抗氧化合剂对膝骨关节炎模型大鼠结构性退变的作用

doi:10.12307/2021.030

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
骨关节炎：又称为骨关节病、退行性关节病和骨质增生，是一种最常见的关节疾病。该病不仅发生关节软骨损害，还累及整个关节，包括软骨下骨、韧带、关节囊、滑膜和关节周围肌肉，最终发生关节软骨退变、纤维化、断裂、溃疡及整个关节面的损害,其典型的临床表现包括疼痛、僵硬和关节变形。
氧化应激：是指体内氧化与抗氧化作用失衡的一种状态，倾向于氧化，导致中性粒细胞炎性浸润，蛋白酶分泌增加，产生大量氧化中间产物。氧化应激是由自由基在体内产生的一种负面作用，并被认为是导致衰老和疾病的一个重要因素。

背景：氧化应激在骨关节炎的病理过程中起重要作用，导致关节局部炎症和基质降解。此前的研究表明，槲皮素和维生素C等抗氧化剂是治疗骨关节炎的潜在候选药物。
目的：确定槲皮素、维生素C以及甲磺酸去铁胺合剂是否可以延缓创伤后膝骨关节炎大鼠模型的疾病进展。
方法：切断10只SD大鼠的前交叉韧带，构建膝骨关节炎动物模型，随机分为2组，每组5只。术后20周，将50 μL抗氧化合剂(治疗组)或生理盐水(对照组)缓慢注入大鼠术侧膝关节，每周1次，连续4周。抗氧化合剂包含30 g/L维生素C、1 g/L二羟槲皮素和200 mg/L甲磺酸去铁胺。在治疗前、治疗后1周和5周进行步态分析；治疗后5周进行显微CT检测和组织学评分。
结果与结论：①治疗组大鼠步态分析显示，关节腔注射抗氧化合剂不会随着时间的推移改善疼痛相关肢体怠惰指数(P=0.449)；然而在治疗后5周，治疗组的肢体怠惰指数显著低于对照组(P=0.047)；②治疗后5周，显微计算机断层扫描分析显示，两组大鼠的任何参数差异均无显著性意义(P > 0.05)；③两组动物均存在严重的膝骨关节炎组织病理学改变；两组国际骨关节炎研究学会评分相比，差异无显著性意义(P=0.382)；④提示关节腔注射含有槲皮素、维生素C和去铁胺的抗氧化剂合剂不会延缓晚期膝骨关节炎的进展；未来的研究应关注在早期膝骨关节炎中给予抗氧化剂，并延长药物滞留时间，观察其是否能有效延缓膝骨关节炎的进展。

https://orcid.org/0000-0003-1036-4150 (罗安玉)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 骨, 膝关节, 抗氧化剂, 骨关节炎, 氧化应激, 槲皮素, 维生素C

Abstract: BACKGROUND: Oxidative stress plays an important role in the pathological process of osteoarthritis, leading to local inflammation and matrix degradation. Previous studies have shown that antioxidants such as quercetin and vitamin C are potential candidates for treating osteoarthritis.
OBJECTIVE: To determine whether quercetin, vitamin C and desferrioxamine mesylate mixture can delay disease progression in rats with post-traumatic osteoarthritis.
METHODS: The anterior cruciate ligament was cut off in 10 Sprague-Dawley rats to induce osteoarthritis. Animal models were randomized into two groups (n=5 per group). Twenty weeks after operation, 50 μL of normal saline or antioxidant mixture was slowly injected into the affected joint, once a week for 4 successive weeks. The antioxidant mixture consisted of 1 g/L dihydroxyquercetin, 30 g/L vitamin C and 200 mg/L desferrioxamine mesylate. Gait analysis was performed before treatment, 1 week and 5 weeks after treatment. Micro-CT examination and histology scoring were performed 5 weeks after treatment.
RESULTS AND CONCLUSION: Gait analysis showed that intra-articular injection of antioxidant mixture did not improve pain-related limb laziness index (P=0.449). However, 5 weeks after treatment, the limb laziness index in the treatment group was significantly lower than that in the control group (P=0.047). Five weeks after treatment, microcomputed tomography analysis showed that there was no significant difference in any parameters between the treatment group and the control group (P > 0.05). There were severe histopathological changes of osteoarthritis in both groups. The Osteoarthritis Research Society International scores showed no significant difference in both groups (P=0.382). In conclusion, intra-articular injection of antioxidant mixture containing quercetin, vitamin C and desferrioxamine does not delay the progress of osteoarthritis in patients with advanced osteoarthritis. Future studies should aim to determine whether administration of antioxidants and prolonged drug retention time in early osteoarthritis can effectively delay the progress of osteoarthritis.

