复方中药圣愈汤治疗股骨头坏死机制的网络药理学分析

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.3138

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (17): 2687-2696.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.3138

• 组织构建相关数据分析 Date analysis of organization construction • 上一篇下一篇

复方中药圣愈汤治疗股骨头坏死机制的网络药理学分析

周毅，陈跃平，章晓云，赖渝，廖建钊，李时斌

广西中医药大学附属瑞康医院创伤骨科与手外科，广西壮族自治区南宁市 530011

收稿日期:2020-05-06 修回日期:2020-05-12 接受日期:2020-06-03 出版日期:2021-06-18 发布日期:2021-01-08
通讯作者: 陈跃平，博士，主任医师，广西中医药大学附属瑞康医院创伤骨科与手外科，广西壮族自治区南宁市 530011
作者简介:周毅，男，1995年生，江西省人，汉族，广西中医药大学在读硕士，主要从事骨与关节疾病及运动损伤研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81760796，81960803)，项目负责人：陈跃平；广西高校青年教师基础能力提升项目(2019KY0352)，项目负责人：章晓云；广西中医药大学2019年校级科研课题(2019QN027)，项目负责人：章晓云；广西自然科学基金课题(2015GXNSFAA139136)，项目负责人：陈跃平；广西中医药大学一流学科建设开放课题(2019XK029)，项目负责人：章晓云；广西卫生厅重点课题(S201419-05)，项目负责人：陈跃平；2016年全国名老中医黄有荣传承工作室建设项目，项目参与人：章晓云；广西中医药大学岐黄工程高层次人才团队培育项目-国医大师韦贵康学术思想传承与创新(2018004)，项目参与人：章晓云

An exploration on mechanism of Shengyu Decoction in treating osteonecrosis of the femoral head based on network pharmacology

Zhou Yi, Chen Yueping, Zhang Xiaoyun, Lai Yu, Liao Jianzhao, Li Shibin

Department of Traumatology and Hand Surgery, Ruikang Hospital Affiliated to Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530011, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Received:2020-05-06 Revised:2020-05-12 Accepted:2020-06-03 Online:2021-06-18 Published:2021-01-08
Contact: Chen Yueping, MD, Chief physician, Department of Traumatology and Hand Surgery, Ruikang Hospital Affiliated to Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530011, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Zhou Yi, Master candidate, Department of Traumatology and Hand Surgery, Ruikang Hospital Affiliated to Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530011, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81760796 and 81960803 (both to CYP); Young Teachers’ Basic Ability Improvement Project of Guangxi Colleges and Universities, No. 2019KY0352 (to ZXY); 2019 School-level Scientific Research Project of Guangxi University of Chinese Medicine, No. 2019QN027 (to ZXY); Guangxi Natural Science Foundation, No. 2015GXNSFAA139136 (to CYP); First-class Subject Construction Open Project of Guangxi University of Chinese Medicine, No. 2019XK029 (to ZXY); Key Project of Guangxi Health Department, No. S201419-05 (to CYP); 2016 National Distinguished Chinese Physician-Huang Yourong Inheritance Studio Construction Project (to ZXY [project participant]); Guangxi University of Chinese Medicine Qihuang Engineering High-level Talents Cultivation Project-Traditional Chinese Medicine Master Wei Guikang's Academic Thought Inheritance and Innovation, No. 2018004 (to ZXY [project participant])

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
差异基因：指一个基因在RNA水平处在不同环境压力、时间、空间等方面下，表达有显著性差异的基因。在不同因素下基因突变或者甲基化等结构发生改变导致差异的基因，与疾病表型密切相关。
圣愈汤：载于朱震亨《脉因证治•金疮》，由人参、黄芪、熟地、当归、白芍和川芎6味药组成，具有益气补血、活血化瘀的功效。

背景：圣愈汤可用于治疗股骨头坏死，但其机制不明。
目的：基于网络药理学和分子对接探讨圣愈汤治疗股骨头坏死的潜在分子机制研究。
方法：利用TCMSP数据库筛选圣愈汤的活性成分及对应靶点，整合GEO芯片数据库、Gene Cards、OMIM数据库的查询结果获取股骨头坏死相关靶点，然后利用Venny平台进行映射取交集得到圣愈汤治疗股骨头坏死的潜在作用靶点。利用Cytoscape软件构建圣愈汤治疗股骨头坏死的“单味药-活性成分-作用靶点”网络和PPI网络，并使用David数据库对圣愈汤治疗股骨头坏死的作用靶点进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。使用Autodock vina软件将关键有效成分和重要靶标进行分子对接，评估其结合活性。
结果与结论：①筛选出圣愈汤有效活性成分66个和靶点196个，股骨头坏死的相关靶点6 045个，取交集获得圣愈汤治疗股骨头坏死靶点73个；②“单味药-活性成分-作用靶点”网络提示主要活性成分有山柰酚、槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇和异鼠李素等；③蛋白互作分析提示主要核心靶点有炎性细胞因子白细胞介素6、血管内皮生长因子A和基质金属肽酶9等；④GO功能富集分析得到804个条目(P < 0.01)，主要涉及氧化应激反应、血管生成调节、细胞周期调控、免疫反应和炎症因子等方面；⑤KEGG通路富集分析获得120条通路，主要通路涉及缺氧诱导因子1α、白细胞介素17、肿瘤坏死因子、核转录因子κB和Toll样受体等与炎症反应、血管生成和免疫调节相关的通路；⑥分子对接表明5个核心靶标蛋白与5种主要活性成分结合能均远小于参考值，表明主要活性成分与核心靶点受体蛋白稳定结合；⑦结果证实，圣愈汤可能通过山柰酚、槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇和异鼠李素等活性成分，参与调节免疫炎症反应、骨代谢、调节血管生成和氧化应激等相关相关通路，从而起到治疗股骨头坏死的作用。
https://orcid.org/0000-0002-3440-1844 (周毅)；https://orcid.org/0000-0003-3860-1568(陈跃平)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 骨, 股骨头坏死, 中医药, 分子靶点, 炎症, 骨代谢, 氧化应激, 网络药理学

