCl缓冲液(5%)在室温下孵育至少1 h，孵育后加入1∶100一抗工作液稀释，同时在4 ℃环境下过夜，使用TBS缓冲液冲洗3次以上，10 min/次，用1∶200的二抗工作液(加入生物素标记)孵育1 h以上，使用TBST缓冲液冲洗3次以上，10 min/次，采用ECL法显色处理。最后采取凝胶成像系统对相关组织进行摄片观察，观察的结果以目的条带与内参条带(GAPDH)吸光度的比值表示。

1.5  主要观察指标  ①细胞形态；②成骨细胞中丙二醛和超氧化物歧化酶水平变化；③成骨细胞茜素红染色结果；④成骨细胞HO-1和Nrf2蛋白的表达。

1.6  统计学分析  将相关数据记录于统计学软件SPSS 19.0中，其中科学处理后的结果采取x(_)±s表示，随后采取t 检验以及卡方检验，P < 0.05代表差异有显著性意义。

超氧化物歧化酶是生物体中最重要的酶之一，是机体内氧自由基的头号杀手，超氧化物歧化酶与疾病的发生发展都有着密切联系，具有抗炎、抗病毒及抗衰老等作用^[14-17]。丙二醛含量可反映脂质过氧化程度，间接反映细胞损伤^[18]。此次研究发现成骨细胞经H₂O₂干预后超氧化物歧化酶含量明显降低，丙二醛含量明显增加，给予左归丸后超氧化物歧化酶含量明显增加，丙二醛含量明显降低，表明左归丸能够改善氧化应激损伤。骨质疏松症病理条件下，氧化应激是骨吸收增加和低骨量相关的细胞损伤和死亡的一个主要原因。氧化应激能够影响细胞功能^[19]，可诱导成骨细胞凋亡，降低成骨细胞活性^[20]。茜素红染色和碱性磷酸酶活性检测结果显示成骨细胞经H₂O₂处理后成骨细胞矿化结节降低，碱性磷酸酶活性明显降低(P < 0.05)；给予左归丸成骨细胞矿化结节增加，碱性磷酸酶活性明显升高(P < 0.05)，表明左归丸能够改善氧化损伤造成的成骨细胞矿化结节能力和增加碱性磷酸酶活性。这与之前研究相似，左归丸能够改善骨密度，改善氧化应激损伤^[21-22]。

Keap1-Nrf2-ARE系统是氧化应激条件下机体细胞主要的防御机制，Nrf2是转录因子,调控抗氧化基因和细胞保护性解毒酶的表达，其活性被其抑制因子Keapl调控，Nrf2通路与自噬的相互作用关系也被大量实验研究证明^[23]。当机体受到氧化应激刺激时，发生构象变化的蛋白或者调节PKC、MAPK和PI3K信号通路能够激活Keap1-Nrf2/ARE 信号，激活下游靶蛋白表达^[24-27]。研究表明激活的核因子E2相关因子2能够促进超氧化物歧化酶的表达，从而可降低体内的氧化应激损伤，Nrf2与细胞的抗氧化应激反应密切相关，当细胞受到活性氧损害或其它化学物质浸染时，将激活一系列的细胞自我保护性基因的表达^[28]。研究发现，Nrf2通路的抗氧化作用同样存在于成骨及软骨细胞中，而Nrf2信号通路在骨发育代谢中也具有的重要作用。沉默Nrf2基因能显著促进破骨细胞的分化和骨吸收能力^[29]。HO-1是Ⅱ相解毒酶之一，对许多脏器的氧化损伤具有保护作用。HO-1能够通过胆绿素还原酶降解血红素并生成胆绿素，CO和Fe²⁺，构成内源性保护物质进而调节细胞氧化、凋亡等生物学功能^[30]。研究发现HO-1活化能够减轻细胞骨架肌动蛋白重构，减缓趋化因子CXCL1相关的多形核白细胞迁移，降低内皮细胞通透性，进而起到抗炎作用，同时对氧化损伤模型能够明显降低超氧化物歧化酶活性，增加抗氧化物质的表达^[31-32]。因此，在病理状态下Nrf2/HO-1信号通路抗氧化、抗炎、降低线粒体损伤、调节细胞生物学功能等发挥重要作用。Western blot研究结果显示与空白组比较，成骨细胞经过H₂O₂干预后HO-1和Nrf2的蛋白表达均显著升高(P < 0.05)；与模型组比较，左归丸组中HO-1和Nrf2的蛋白表达显著升高(P < 0.05)，表明左归丸能够增加成骨细胞氧化损伤过程中HO-1和Nrf2蛋白的表达。

综上所述，左归丸对成骨细胞损伤具有保护作用，其可能机制是降低氧化损伤程度，激活Nrf2/HO-1蛋白表达。

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文题释义：

血红素加氧酶1(HO-1)：是Ⅱ相解毒酶之一，对许多脏器的氧化损伤具有保护作用。HO-1能够通过胆绿素还原酶降解血红素并生成胆绿素、CO和Fe²⁺，构成内源性保护物质进而调节细胞氧化、凋亡等生物学功能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程#br#

氧化应激是绝经后妇女骨质疏松症的重要发病机制之一。妇女绝经后受衰老和雌激素水平下降等因素的共同影响，体内氧化应激水平增高，使骨内环境成骨细胞与破骨细胞失衡，导致骨质疏松发病。

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