Key words: bone, knee joint, antioxidant, osteoarthritis, oxidative stress, quercetin, vitamin C

中图分类号:

罗安玉, 刘瀚霖, 谢小飞, 黄琛. 抗氧化合剂对膝骨关节炎模型大鼠结构性退变的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3625-3629.

Luo Anyu, Liu Hanlin, Xie Xiaofei, Huang Chen. Effect of antioxidant mixture on structural degeneration of an osteoarthritis rat model[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(23): 3625-3629.

图/表（结果） 3

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引言

膝骨关节炎是一种退行性关节疾病，可引起关节疼痛、畸形和运动功能丧失[1]。根据世界卫生组织的数据，60岁以上人群中约有9.6%的男性和18.0%的女性患有膝骨关节炎[2]。越来越多的证据表明，过量活性氧引起的氧化应激在膝骨关节炎的发生发展中起重要作用[3]。为了对抗体内升高的氧化应激水平，有学者研发抗氧化剂疗法从而增强细胞的抗氧化状态[4]。其中，槲皮素和维生素C是两种著名的抗氧化剂，对膝骨关节炎的治疗具有潜在的有益作用。
槲皮素是一种在植物性食品中普遍存在的多酚类生物黄酮[5]，体内研究表明槲皮素可降低炎症标志物的表达，恢复抗氧化防御，缓解膝骨关节炎临床体征，延缓佐剂性关节炎大鼠关节炎[6]。维生素C具有清除大量活性氧的能力，具有广泛的抗氧化活性。关于手术诱导豚鼠膝骨关节炎的临床前研究和对膝骨关节炎患者的流行病学研究都表明，膳食摄入高剂量维生素C降低了软骨丢失的风险，延缓了膝骨关节炎的进展[7]。然而，维生素C在铁离子存在的情况下也可以表现出促氧化活性[8]。铁螯合剂，如去铁胺和去铁酮，用于去除体内过多的铁，它可以通过抑制铁催化的破坏性氧代谢产物形成来减轻关节炎的氧化应激[9]。
由于槲皮素、维生素C和去铁胺表现出不同的抗氧化机制，对膝骨关节炎大鼠多次注射这种合剂，可以缓解疼痛，并改善组织学改变[10]。在此次研究中，将进一步分析这种抗氧化合剂在膝骨关节炎晚期缓解疼痛及延缓关节软骨和软骨下骨退行性变中的作用，并将研究结果报道如下。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。
1.2 时间及地点于2019年1月至2020年1月在武汉科技大学附属汉阳医院骨二科完成。
1.3 材料动物实验由武汉科技大学实验动物伦理委员会批准并备案。12只12周龄雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠，平均体质量(229.1±13.2) g。所有动物购自武汉科技大学实验动物中心，许可证号：SYXK(鄂)2015-0053。
1.4 方法

1.4.1 前交叉韧带切断诱导创伤后膝骨关节炎模型及分组 12只雌性SD大鼠进行右膝前交叉韧带切断术诱导膝骨关节炎，脱失2只，剩余10只大鼠按照随机数法分为对照组和治疗组，每组5只。所有大鼠在全身麻醉下，做内侧髌旁切口，使髌骨脱位露出膝关节，用显微剪刀切断前交叉韧带，进行前抽屉试验以确保切断成功。复位髌骨后，依次缝合关节囊和皮肤，术后大鼠置于可自由活动的笼子中。治疗组大鼠进行关节腔内注射槲皮素合剂治疗，对照组关节腔内注射等量生理盐水。