Abstract: BACKGROUND: Shengyu Decoction can be used to treat osteonecrosis of the femoral head (ONFH), but its mechanism is unknown.
OBJECTIVE: To explore the molecular mechanism of Shengyu Decoction in treating ONFH based on network pharmacology and molecular docking technology.
METHODS: The active components and corresponding targets of Shengyu Decoction was screened by TCMSP database. The related targets of ONFH were obtained by the query results of GEO chip, OMIM and Gene Cards databases. The potential targets of Shengyu Decoction in the treatment of ONFH were obtained by mapping intersection by Venny platform. The network of “single drug-active target-potential target” and protein-protein interaction network of Shengyu Decoction in the treatment of ONFH were constructed by Cytoscape software. The action targets of Shengyu Decoction were analyzed by David database through the gene ontology (GO) functional enrichment analysis and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway enrichment analysis. Autodock vina software was used to carry out molecular docking between key effective components and important targets, followed by the assessment of their binding activity.
RESULTS AND CONCLUSION: A total of 66 active ingredients and 196 targets of Shengyu Decoction and 6 045 related targets of ONFH were screened out, and 73 intersected targets of Shengyu Decoction in the treatment of ONFH were obtained. The “single drug-active ingredient-target” network indicated that the main active ingredients were kaempferol, quercetin, β-sitosterol, stigmasterol, isorhamnetin, etc. Protein-protein interaction analysis showed that the main core targets were interleukin-6, vascular endothelial growth factor A, matrix metalloproteinase-9, etc. The GO functional enrichment analysis yielded 804 entries (P < 0.01), mainly involving oxidative stress response, angiogenesis regulation, cell cycle regulation, immune response, inflammatory factors, etc. The KEGG pathway enrichment analysis obtained 120 pathways, mainly involving hypoxia-inducible factor-1α signaling pathway, interleukin-17 signaling pathway, tumor necrosis factor signaling pathway, nuclear factor-κB signaling pathway, Toll-like receptor signaling pathway and other pathways related to inflammatory response, angiogenesis and immune regulation. Molecular docking results showed that the binding energies of the five core target proteins and the five main active components were far less than the reference values, indicating that the main active components are stably bound to the core target receptor proteins. To conclude, Shengyu Decoction can participate in the regulation of immune-inflammatory responses, bone metabolism, angiogenesis, and oxidative stress through the active components such as kaempferol, quercetin, β-sitosterol, stigmasterol, and isorhamnetin, thereby playing a role in the treatment of ONFH.

Key words: bone, osteonecrosis of the femoral head, traditional Chinese medicine, molecular target, inflammation, bone metabolism, oxidative stress, network pharmacology

中图分类号:

周毅, 陈跃平, 章晓云, 赖渝, 廖建钊, 李时斌. 复方中药圣愈汤治疗股骨头坏死机制的网络药理学分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(17): 2687-2696.

Zhou Yi, Chen Yueping, Zhang Xiaoyun, Lai Yu, Liao Jianzhao, Li Shibin. An exploration on mechanism of Shengyu Decoction in treating osteonecrosis of the femoral head based on network pharmacology[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(17): 2687-2696.

图/表（结果） 11

2.1 活性化合物的筛选结果通过TCMSP数据库检索共收集得到圣愈汤的化学成分752个，其中黄芪87个，人参190个，白芍85个，熟地76个，当归125个，川芎189个，再以OB≥30%和DL≥0.18为活性成分筛选条件对752个成分进行筛选，得到复方中共66个活性化学成分，黄芪、人参、芍药、熟地、当归和川芎的活性成分分别为20，22，13，2，2和7个，其中白芍和黄芪有1个交集化合物，白芍、黄芪和人参有1个交集化合物，川芎和黄芪有1个交集化合物，当归、白芍和人参有1个交集化合物，熟地、当归和人参有1个交集化合物，主要活性成分的基本信息见表2。

2.2 股骨头坏死相关靶点筛选结果根据筛选条件，对GEO芯片数据库的基因芯片的二次分析获得5 443个差异表达基因，运用R语言软件绘制股骨头坏死相关芯片的差异表达基因的火山图和股骨头坏死相关芯片的差异表达基因的聚类图见图1。这些基因可能与股骨头坏死的发生发展密切相关；通过GeneCards和OMIM数据库收集对股骨头坏死有意义的靶点736个；删除重复项后纳入 6 045个候选基因。

2.3 圣愈汤治疗股骨头坏死潜在作用靶点预测结果在TCMSP数据库得到的圣愈汤中活性成分靶点196个；GEO差异分析、GeneCards和OMIM数据库中获得股骨头坏死的相关靶点6 045个，通过Venny平台取交集后显示，圣愈汤与股骨头坏死药物-疾病交集靶基因共73个，见图2。

2.4 构建“活性成分-靶点”和“疾病-药物-活性成分-靶点”网络运用Cytoscape软件构建“活性成分-靶点”网络，见图3，共包括100个节点(27个活性成分节点和73个靶点节点)和182条边。同时构建“疾病-药物-活性成分-靶点”，见图4。使用Network analyze功能对网络进行拓扑属性分析，其中度值是衡量1个节点在网络中关键性的重要参数。该网络中度值排名前5位的化合物分别是山柰酚 (kaempferol)、槲皮素(quercetin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、豆甾醇(Stigmasterol)和异鼠李素(isorhamnetin)、分别能与65，45，43，14，10个靶点连接，对治疗股骨头坏死具有重要的意义，其基本信息见表3。 2.4 构建“活性成分-靶点”和“疾病-药物-活性成分-靶点”网络运用Cytoscape软件构建“活性成分-靶点”网络，见图3，共包括100个节点(27个活性成分节点和73个靶点节点)和182条边。同时构建“疾病-药物-活性成分-靶点”，见图4。使用Network analyze功能对网络进行拓扑属性分析，其中度值是衡量1个节点在网络中关键性的重要参数。该网络中度值排名前5位的化合物分别是山柰酚 (kaempferol)、槲皮素(quercetin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、豆甾醇(Stigmasterol)和异鼠李素(isorhamnetin)、分别能与65，45，43，14，10个靶点连接，对治疗股骨头坏死具有重要的意义，其基本信息见表3。
2.5 PPI网络及网络拓扑分析结果通过STRING数据库以最低要求互动得分(minimum required interaction score)为0.7为筛选参数分析共得到233对蛋白互作关系，涉及73个蛋白靶点。采用Cytoscape软件构建蛋白互作网络，见图5。

