Elabela促进脐带华通胶间充质干细胞向心肌样细胞分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2030

中国组织工程研究 ›› 2020, Vol. 24 ›› Issue (7): 1046-1051.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2030

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Elabela促进脐带华通胶间充质干细胞向心肌样细胞分化

秦欣宇^1，2，张燕²，张宁坤²，高连如²，程涛¹，王泽¹，童珊珊¹，陈宇^1，2

¹安徽医科大学海军临床学院，北京市 100048；²解放军总医院第六医学中心心血管内科，北京市 100048

收稿日期:2019-08-13 修回日期:2019-08-15 接受日期:2019-09-19 出版日期:2020-03-08 发布日期:2020-01-19
通讯作者: 陈宇，博士，博士后，副主任医师，副教授，硕士生导师，安徽医科大学海军临床学院，北京市 100048；解放军总医院第六医学中心心血管内科，北京市 100048
作者简介:秦欣宇，女，1993年生，安徽省合肥市人，汉族，安徽医科大学海军临床学院在读硕士，主要从事干细胞治疗缺血性疾病研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81370238)；北京市自然科学基金(7142156)

Elabela promotes differentiation of Wharton’s jelly-derived mesenchymal stem cells into cardiomyocyte-like cells

Qin Xinyu^{1, 2}, Zhang Yan², Zhang Ningkun², Gao Lianru², Cheng Tao¹, Wang Ze¹, Tong Shanshan¹, Chen Yu^{1, 2}

¹Naval Clinical College of Anhui Medical University, Beijing 100048, China; ²Department of Cardiovascular Medicine, The Sixth Medical Center of PLA General Hospital, Beijing 100048, China

Received:2019-08-13 Revised:2019-08-15 Accepted:2019-09-19 Online:2020-03-08 Published:2020-01-19
Contact: Chen Yu, MD, Associate chief physician, Associate professor, Master’s supervisor, Naval Clinical College of Anhui Medical University, Beijing 100048, China; Department of Cardiovascular Medicine, The Sixth Medical Center of PLA General Hospital, Beijing 100048, China
About author:Qin Xinyu, Master candidate, Naval Clinical College of Anhui Medical University, Beijing 100048, China; Department of Cardiovascular Medicine, The Sixth Medical Center of PLA General Hospital, Beijing 100048, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81370238; the Natural Science Foundation of Beijing, No. 7142156

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
Elabela：人类Elabela由第4染色体上的3个外显子组成，产生1个转录本，被称为非编码RNA。CHNG等发现该基因含有1个保守的开放阅读框架，可表达由54个氨基酸组成的保守的脊椎动物蛋白(Aa)，由分泌信号组成。人类成熟Elabela序列为Gln-Arg-Pro-Val-Asn-Leu-Thr-Met-Arg-Arg-Lys-Leu-Arg-Lys-His-Asn- Cys-Leu-Gln-Arg-Arg-Cys-Met-Pro-Leu-His-Ser-Arg-Val-Pro-Pro-Pro。
脐带华通胶间充质干细胞：脐带表面有羊膜覆盖呈灰白色，内有1条脐静脉、2条脐动脉，脐血管周围为含水量丰富来自胚外中胚层的胶样组织，称为华通胶。采集合适健康的脐带，分离出华通胶并剪碎，利用0.125%胰酶消化组织块，然后进行体外扩增和培养，最后冻存于液氮罐中以供复苏使用。

背景：Elabela是近几年发现的新型APJ内源性受体，在成人心血管系统中广泛分布，对心血管疾病也有一定的影响，但是Elabela在干细胞向心肌样细胞诱导分化过程中的作用以及分化过程中对APJ表达量的影响尚未发现相关研究。

目的：探讨Elabela对脐带华通胶间充质干细胞向心肌样细胞诱导分化的影响。

方法：复苏冻存的脐带华通胶间充质干细胞，当细胞汇合度达到80%-90%时，使用5-氮胞苷使其向心肌样细胞分化，24 h后实验组更换为含Elabela、体积分数为10%胎牛血清的低糖DMEM培养基，对照组更换为含体积分数为10%胎牛血清的低糖DMEM培养基。诱导第7，14，21，28天，观察细胞形态变化，同时收集各组细胞的总RNA和总蛋白，采用实时荧光定量PCR和Western blot技术检测心肌特异性标记物Nkx2.5、cTnT、Connexin 43 mRNA及蛋白表达；采用实时荧光定量PCR和流式细胞技术检测诱导后的心肌样细胞中APJ的表达。