1.4.2 关节腔内注射槲皮素合剂术后20周关节腔内注射药物，每周1次，连续4周。抗氧化合剂包含30 g/L维生素C(Sigma-Aldrich，St.Louis，USA)、1 g/L二羟槲皮素(Sigma- Aldrich)和200 mg/L甲磺酸去铁胺(Sigma-Aldrich)，在无菌蒸馏水中制备为悬浊液。在七氟烷麻醉下，屈膝，
将50 μL抗氧化合剂(治疗组)或生理盐水(对照组)缓慢注入大鼠手术侧膝关节。
1.5 主要观察指标
1.5.1 步态分析在注射药物前(术后20周)以及注射后1，5周，使用Catwalk XT 9.0系统(Noldus Information Technology，Wageningen，荷兰)进行步态分析。允许大鼠自行沿着玻璃走道来回走动。速度变化<30%的活动被记录为符合要求的活动，并用于分析。计算步态参数，包括肢体怠惰指数，以检测膝骨关节炎相关疼痛情况。
1.5.2 显微计算机断层扫描分析治疗后5周，使用过量戊巴比妥处死大鼠。采集整个膝关节节段进行显微计算机断层扫描(μCT)(VivaCT40；Sanco Medical AG，Brüttisellen，瑞士)，分辨率为35 mm。将尺寸为2 mm(L)×1 mm(W)×0.5 mm(D)的矩形目的区域放置在胫骨内侧和外侧骨骺处的软骨下骨中。测定骨小梁指数，包括骨体积/组织体积、骨小梁连接密度、小梁厚度、小梁数目和小梁间距。
1.5.3 组织学评分大鼠膝关节标本在体积分数4%的中性甲醛缓冲溶液中固定过夜，在9%的甲酸中脱钙4周，石蜡包埋。制备5 μm额状面切片，常规苏木精-伊红染色和甲苯胺蓝染色。采用国际骨关节炎研究学会(Osteoarthritis
Society International,OARSI)评分用于评估样本中膝骨关节炎的严重程度，形成2名评估者×6级严重程度(grade)×4个阶段(stage)的综合评分。
1.6 统计学分析使用SPSS 22.0(IBM，芝加哥，美国)进行统计分析。所有参数检验均在Kolmogorov-Smirov检验正态分布之后进行；如变量为非正态分布，使用非参数检验；Friedman检验用于比较步态数据与时间变化的关系；为了比较对照组和治疗组的显微计算机断层扫描数据和组织学评分，根据数据的正态性和性质(连续变量与等级变量)进行Student t检验或Mann-Whitney U检验；通过计算组内相关系数来评估评分者间组织学评分可靠性。P < 0.05被认为差异有显著性意义。