文章通过Network Analyzer工具分析网络中节点的度值，将度值≥8(均值)的靶点由高到低排序，见图6。度值排名前5的蛋白基因是炎性细胞因子白细胞介素6(Interleukin-6，IL-6)、血管内皮生长因子A(Vascular endothelial growth factor A，VEGFA)、原癌基因蛋白(Proto-oncogene proteins，jun)、基质金属肽酶9(Matrix metalloproteinase-9，MMP9)及炎性细胞因子白细胞介素1β(Interleukin-1 beta，IL-1β)。这些蛋白在整个网络中起着关键的作用，蛋白所对应的靶点在圣愈汤治疗治疗股骨头坏死中具有重要作用，认为是圣愈汤治疗股骨头坏死的关键靶点。

2.6 GO富集分析结果 GO富集分析得到GO条目共804个(P < 0.01)，其中生物过程(BP)、细胞组成(CC)和分子功能(MF)条目分别为732，23，49个。
从生物过程的相关条目分析，圣愈汤治疗股骨头坏死的靶点主要参与对炎症反应(Inflammatory reaction)、氧化应激反应(response to oxidative stress)和血管生成调节(regulation of angiogenesis)等过程；从细胞组成的相关条目分析，治疗靶点主要包括转录因子复合体(transcription factor complex)、内质网腔(intrinsic component of postsynaptic)及核染色质(RNA polymerase II transcription factor)等区域；从分子功能的相关条目分子，治疗靶点主要与丝氨酸水解酶活性(serine hydrolase activity)、调节核受体活性(nuclear receptor activity)和蛋白酶结合(protease binding)等方面相关。根据P值排序，每个模块前20位的条目见图7。

2.7 KEGG富集分析结果 KEGG通路富集分析共得到120条通路，根据P值排序，列出前20位条目，见图8。主要涉及缺氧诱导因子1α信号通路、白细胞介素17信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、核因子B信号通路和Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)信号通路等，这些通路与炎症反应、骨代谢、血管生成和免疫调节密切相关。

2.8 分子对接验证将“2.4”项筛选出的关键化合物和“2.5”项的关键靶蛋白进行分子对接验证。分子对接结果显示圣愈汤关键活性化合物与靶蛋白的分子对接亲和力均远小于-5.0 kJ/mol，结果表明圣愈汤中关键化合物与关键靶蛋白有较好的结合活性，结果见表4。山奈酚为预测靶点最多的活性成分，白细胞介素6为PPI网络中degree值最大的靶点，以山奈酚和白细胞介素6蛋白结构对接模式为例，结果显示山柰酚能稳定地对接到白细胞介素6蛋白结构的活性口袋中，见图9；山奈酚与白细胞介素6蛋白结合关键疏水氨基酸残基是ASP-1042，ARG-01041，GLY-1097，GLN-1098，THR-1100，PHE-1046， MET-1085，VAL-1045和HIS-1096。