结果与结论：①在诱导分化各阶段，实验组心肌特异性标记物Nkx2.5、cTnT、Connexin43 mRNA和蛋白表达量均高于对照组，APJ表达量也高于对照组；②结果表明，Elabela在脐带华通胶间充质干细胞向心肌样细胞分化过程中起一定的促进作用；Elabela作为APJ的另一个激动剂在诱导分化过程中可促进APJ的表达。

ORCID: 0000-0003-0495-5165(秦欣宇)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: Elabela, Apelin13, 脐带华通胶, 间充质干细胞, 5-氮胞苷, APJ, 细胞分化, 心肌样细胞

Abstract:

BACKGROUND: Elabela is a new type of endogenous receptor of APJ discovered in recent years. It is widely distributed in the adult cardiovascular system and has a certain influence on cardiovascular diseases. However, the effect of Elabela on the differentiation of stem cells into cardiomyocytes and the expression of APJ in cardiomyocyte differentiation has not been studied yet.

OBJECTIVE: To investigate the effect of Elabela on the differentiation of Wharton’s jelly-derived mesenchymal stem cells into cardiomyocytes.

METHODS: The frozen mesenchymal stem cells were resuscitated. 5-Azacytidine was used to induce Wharton’s jelly-derived mesenchymal stem cells to differentiate into cardiomyocytes when the cell confluence reached 80%-90%. After 24 hours, the medium was replaced by low-glucose medium containing Elabela and 10% fetal bovine serum in the experimental group, and by low-glucose medium containing 10% fetal bovine serum in the control group. At 7, 14, 21, and 28 days after induction, cell morphology was observed. The total RNA and total protein of each group were collected. The myocardial specific markers Nkx2.5, cTnT and Connexin 43 mRNA and protein expression levels were detected by real-time fluorescent quantitative PCR and western blot assay. The expression of APJ in the induced cardiomyocytes was detected by real-time fluorescent quantitative PCR and flow cytometry.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) The expression levels of myocardial specific markers Nkx2.5, cTnT and Connexin 43 mRNA and protein were higher in the experimental group than in the control group in all stages of differentiation, and the expression of APJ was also higher in the experimental group than in the control group. (2) In summary, Elabela plays a certain promoting role in the differentiation of Wharton’s jelly-derived mesenchymal stem cells into oriented cardiomyocytes. Elabela, as another agonist of APJ, can promote the expression of APJ during the induced cell differentiation.

Key words: Elabela, apelin-13, Wharton’s Jelly, mesenchymal stem cells, 5-azacytidine, induction, cell differentiation, cardiomyocyte-like cells

中图分类号:

秦欣宇, 张燕, 张宁坤, 高连如, 程涛, 王泽, 童珊珊, 陈宇. Elabela促进脐带华通胶间充质干细胞向心肌样细胞分化[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(7): 1046-1051.

Qin Xinyu, Zhang Yan, Zhang Ningkun, Gao Lianru, Cheng Tao, Wang Ze, Tong Shanshan, Chen Yu. Elabela promotes differentiation of Wharton’s jelly-derived mesenchymal stem cells into cardiomyocyte-like cells [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2020, 24(7): 1046-1051.

图/表（结果） 6

2.1 脐带华通胶间充质干细胞定向心肌样细胞诱导分化脐带华通胶间充质干细胞接种于6孔板后开始贴壁，培养至第2天用倒置显微镜观察可见细胞贴壁生长，成纤维细胞样，有伪足伸出且有一定折光性，见图1；第3天可见孔板中细胞融合至90%以上，进行5-氮胞苷诱导后加入含相应激动剂的培养基，分别于7，14，21，28 d观察可见诱导分化后的细胞类似心肌细胞，具有肌管样结构，见图2。与对照组比较，实验组细胞增殖速度快，生长密度大，细胞数量多。