讨论

针对膝骨关节炎，除保守治疗外，药物治疗包括口服非类固醇抗炎药物和关节腔内注射药物，如止痛药、皮质类固醇和透明质酸[11-12]。系统评价表明，关节内给药能够有效缓解膝骨关节炎患者的疼痛症状，但存在一定的不良作用[13-14]。在此次研究中，应用关节腔内注射抗氧化剂合剂干预膝骨关节炎，旨在用自然产生的抗氧化剂抵消膝骨关节炎中的氧化应激反应，同时这些抗氧化剂所产生的药物不良作用较少。此次研究结果表明，关节腔内反复注射含有槲皮素、维生素C和去铁胺的抗氧化剂合剂治疗5周后，能够明显改善肢体怠惰指数，这表明抗氧化剂合剂治疗可以显著减缓早期的膝骨关节炎向步态不对称发展。
槲皮素是一种在植物和水果中广泛分布的黄酮类化合物，文献记载具有降血脂、抗血小板凝集、抗炎、抗过敏等多种药理作用，能够有效清除体内产生的活性氧自由基，降低机体氧化应激水平以及膝骨关节炎、类风湿性关节炎等疾病发生风险[15-16]。国外的一项研究发现，口服槲皮素(45 mg/d)并联合补充氨基葡萄糖及软骨素进行实验干预后，治疗组的膝骨关节炎疼痛症状显著缓解，并证实槲皮素能在体内及体外实验中显著降低巨噬细胞炎性递质包括白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α的生成，抑制基质金属蛋白酶13的表达[17]，从而抑制由于体内氧化应激导致的关节局部炎症水平的增高，进而缓解关节症状。此外，由于关节软骨退变是膝骨关节炎发病的中心环节，而白细胞介素1β可以抑制软骨细胞增殖，诱导软骨细胞去分化和软骨细胞表型改变，从而表现出骨关节Ⅰ型胶原合成增加、Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖合成减少、软骨纤维化和软骨破坏的临床症状[18-19]。槲皮素可抑制白细胞介素1β的表达水平，对关节软骨细胞的细胞表型维持具有保护作用，保护关节软骨的完整性[20]。
在此次研究中，观察到抗氧化合剂对前交叉韧带切断的大鼠有潜在治疗效果，证实抗氧化剂合剂不仅对手术伤口的恢复，对关节疼痛也会产生有效的临床效应。由于反复注射可能会对膝关节造成刺激，影响步态分析，所以在治疗后1周观察到肢体怠惰指数的变化较大，因此很难评价抗氧化合剂对急性疼痛的缓解作用。在此次研究中，对照组和治疗组均观察到严重的软骨退变，但仅在对照组中观察到治疗后步态不对称性的增加，这表明抗氧化剂合剂不能逆转现有的膝骨关节炎改变，但它可能参与调节晚期膝骨关节炎相关的伤害性刺激的缓解。既往研究认为抗氧化剂在生化或组织学结果测量方面具备软骨保护作用，但这些研究缺少对疼痛反应的评估[21-22]。此外，大多数研究在动物模型的膝骨关节炎早期给予抗氧化剂治疗[23]，这意味着抗氧化剂只能延缓膝骨关节炎的早期发展，此时症状和体征并不明显，并未对晚期膝骨关节炎的临床治疗进行针对性研究。目前的临床研究也多关注于早期膝骨关节炎，对晚期患者的研究较少。不同于膝骨关节炎早期的临床症状和体征，晚期膝骨关节炎主要表现为缓慢发展的关节疼痛、压痛、僵硬、关节肿胀、活动受限和关节畸形等[24-25]，滑膜炎程度与伴随疼痛之间关联性的证据不一致，与疾病严重性和临床参数之间的关系仍有争议[26-27]，此次研究中的阴性结果认为晚期膝骨关节炎的抗氧化剂治疗效果并不明显。
药物的治疗时机、持续时间和使用频率也会对治疗效果产生影响。据报道，关节腔内更频繁地注射槲皮素(2次/周，共4周)，会产生更明显的治疗效果[20]；由于关节腔内注射药物的高生物分子清除率，所以需要频繁地注射以维持一定的药物浓度[28]。此次研究中抗氧化合剂为每周注射1次，连续注射4周后观察到阴性结果的原因可能是由于向关节输送药物不足。然而，反复多次的关节腔内注射可能会造成关节的反复创伤，也不利于评估治疗效果。
此次研究存在一定的局限性，包括样本量有限，关键结果指标的组内变异较大，这在很大程度上对研究结果的稳定性产生了影响。对于关节结构的评估，采用显微计算机断层扫描测量和骨性关节炎国际研究学会评分，组间差异较小，但骨小梁连接密度随着膝骨关节炎的进展而增加。但是此项实验结果可为进一步的大样本量研究提供研究线索和佐证，并进一步对剂量效应、药物合剂或治疗效果机制进行深入的挖掘。
结论：此次研究评估了槲皮素、维生素C和去铁胺抗氧化合剂在膝骨关节炎晚期缓解疼痛和延缓关节软骨及软骨下骨退行性变中的作用，证实关节腔注射该抗氧化剂合剂可缓解膝骨关节炎导致的相关疼痛症状，但在组织学上并不会延缓晚期膝骨关节炎的进展。可控给药系统的使用将有助于减少注射次数并维持膝骨关节炎关节中抗氧化剂的生物利用度，这将是膝骨关节炎抗氧化剂治疗的未来方向。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程