参考文献

[1] 赵德伟,胡永成.成人股骨头坏死诊疗标准专家共识(2012年版)[J].中华关节外科杂志(电子版),2012,6(3):479-484
[2] ZHAO DW, YU M, HU K, et al. Prevalence of nontraumatic osteonecrosis of the femoral head and its associated risk factors in the chinese population: results from a nationally representative survey. Chin Med J (Engl). 2015;128(21):2843-2850.
[3] 周明旺,陈彦同,李盛华,等.股骨头坏死保髋治疗[J].中国骨质疏松杂志,2019, 25(9):1351-1356.
[4] 陈卫衡,何伟,童培建,等.股骨头坏死中医辨证标准(2019年版)[J].中医正骨, 2019,31(6):1-2.
[5] 王晨,施杞.施杞辨治股骨头坏死经验撷菁[J].上海中医药杂志,2015,49(11):1-3.
[6] 刘粉叶,沙其朋,王娓娓.益气养血法对骨髓抑制小鼠骨髓造血的促增殖作用及机制[J].中华中医药学刊,2019,37(10): 2328-2331.
[7] HAI YX, YAN QZ, ZHEN ML, et al. ETCM: an encyclopaedia of traditional Chinese medicine. Nucleic Acids Res. 2019;47(D1): D976-D982.
[8] EDGAR R, DOMRACHEV M, LASH AE. Gene Expression Omnibus: NCBI gene expression and hybridization array data repository. Nucleic Acids Res. 2002;30(1):207-210.
[9] TROTT O, OLSON AJ. AutoDock Vina: improving the speed and accuracy of docking with a new scoring function, efficient optimization, and multithreading[J]. J Comput Chem. 2010;31(2):455-461.
[10] 徐森楠,庄莉,翟园园,等.基于网络药理学研究二至丸防治骨质疏松症的物质基础与作用机制[J].中国药学杂志,2018, 53(22):1913-1920.
[11] YU X, ZHANG D, CHEN X, et al. Effectiveness of various hip preservation treatments for non-traumatic osteonecrosis of the femoral head: a network meta-analysis of randomized controlled trials. J Orthop Sci. 2018;23(2):356-364.
[12] PISANI LP, ESTADELLA D, RIBEIRO DA. The role of toll like receptors (TLRs) in oral carcinogenesis. Anticancer Res. 2017; 37(10):5389-5394.
[13] GÜLER-YÜKSEL M, HOES JN, BULTINK IEM, et al. Glucocorticoids, Inflammation and Bone. Calcif Tissue Int. 2018;102(5): 592-606.
[14] JOHNSON RW, MCGREGOR NE, BRENNAN HJ, et al. Glycoprotein130 (Gp130)/interleukin-6 (IL-6) signalling in osteoclasts promotes bone formation in periosteal and trabecular bone. Bone. 2015;2015(81): 343-351.
[15] TANAKA Y, TAKEUCHI T, AMANO K, et al. Effect of interleukin-6 receptor inhibitor, tocilizumab, in preventing joint destruction in patients with rheumatoid arthritis showing inadequate response to TNF inhibitors. Modern Rheumatol. 2014;24(3): 399-404.
[16] LANGE J, SAPOZHNIKOVA A, LU C, et al. Action of IL-1beta during fracture healing. J Orthop Res. 2010;28(6):778-784.
[17] CZEKANSKA EM, RALPHS JR, ALINI M, et al. Enhancing inflammatory and chemotactic signals to regulate bone regeneration. Eur Cell Mater. 2014;28:320-334.
[18] VOSS JO, LOEBEL C, BARA JJ, et al. Effect of short-term stimulation with interleukin-1β and differentiation medium on human mesenchymal stromal cell paracrine activity in coculture with osteoblasts. BioMed Res Int. 2015;2015:714230.
[19] 郭成龙,魏玉娇,何玲,等.生骨再造丸对激素性股骨头坏死大鼠骨代谢及炎症细胞因子表达的影响[J].中药药理与临床,2019,35(4):170-174.
[20] 帅波,沈霖,杨艳萍,等.古方青娥丸加味干预早期非创伤性股骨头缺血性坏死骨转换标志物、血流变及炎症相关因子的变化[J].中国组织工程研究,2016, 20(46):6907-6914.
[21] SODHI CP, NEAL MD, SIGGERS R, et al. Intestinal epithelial Toll-like receptor 4 regulates goblet cell development and is required for necrotizing enterocolitis in mice. Gastroenterology. 2012;143(3): 708-718.
[22] YAMAGUCHI M, WEITZMANN MN. Quercetin,a potent suppressor of NF-κB and Smad activation in osteoblasts. Int J Mol Med. 2011;28(4):521-525.
[23] BELLEI B, PITISCI A, IZZO E, et al. Inhibition of melanogenesis by the pyridinyl imidazole class of compounds: possible involvement of the Wnt/β-catenin signaling pathway. PLoS One. 2012;7(3):e33021.
[24] MENG L, SUN JY. Progression of TLR4 signal pathway in osteoblast. Chinese J Osteop Bone Mineral Res. 2013;6(3):260-265.
[25] 李文锋,侯树勋,张伟佳,等.TNF-α-NF-κB对成骨细胞分化过程中BMP-2-Smad1信号通路的影响[J].中国骨质疏松杂志, 2011,17(1):1-4.
[26] 李知玻,李子锋,章莹,等. TNF-α对成骨细胞凋亡作用的探讨[J].中国骨质疏松杂志,2012,18(10):892-894.
[27] GLASS GE, CHAN JK, FREIDIN A, et al. TNF-alpha promotes fracture repair by augmenting the recruitment and differentiation of muscle-derived stromal cells. Proc Natl Acad Sci USA. 2011;108(4): 1585-1590.
[28] LI JK, CHENG L, ZHAO YP, et al. ADAMTS-7 exhibits elevated expression in cartilage of osteonecrosis of femoral head and has a positive correlation with TNF- α and NF- κB P65. Mediators Inflamm. 2015; 2015:196702.
[29] CHEN G, DENG C, LI YP. TGF-β and BMP signaling in osteoblast differentiation and bone formation. Int J Biol Sci. 2012;8(2): 272-288.
[30] ZHANG JR, PANG DD, TONG Q, et al. Different modulatory effects of IL-17, IL-22, and IL-23 on osteoblast differentiation. Mediators Inflamm. 2017;2017:5950395.
[31] HUANG H, KIM HJ, CHANG EJ, et al. IL-17 stimulates the proliferation and differentiation of human mesenchymal stem cells: implications for bone remodeling. Cell Death Differ. 2009;16(10):1332-1343.
[32] ZHAO L, LIU Z, YANG F, et al. Intrabody against prolyl hydroxylase 2 promotes angiogenesis by stabilizing hypoxia-inducible factor-1α. Sci Rep. 2019;9(1):11861.
[33] LI J, FAN L, YU Z, et al. The effect of deferoxamine on angiogenesis and bone repair in steroid-induced osteonecrosis of rabbit femoral heads. Exp Biol Med (Maywood). 2015;240(2):273-280.
[34] ZHANG W, YUAN Z, PEI X, et al. In vivo and in vitro characteristic of HIF-1α and relative genes in ischemic femoral head necrosis. Int J Clin Exp Pathol. 2015;8(6):7210-7216.
[35] MA W, XIN K, CHEN K, et al. Relationship of common variants in VEGFA gene with osteonecrosis of the femoral head: a Han Chinese population based association study. Sci Rep. 2018;8(1):16221.
[36] SONG J, JING Z, HU W, et al. α-linolenic acid inhibits receptor activator of NF-κB ligand induced (RANKL-Induced) osteoclastogenesis and prevents inflammatory bone loss via downregulation of nuclear factor-kappaB-inducible nitric oxide synthases (NF-κB-iNOS) signaling pathways. Med Sci Monit. 2017;23: 5056-5069.
[37] 徐涛涛,劳杨骏,廖菲,等.HIF-1α信号通路与激素性股骨头坏死相关性研究进展[J].世界中西医结合杂志,2015,10(5):730-733.
[38] WU J, YAO L, WANG B, et al. Tao-Hong-Si-Wu Decoction ameliorates steroid-induced avascular necrosis of the femoral head by regulating the HIF-1α pathway and cell apoptosis. Biosci Trends. 2016;10(5): 410-417.
[39] CASADO-DÍAZ A, ANTER J, DORADO G, et al. Effects of quercetin, a natural phenolic compound, in the differentiation of human mesenchymal stem cells (MSC) into adipocytes and osteoblasts. J Nutr Biochem. 2016;32:151-162.
[40] GE YW, FENG K, LIU XL, et al. Quercetin inhibits macrophage polarization through the p-38α/β signalling pathway and regulates OPG/RANKL balance in a mouse skull model. Cell Mol Med. 2020;24(5): 3203-3216.
[41] KIM IR, KIM SE, BAEK HS, et al. The role of kaempferol-induced autophagy on differentiation and mineralization of osteoblastic MC3T3-E1 cells. BMC Complement Altern Med. 2016;16(1):333.
[42] 刘威良,姬昱,黄艾祥.β-谷甾醇的研究及开发进展[J].农产品加工,2019, (1):77-79.
[43] DAS N, BHATTACHARYA A, KUMAR MANDAL S, et al. Ichnocarpus frutescens (L.) R. Br. root derived phyto-steroids defends inflammation and algesia by pulling down the pro-inflammatory and nociceptive pain mediators: an in-vitro and in-vivo appraisal. Steroids. 2018;139:18-27.
[44] CHAUHAN S, SHARMA A, UPADHYAY NK, et al. In-vitro osteoblast proliferation and in-vivo anti-osteoporotic activity of Bombax ceiba with quantification of Lupeol, gallic acid and β-sitosterol by HPTLC and HPLC. BMC Complement Altern Med. 2018;18(1): 233.
[45] GABAY O, SANCHEZ C, SALVAT C, et al. Stigmasterol: a phytosterol with potential anti-osteoarthritic properties. Osteoarthritis Cartilage. 2010;18(1):106-116.
[46] YANG L, CHEN Q, WANG F, et al. Antiosteoporotic compounds from seeds of Cuscuta chinensis. J Ethnopharmacol. 2011;135(2):553-560.
[47] 谢兴文,徐世红,李宁.中药单味或单体诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化研究概况[J].中国中医骨伤科杂志,2010, 18(10):65-67.
[48] COOK D, GENEVER P. Regulation of mesenchymal stem cell differentiation. Adv Exp Med Biol. 2013;(786):213-229.
[49] XU S, ZHANG L, JIN H, et al. Autologous stem cells combined core decompression for treatment of avascular necrosis of the femoral head: a systematic meta-analysis. Biomed Res Int. 2017;(2017):6136205.
[50] KANG JS, MOON KH, KIM BS, et al. Clinical results of auto-iliac cancellous bone grafts combined with implantation of autologous bone marrow cells for osteonecrosis of the femoral head:a minimum 5-year follow-up. Yonsei Med J. 2013;54(2):510-515.
[51] 徐凌霄,高俊,张前德.左归丸含药血清对大鼠骨髓间充质干细胞骨向分化中碱性磷酸酶含量的影响[J].中国实验方剂学杂志,2011,17(7):149-152.
[52] 廖清船,肖洲生,秦艳芳,等.植物雌激素金雀异黄酮通过p38MAPK通路促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化[J].中国药理学通报,2006,22(6):683-687.