2.2 诱导分化不同时间节点心肌特异性标志物mRNA表达见图3。实验组和对照组的心肌特异性标记物Connexin43、cTnT和Nkx2.5 mRNA表达量较未分化的细胞都有不同程度的升高，且实验组在第21天达到最高值。在心肌分化过程中，两组的心肌特异性标记物Connexin43、cTnT、Nkx2.5 mRNA随着诱导时间延长表达量增高，可说明脐带华通胶间充质干细胞能够诱导分化为心肌样细胞。同时，实验组Nkx2.5、cTnT mRNA表达均高于对照组，前2周Nkx2.5、cTnT、Connexin43表达量变化不是很明显，在第21，28天出现比较明显的升高，与对照组相比，在第21天时Nkx2.5和cTnT分别提高了224%和124%，在第28天时Nkx2.5和cTnT分别提高了250%和113%(P < 0.05)，说明Elabela可促进脐带华通胶间充质干细胞向心肌样细胞诱导分化，对Connexin43表达量影响不显著。

2.3 诱导分化不同时间节点心肌特异性标志蛋白表达见图4。未分化的脐带华通胶间充质干细胞不表达Connexin43，少量表达cTnT和Nkx2.5。脐带华通胶间充质干细胞在向心肌样细胞诱导分化过程中，Nkx2.5、Connexin43和cTnT在第14天表达量达到最高，在第21天之后都出现不同程度的下降。第14，21，28天时，实验组心肌特异性标记蛋白Connexin43、cTnT以及Nkx2.5表达量高于对照组(P < 0.05)，说明Elabela在第14天之前能够促进脐带华通胶间充质干细胞向心肌样细胞诱导分化，21 d之后可能因为细胞出现凋亡的情况，导致表达量也出现相应的下降。

2.4 诱导分化各阶段目的基因APJ mRNA表达以及流式细胞术检测目的基因APJ表达通过RT-qPCR检测分化各时间节点目的基因APJ mRNA表达，从第14天开始，实验组的APJ表达量一直高于对照组，且在第14天达到最高值，之后出现些许的降低，但仍高于对照组，见图5。该结果表明，Elabela在诱导脐带华通胶间充质干细胞向心肌样细胞分化过程中促进APJ的表达，是APJ的激动剂。

通过流式细胞仪检测实验组和对照组诱导分化第28天的APJ表达，与未分化组比较，对照组APJ表达量约33.03%，加入Elabela的实验组APJ表达明显增高，为61.65%，实验组较对照组表达量提高约186.7%。该结果也可说明Elabela可促进APJ的表达，见图6。

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引言

2010年，国内首次报告有关Apelin-APJ系统通路在体内外均存在于间充质干细胞诱导的心脏细胞中，且Apelin可治疗损伤的心肌细胞^[1]。Apelin13是G蛋白偶联受体(APJ)的激动剂。临床发现在使用骨髓单个核细胞移植治疗心血管疾病后，Apelin13增加可改善患者严重心力衰竭^[2]。体外研究证实了Apelin13可增强5-氮胞苷对脐带华通胶间充质干细胞向心肌样细胞分化的效率^[3]，Apelin13可提高胚胎干细胞定向心肌样细胞分化效率^[4]。

Elabela是近几年发现的G蛋白偶联受体的另一个内源性激动剂，该受体激动剂在成人心血管系统中广泛表达，定位于血管内皮和血浆，是一种重要的心脏发育肽，在心脏方面发挥着重要作用。Elabela是一种内源性生长因子，通过PI3K/AKT途径维持人胚胎干细胞的自我更新。除此之外，Elabela另一个主要存在的部位是肾脏和前列腺组织，对肾脏有一定的保护作用^[5-6]。近几年有研究发现，Elabela与Apelin受体的功能性经信号转导后通过类似的方式发挥着生理性作用^[7]。还有研究发现加入Elabela后导致APJ过表达的HEK293T细胞中APJ/Apelin受体内化，与抑制cAMP产生ERK1/2磷酸化和弱细胞内钙动员有关^[8]。Elabela敲除的怀孕小鼠可表现出类似先兆子痫的症状，包括蛋白尿和血压升高^[9]。Elabela和Apelin13同为G蛋白偶联受体的激动剂，在心脏方面发挥着重要作用，该研究探索Elabela在脐带华通胶间充质干细胞向心肌样细胞分化中的作用，以期望在干细胞向心肌样细胞诱导过程中有新的发现，从而优化诱导分化方案。

材料方法

1.1 设计分组细胞对照实验。

1.2 时间及地点实验于2018年10月至2019年5月在解放军总医院第六医学中心心内科实验室完成。

1.3 材料 Elabela多肽由吉尔生化(上海)公司合成。胎牛血清、低糖DMEM培养基、0.25%胰酶(美国Hyclone公司)；5-氮胞苷(美国Sigma公司)；抗Nkx2.5抗体、抗Connexin43抗体、抗cTnT抗体(美国Abcam公司)；内参β-actin抗体(北京博奥森生物技术有限公司)；辣根过氧化物酶标记羊抗鼠抗体、辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体(北京鼎国昌盛生物技术有限公司)；蛋白上样缓冲液、蛋白标记物、TRIzol试剂、反转录试剂盒、qPCR试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)；10%蛋白电泳预制胶、ECL Plus超敏发光液(北京索莱宝科技有限公司)；PVDF滤膜(美国Immobilon公司)；实时荧光定量PCR仪(iQ5)(美国Bio-Rad公司)；电泳仪(北京六一仪器厂)；倒置相差显微镜(日本Nikon公司)；超微量分光光度计(美国Thermo公司)；CO₂培养箱(美国Thermo公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 脐带华通胶间充质干细胞的培养和传代脐带华通胶间充质干细胞株来源于解放军总医院第六医学中心心内科实验室，从人脐带华通胶源组织中提取而来，并进行了鉴定^[10]。复苏第3代脐带华通胶间充质干细胞并接种于T75培养瓶内，细胞贴壁约90%融合后，常规使用0.25%胰酶消化，用无血清培养基终止消化，PBS洗涤，重悬，调整细胞密度为3×10⁵/孔，接种于6孔板，分为实验组和对照组。

1.4.2 脐带华通胶间充质干细胞定向心肌样细胞诱导分化先将胎牛血清与低糖DMEM培养基按照1∶9配置适量的含体积分数为10%胎牛血清的低糖DMEM培养基，用该溶液培养两组细胞，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱中，待细胞融合至80%时向各组培养基中加入浓度为10×10^-6 mol/L 5-氮胞苷^[11]，继续置于37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱中培养24 h，弃去培养基，实验组更换含终浓度为2×10^-6 mmol/L Elabela(多肽序列：Gln-Arg-Pro-Val- Asn-Leu-Thr-Met-Arg-Arg-Lys-Leu-Arg-Lys-His-Asn-Cys-Leu-Gln-Arg-Arg-Cys-Met-Pro-Leu-His-Ser-Arg-Val-Pro-Phe-Pro)、体积分数为10%胎牛血清的低糖DMEM培养基，对照组更换含体积分数为10%胎牛血清的低糖DMEM培养基，每隔2 d换1次液，分别于诱导后7，14，21，28 d在倒置显微镜下观察细胞生长情况，并记录各阶段细胞形态。

1.4.3 Real-Time PCR检测各组细胞心肌特异性mRNA的表达诱导后7，14，21，28 d，采用TransZol UP试剂裂解各组细胞，按照试剂盒说明书提取各组细胞的总RNA。将提取的总RNA按照反转录试剂盒说明操作进行反转录反应，反转录出相对应的cDNA，再以cDNA为模板，根据qPCR试剂盒说明进行Real-Time PCR反应，总反应体系为20 μL，扩增条件为94 ℃、30 s，循环1次；94 ℃、5 s，55 ℃、15 s，72 ℃、10 s，循环40次。使用iQ5仪器进行qPCR反应，记录数据，以GADPH为内参，根据CT值计算心肌特异性标志物Nkx2.5、cTnT、Connexin43 mRNA以及目的基因APJ mRNA表达水平，每个基因设置3个复孔。引物序列见表1。

1.4.4 Western blot检测各组细胞心肌特异性蛋白的表达诱导前、诱导后7，14，21，28 d，每孔加入100 μL细胞裂解液，4 ℃裂解30 min，12 000×g离心5 min后收集上清液，测定蛋白浓度，然后加入适量蛋白上样缓冲液，沸水浴10 min。将定量的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳(配制的胶浓度为12%)，采用湿法转膜，转膜后用5%脱脂奶粉封闭2 h，用配制好的PBST洗3遍，加入适量稀释的一抗，4 ℃孵育过夜，弃去一抗，PBST洗3遍，每次5 min，然加入适度稀释的二抗，室温孵育2 h，弃去二抗，继续用PBST洗3遍，每次5 min；最后使用ECL进行显影，检测心肌特异性标志物Nkx2.5、cTnT、Connexin43蛋白的表达。