引言

股骨头坏死是股骨头血供中断或受损，引起骨细胞、骨髓成分死亡及骨组织异常修复，继而导致股骨头结构改变，股骨头塌陷，引起患者关节疼痛，功能障碍的疾病，是骨科常见的难治性疾病[1]。据流行病学调查研究显示，中国目前约有800万例股骨头坏死患者，且每年有(10-20)万例的新发病例[2]。相当一部分股骨头坏死患者是年轻人(20-40岁)，这类患者髋关节置换后假体的使用寿命并不理想，面临多次翻修手术的风险；此外，部分老年患者因存在慢性基础性疾病，并不适合手术，保髋治疗是更好的选择。
近年来，经过大量临床观察及动物实验证实，中医药在治疗股骨头坏死方面具有显著疗效，不仅可以改善坏死状态，而且能修复坏死的骨组织[3]。中医治疗股骨头坏死的研究发现患者病机因多属血瘀痰阻、经络阻滞兼有肝肾亏虚、气血不足，与中华中医药学会发布《股骨头坏死中医辨证标准》相符[4]。圣愈汤载于朱震亨《脉因证治•金疮》，由人参、黄芪、熟地、当归、白芍和川芎6味药组成，具有益气补血、活血化瘀的功效。施杞教授创立“调和气血法”，总结出以圣愈汤为基础的治疗股骨头坏死方剂，将益气养血、行气活血贯穿于治疗股骨头坏死过程的始终[5]。刘粉叶等[6]发现圣愈汤能通过促进骨髓造血细胞增殖，其机制与促进造血生长因子的合成和分泌，与中医益气活血理论相符。由于圣愈汤所含化学成分较为复杂，其治疗股骨头坏死的机制尚不明确。
因此，文章旨在通过网络药理学方法，挖掘圣愈汤入血活性成分、作用靶点与股骨头坏死作用靶点关系网络，分析其潜在作用机制。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 软件与数据库
1.1.1 检索人第一作者进行检索，通讯作者核对。
1.1.2 检索时间及地点于2020年4月至5月在广西中医药大学附属瑞康医院完成。
1.1.3 检索数据库见表1。

1.2 圣愈汤活性成分筛选和靶点预测运用TCMSP中检索圣愈汤的6味中药为人参(脾经、肺经、心经、肾经)、黄芪(归肺经、脾经)、熟地(肺经、肾经)、当归(心经、肝经、脾经)、白芍(胃经、肾经)和川芎(肝经、胆经)。以上中药归经信息均参考自中医药百科全书(Encyclopaedia of Traditional Chinese Medicin，ETCM)[7]。
根据数据库建议参考标准：生物口服利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和类药性(drug likeness，DL)≥0.18作为筛选标准，确定圣愈汤中所含中药活性成分的集合。基于TCMSP数据库查询每个活性成分对应的靶蛋白，基于TCMSP数据库，将获得的活性成分逐一配对潜在作用靶点，再通过Uniprot数据库进行靶点蛋白和基因信息校正，筛选出圣愈汤主要活性成分的作用靶点。
1.3 股骨头坏死靶点预测以 “Osteonecrosis of the femoral head”为关键词在GeneCards、以及OMIM数据库中查找与股骨头坏死相关靶点。再从Gene Expression Omnibus数据库下载编号为：GSE74089的芯片数据原始文件[8]，此芯片收集4例股骨头坏死患者和4名健康对照者髋关节软骨标本的基因测序信息，利用R语言软件中的limma包分析芯片数据的差异基因，设置差异倍数(Fold change，FC) > 0.5，显著差异基因的筛选条件为P < 0.05；最后运用pheatmap包对差异基因绘制差异基因热图和火山图，同时保存股骨头坏死患者和健康对照之间的差异基因。采用两独立样本t检验检测组间数据差异，用FDR错误控制法对P值作多重假设检验校正。将差异分析得到的基因与GeneCards和OMIM数据库的查找结果合并，删除重复靶点保留惟一项，所得靶点即为股骨头坏死的相关靶点。
1.4 圣愈汤治疗股骨头坏死共同靶点筛选将圣愈汤活性成分靶点和股骨头坏死相关靶点经Venny 2.1.0软件取交集，获得圣愈汤治疗股骨头坏死的共同靶点。
1.5 构建“活性成分-靶点”和“疾病-药物-活性成分-靶点”网络及分析使用可视化网络构建与分析软件Cytoscape 3.7.2，根据得到的圣愈汤治疗股骨头坏死的共同靶点，整合对应有效成分导入，建立“活性成分-靶点”网络，同时构建“疾病-药物-活性成分-靶点”网络。同时利用插件CytoNCA计算网络节点的自由度(Degree)，Degree大小与相关节点数量呈正比，据此筛选出靶点数目较多的活性成分。
1.6 构建共同靶点的蛋白互作网络将上述共同靶点导入STRING数据库，选择物种为人，以最低要求互动得分(minimum required interaction score)0.7为筛选参数，得到圣愈汤治疗股骨头坏死的PPI网络，在构建的PPI网络中，节点的大小和颜色深浅反映自由度(Degree)值大小，边粗细反映组合分数(combine score)大小。导出“TSV”文件并运用Cytoscape 3.7.2软件中 Network Analyzer工具分析网络中节点的度值，根据度值的排序确定核心靶点。
1.7 GO富集分析与KEGG富集分析利用DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov，Version 6.8)对潜在靶点进行GO功能富集分析，研究圣愈汤治疗股骨头坏死生物功能；KEGG富集分析潜在靶点的相关通路，研究圣愈汤治疗股骨头坏死的主要信号通路，P < 0.01代表富集结果显著。最后利用R语言绘制GO富集分析图及KEGG富集分析气泡图。
1.8 分子对接验证采用Autodock vina分子对接软件来验证网络药理学筛选结果。在上述步骤结果基础上，选择靶点数目较多的活性成分作为配体和PPI网络关系图中度值排名前5的靶蛋白作为受体进行分子对接。从PDB数据库中查询以上靶蛋白的3D结构。用PyMOL 1.7.2.1软件进行预处理，移除靶蛋白中的配体和非蛋白分子(如水分子)。从PubChem数据库下载筛选出关键化合物结构，并基于MMFF94力场对化合物的结构进行优化。使用AutodockTools软件对化合物进行可旋转键的搜寻与定义[9]；对DPE蛋白结构通过多肽链缺失残基和末端残基修补、除去水分子、添加氢原子、添加电荷，并保存为PDBQT格式。以原配体所在位点为靶蛋白的活性口袋，分别进行靶蛋白与活性化合物的分子对接。如蛋白没有原配体，则以蛋白和dna相互作用的残基构建活性口袋进行对接。得出结合自由能(ΔGbind，kJ/mol)，根据文献报道[10]，这里选取结合能≤-5.0 k J/mol的活性成分作为验证“成分-靶点”的筛选依据。选取“1.5”项中度值最高化合物和“1.6”项度值最高靶点对接结合构象用于对接结合模式分析，并使用Pymol进行作图。
1.9 主要观察指标主要观察关键基因在KEGG和GO富集结果，关键基因与关键化合物分子对接结果。