1.4.5 流式细胞术检测目的基因APJ的表达收集上述诱导后28 d的实验组、对照组细胞，经0.25%胰酶消化后，PBS清洗1遍，加入稀释到合适浓度的APJ抗体室温孵育 30 min，离心后弃上清，PBS清洗1遍，加入稀释好的合适浓度的二抗，避光孵育30 min，离心后弃上清，PBS清洗1遍，取适量PBS重悬细胞，上流式细胞仪检测，同时收集未经5-氮胞苷和Elabela诱导的脐带华通胶间充质干细胞按相同方法检测。

1.5 主要观察指标 Real-Time PCR和Western blot检测心肌特异性标记物Nkx2.5、cTnT、Connexin43 mRNA和蛋白表达；Real-Time PCR和流式细胞术检测APJ的表达。

1.6 统计学分析采用SPSS 22.0统计软件进行分析。计量资料以x(_)±s表示，多组之间的差异比较采用方差分析，组间两两比较采用SNK-t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

干细胞向心肌样细胞方向诱导分化过程中，转录因子和信号分子在心脏发育中起着重要作用。Connexin43是缝隙连接蛋白，在心肌中缝隙连接介导心脏动作电位的传播和维持心脏规律的搏动。Connexin43控制平滑肌细胞的迁移和增殖，并根据细胞的合成状态增加Connexin43的表达。有研究证明了Connexin43在心脏传导和心脏病中发挥重要作用，另外Connexin43在功能上与钙有关，钙调节其开放/封闭构象，是心室和心肌的重要组成部分^[12-16]。cTnI和cTnT代表心肌损伤的标志物，它们在心肌损伤检测中被广泛应用，在实验心脏病学研究也发挥着很重要的作用^[17-18]。Nkx2.5能调控心脏特异性基因的表达。此外，Nkx2.5作为调节心源性发育的转录因子也从其跨物种的高度保守的结构和功能发生中得到表现^[19-20]。Connexin43、cTnT和Nkx2.5是心肌细胞特异性标记物，因此该研究选择Connexin43、cTnT和Nkx2.5作为检测脐带华通胶间充质干细胞向心肌样细胞定向分化的指标。

Apelin分为多种亚型，其中Apelin13是活性最强的一类^[21-24]。Apelin/APJ系统在心血管系统中发挥着重要作用，调节心脏收缩力，减轻心脏负荷^[25]；Apelin/APJ信号还可以抑制血管紧张素Ⅱ在血管疾病中的作用，促进各类心血管疾病修复时的血管再生^[26-27]。Apelin/APJ系统有多种生物效应，可以调节胃肠功能和胰岛素敏感性，还可以促进细胞增殖、迁移和血管生成，从而调节免疫功能^[28]。有研究发现Apelin/APJ在体内可减轻由血管紧张素Ⅱ、氧化应激和运动引起的心肌肥厚，但是Apelin/APJ可在体外诱导心肌细胞肥大，提出Apelin/APJ系统对心肌肥厚有双重作用^[29]。Elabela是APJ的另一个受体激动剂，Elabela和APJ形成的ELabela/APJ系统可防止压力负荷过重导致的心力衰竭以及血管紧张素Ⅱ引起的心脏损害^[9]。已有研究发现Apelin13可促进胚胎干细胞和间充质干细胞定向心肌样细胞的诱导分化，且作为APJ激动剂的Apelin13在诱导干细胞向心肌样细胞分化过程的促进作用还是很显著的^[3-4]。另外，有实验发现在缺血时血液中Apelin和Elabela水平都会上升，且Apelin和Elabela都是由心肌组织细胞合成的^[30]。COQUEREL等^[31]发现Elabela能够更好地改善心肾系统感染性休克，且比Apelin效果好。

在该研究中，实验组和对照组Nkx2.5、cTnT和Connexin43心肌特异性mRNA和蛋白都有表达，且实验组均高于对照组，分化过程中APJ的表达增加，说明一定浓度的Elabela在诱导脐带华通胶间充质干细胞向心肌样细胞分化过程中起着正向调节的作用，Elabela诱导分化为心肌样细胞的通路是否类似于Apelin通路，目前对Elabela/APJ系统在心血管系统中的作用研究报道较少，有待进一步去探索和发现。作者寄希望于Elabela作为APJ另一个内源性受体激动剂，能够在干细胞治疗过程中发挥着和Apelin相类似的作用，最终能够应用于缺血性心脏疾病的治疗中。

Elabela促进脐带华通胶间充质干细胞向心肌样细胞分化

Elabela promotes differentiation of Wharton’s jelly-derived mesenchymal stem cells into cardiomyocyte-like cells

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