讨论

3.1 中医治疗股骨头坏死中医学将股骨头坏死归于“骨痹”“骨痿”和“骨蚀”等范畴，如《灵枢刺节骨烛真邪篇》中提到“虚邪之入身也深，寒与热相传，久留而内著，内伤骨为骨蚀”。在股骨头坏死早期，患者多属气滞血瘀兼气血两虚证候，运用调和气血法治疗股骨头坏死尤为关键。股骨头坏死是一个病理演变过程，主要表现在股骨头软骨下骨的血管新生能力变差、骨形成相关细胞凋亡增加、成骨分化能力减弱、破骨细胞增殖异常及炎症细胞浸润等[11]。因此，寻找调节股骨头坏死病理生理机制的药物及其分子作用机制的研究具有重要意义。
3.2 圣愈汤能通过调节抗氧化、炎症反应、免疫调节和骨代谢等方面治疗股骨头坏死文章发现山柰酚、槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇和异鼠李素能匹配到较多疾病靶点，但作者查找以上化合物与股骨头坏死相关文献发现目前尚未有异鼠李素与股骨头坏死相关研究，值得今后进一步研究。核心靶点包括白细胞介素6，血管内皮生长因子A、JUN、MMP9和白细胞介素1β等，靶点间作用关系复杂多样。并富集到多条通路，包括和白细胞介素17、Toll样受体、核转录因子κB、肿瘤坏死因子和缺氧诱导因子1α信号通路等，预测了圣愈汤可能通过调节炎症反应、骨代谢和血管生成等方面治疗股骨头坏死。因此可以认为圣愈汤有效成分间存在关联协同作用，其药效靶点对治疗股骨头坏死起重要作用。股骨头坏死发生机制可能与炎症反应、骨代谢异常和血管生成密切相关。Toll样受体是参与非特异性免疫的一类重要蛋白质分子，该受体参与的信号通路与免疫性疾病或炎性疾病联系紧密[12]。核转录因子kB信号通路是位于Toll样受体下游的信号通路，在TLR4/核转录因子kB信号通路中，TLR4被激活后释放大量炎症因子如肿瘤坏死因子α、白细胞介素6，1β等[13]。白细胞介素6即炎性细胞因子白细胞介素6，其受体在破骨细胞中表达[14]。肿瘤坏死因子α是肿瘤坏死因子家族成员，能促进破骨细胞的增殖，亦能介导核转录因子kB信号通路，活化核转录因子κB以激活破骨细胞核心因子NFATc1，并增加OSCAR的表达以促进破骨细胞分化[15]。白细胞介素1β即炎性细胞因子白细胞介素1β，同样是促炎细胞因子，在损伤和病理早期表达上调，促进炎症因子释放[16]。白细胞介素1β能刺激骨髓间充质干细胞分化，影响与炎症、血管生成和骨形成相关的蛋白质的分泌[17-18]。研究表明，白细胞介素6，4和肿瘤坏死因子α等炎性因子可能是导致股骨头坏死出现疼痛症状的主要发病机制之一，炎性因子大量释放，导致免疫细胞致大血管区域浸润，诱发血管区域免疫炎性反应，持续损伤血管，最终导致股骨头坏死[19-20]。此外，Toll样受体4还与影响成骨细胞的信号通路密切相关[21，23]。Toll样受体4信号通路被激活，成骨细胞标志物的表达被抑制，导致成骨细胞的分化、增殖和矿化受到抑制[24]。肿瘤坏死因子α通过激活骨形态发生蛋白2信号通路中核转录因子kB因子，减少磷酸化的Smad1，抑制成骨细胞分化，并通过抑制成骨细胞中的碱性磷酸酶来抑制骨形成和矿化[25-26]。另有研究表明，肿瘤坏死因子α也可能诱导成骨分化[27]。股骨头坏死中表达显著升高[28]。可以认为肿瘤坏死因子α在调节骨稳态中发挥关键作用，对股骨头坏死的修复有重要意义。白细胞介素17是已知30余种白细胞介素之一，由CD4+ T细胞分泌，能够诱导上皮细胞、内皮细胞和成纤维细胞合成分泌白细胞介素6、白细胞介素8、G-CSF和前列腺素2等因子。相关研究提示白细胞介素17可能参与骨重建的调控。例如，白细胞介素17能抑制骨形态阿生蛋白2诱导的成骨细胞分化[29-30]。另外，HUANG等[31]发现白细胞介素17刺激间充质干细胞增殖，诱导间充质干细胞向成骨细胞分化。这种对骨稳态的矛盾效应表明白细胞介素17对成骨细胞分化可能存在双向调节作用。缺氧诱导因子1α信号通路是最具特征性的低氧反应通路，缺氧诱导因子1α可调节与血管生成相关靶基因的表达[32]。研究发现，股骨头坏死区缺氧诱导因子1α和血管内皮生长因子的表达明显低于修复区[33]。缺氧诱导因子1α的靶基因血管内皮生长因子在促进血管生成-成骨偶联过程中发挥重要作用[34]。血管内皮生长因子A作为血管内皮生长因子家族成员，促进血管内皮细胞的增殖和迁移，促进软骨内骨的形成，与股骨头坏死发病密切相关[35-36]。亦有研究表明缺氧诱导因子1α可以抑制骨细胞凋亡，对激素性股骨头坏死起到防治作用[37-38]
槲皮素是黄酮类化合物，具有抗氧化、抗炎及免疫调节等作用，可促进成骨细胞增殖起到骨保护作用[39]。槲皮素通过p38信号通路抑制巨噬细胞释放促炎因子，并介导核转录因子kB信号通路抑制破骨细胞分化[40]。山柰酚具有防癌、抗癌、抗炎、抗氧化、抗菌和抗病毒等功效。研究表明山萘酚能增加成骨细胞活化因子RUNX-2，Osterix，骨形态发生蛋白2和RHCgⅠ的表达，能使自噬相关因子表达增加，促进成骨细胞增殖[41]。β-谷甾醇有抗氧化、降低胆固醇、抗炎、免疫调节和抗肿瘤等作用[42]。研究表明β-谷甾醇能通过调节与肿瘤坏死因子α、环氧化酶2、白细胞介素6和MMP-13相关信号通路来减轻炎症、疼痛和慢性关节炎综合征，还能通过调节Wnt/β-catenin信号通路促进成骨细胞增殖，延缓骨吸收[43-44]。豆甾醇具有抗炎、抗氧化、抗癌和降胆固醇等作用，还能减轻骨关节炎症，抑制部分通过核转录因子kB途径导致的软骨退化[45]。异鼠李素可促进AP-1蛋白表达，进而激活细胞生长、分化和发育的相关基因；AP-1蛋白在骨形成和骨吸收过程发挥重要作用[46]。文章通过对关键化合物分析，可以认为圣愈汤各有效成分之间存在紧密的协同作用，文章通过调节炎症反应、血管生成和骨代谢等生物学过程达到治疗股骨头坏死的效果。分子对接结果显示，核心靶蛋白分别与关键有效成分对接后获得的结合能均远小于参考值-5.0 k J/mol，表明圣愈汤能与股骨头坏死核心靶点受体蛋白稳定结合并发挥显著作用，基于此得到的网络分析结果可信度较高，参考价值较大。
3.3 中药与组织工程研究骨髓间充质干细胞不但能自我更新、多向分化，还兼具低免疫原性及归巢能力，是骨及软骨组织工程中理想的种子细胞[47]。一定条件下骨髓间充质干细胞能向如成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞和血管内皮细胞转化[48]。针对股骨头坏死治疗，骨髓间充质干细胞联合传统保髋治疗取得了不错的疗效。XU等[49]运用Meta分析发现自体骨髓间充质干细胞移植联合髓芯减压术可明显减缓疾病进展阶段的股骨头塌陷，缓解疼痛，并延缓全髋关节置换。KANG等[50]发现接受自体骨移植联合骨髓间充质干细胞治疗取得了较为满意的临床效果。相较于价格昂贵传统细胞因子和化学物质，中药复方、中药及中药单体用于诱导骨髓间充质干细胞分化方面有其独特优势。徐凌霄等[51]研究发现左归丸含药血清可促进大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化。有研究发现黄酮类化合物金雀异黄酮促进小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的机制可能与激活p38/MAPK信号通路相关[52]。有研究发现髓芯减压、自体干细胞移植联合中药治疗早中期股骨头缺血性坏死具有明显疗效[52]。中药对干细胞的研究仍需要深入，中药在干细胞领域具有重大潜力。基于此运用网络药理学寻找合适的中药复方、中药及其活性成分具有先导性的理论指导意义。
3.4 结论与展望文章应用网络药理学和分子对接技术对圣愈汤治疗股骨头坏死的机制进行了探究，发现圣愈汤可能通过多种信号通路调控血管内皮细胞、成骨细胞、破骨细胞的增殖及凋亡，从而调控血管生成、骨吸收和骨形成的关系，同时抑制炎症反应，缓解股骨头坏死早期的临床症状，这为圣愈汤治疗股骨头坏死的相关机制研究提供了思路和方法，也为后续的临床及实验研究提供一定的理论指导。但由于条件限制，文章未能将中医方剂学“君臣佐使”配伍理念和疾病证候学加以运用，仅仅基于有效组分构建复方治疗疾病的研究。相信随着网络药理学、分子生物学的深入与完善，能将中药复方、中药及中药单体联合组织工程材料应用于骨组织工程研究。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

复方中药圣愈汤治疗股骨头坏死机制的网络药理学分析

An exploration on mechanism of Shengyu Decoction in treating osteonecrosis of the femoral head based on network pharmacology

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 11

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	胡凯, 乔晓红, 张永红, 王栋, 秦泗河. 空心螺钉和钢板内固定修复移位型跟骨关节内骨折：基于15篇随机对照试验的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1465-1470.
[2]	黄登承, 王志科, 曹学伟. 体外冲击波疗法治疗中老年膝骨关节炎短期疗效对比的荟萃分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1471-1476.
[3]	徐峰, 康辉, 魏坦军, 席金涛. 椎弓根螺钉不同固定方法治疗胸腰椎骨折的生物力学分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1313-1317.
[4]	姜勇, 罗翼, 丁永利, 周勇, 闵理, 唐凡, 张闻力, 段宏, 屠重棋. 骶骨精准切除影响骨盆稳定性的冯米斯应力特征及临床验证[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1318-1323.
[5]	张同同, 王中华, 文杰, 宋玉鑫, 刘林. 3D打印模型在颈椎肿瘤手术切除与重建中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1335-1339.
[6]	张宇, 田少奇, 曾国波, 胡川. 初次下肢全关节置换后发生心肌梗死的危险因素[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1340-1345.
[7]	韦玮, 李剑, 黄林海, 兰敏东, 卢显威, 黄绍东. 全膝或全髋关节置换后老年人首次活动时跌倒恐惧的影响因素[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1351-1355.
[8]	王金军, 邓增发, 刘康, 何智勇, 余新平, 梁建基, 李晨, 郭洲洋. 全膝关节置换静脉滴注氨甲环酸联合含氨甲环酸鸡尾酒局部应用的止血效果及安全性[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1356-1361.
[9]	肖国庆, 刘选泽, 严钰皓, 钟喜红. 后交叉韧带替代型假体全膝关节置换术后屈曲受限的影响因素[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1362-1367.
[10]	彭智浩, 冯宗权, 邹勇根, 牛国庆, 吴峰. 活动平台单髁置换后下肢力线与外侧间室骨关节炎进展的关系[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1368-1374.
[11]	黄泽晓, 杨妹, 林诗炜, 何和与. 血清n-3多不饱和脂肪酸水平与全膝关节置换早期股四头肌肌力变化的相关性[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1375-1380.
[12]	张冲, 刘志昂, 姚帅辉, 高军胜, 姜岩, 张陆. 局部应用氨甲环酸减少老年股骨颈骨折全髋关节置换后引流的安全和有效性[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1381-1386.
[13]	姚汝斌, 王仕永, 杨开舜. 微创经椎间孔椎间融合治疗单节段腰椎管狭窄症对腰椎-骨盆平衡的改善作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1387-1392.
[14]	王海莹, 吕冰, 李辉, 王顺义. 减压植骨融合内固定治疗退变性腰椎滑脱：基于脊柱骨盆参数预测患者的功能预后[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1393-1397.
[15]	吕振, 白金柱. 基于McKenzie技术的腰椎运动链训练应用于腰椎间孔镜术后分期康复的前瞻性研究[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1398-1403.