一次性力竭运动模型大鼠心肌氧化损伤的作用途径

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2979

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (2): 247-252.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2979

• 组织构建实验造模 experimental modeling in tissue construction • 上一篇下一篇

一次性力竭运动模型大鼠心肌氧化损伤的作用途径

谢文杰1，周刚1，谢金美2，刘姣 1，李鹏飞1，扬帆1，崔迪1

1湖南大学体育学院，湖南省长沙市 410000；2 驻马店市第一人民医院，河南省驻马店市 463100

收稿日期:2020-02-10 修回日期:2020-02-14 接受日期:2020-03-02 出版日期:2021-01-18 发布日期:2020-11-21
通讯作者: 周刚，博士，副教授，湖南大学体育学院，湖南省长沙市 410000
作者简介:谢文杰，男，河南省遂平县人，湖南大学体育学院在读硕士，主要从事运动与心血管方面的研究。
基金资助:
湖南省自然科学基金项目(12JJ3093)

Mechanism of myocardial oxidative damage in a rat model of one-time exhaustive exercise

Xie Wenjie1, Zhou Gang1, Xie Jinmei2, Liu Jiao1, Li Pengfei1, Yang Fan1, Cui Di1

1School of Physical Education, Hunan University, Changsha 410000, Hunan Province, China; 2 Zhumadian Municipal First People’s Hospital, Zhumadian 463100, Henan Province, China

Received:2020-02-10 Revised:2020-02-14 Accepted:2020-03-02 Online:2021-01-18 Published:2020-11-21
Contact: Zhou Gang, PhD, Associate professor, School of Physical Education, Hunan University, Changsha 410000, Hunan Province, China
About author:Xie Wenjie, Master candidate, School of Physical Education, Hunan University, Changsha 410000, Hunan Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Hunan Province, No. 12JJ3093

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
心肌氧化损伤：由活性氧导致的蛋白质氧化而造成心肌组织损伤，此次研究主要探讨在力竭运动下大鼠心肌活性氧大量产生进而攻击心肌细胞导致心肌运动性氧化损伤。
形态学：是研究动物、植物和微生物的整体及其各个组成部分的外形和结构的科学，形态学研究的内容包括生物的解剖学、组织学、细胞学、胚胎学以及生物器官的同源性、同功性、对称性等。形态学的研究手段主要有化学方法和显微技术。此次研究采用的是显微技术法，观察大鼠在力竭运动后心肌细胞形态学的变化，旨在评判力竭运动后大鼠心肌细胞的损伤程度。

背景：力竭运动是生物体在超出其生理极限下进行的剧烈身体活动，它会引起机体各组织产生一系列的变化。心肌运动性氧化应激损伤是指生物体在力竭运动下，通过氧化应激信号途径产生自由基，并对心肌细胞产生损伤的现象。
目的：基于PKC-NOX-ROS途径下，探讨一次性力竭运动造成大鼠心肌运动性氧化应激损伤的机制。
方法：成年雄性SD大鼠30只随机分为对照组、力竭运动组、力竭运动+药物组，每组10只。力竭运动+药物组连续3 d注射蛋白激酶C(PKC)抑制剂chelerythrine 5 mg/kg，力竭运动组、力竭运动+药物组大鼠以25 m/min的速度在0°坡度跑台上运动至力竭，对照组不做处理。运动后即刻取样，先进行采血，再取出左心室以苏木精-伊红染色，观察心肌细胞形态学变化；检测血清与心肌组织丙二醛、心肌活性氧(ROS)水平；大鼠心肌组织中PKC、NOX2、NOX4、3-NT的蛋白表达采用Western blotting法测定。
结果与结论：①力竭运动组、力竭运动+药物组心肌组织均有损伤，且力竭运动+药物组与力竭运动组相比，心肌组织损伤显著降低；②与对照组相比，力竭运动组心肌组织中活性氧水平显著升高(P < 0.05)；③与对照组相比，力竭运动组、力竭运动+药物组心肌组织中丙二醛水平均显著升高(P < 0.01)，力竭运动组血清丙二醛浓度显著升高(P < 0.05)；④与对照组相比，力竭运动后力竭运动组大鼠心肌组织中PKC、NOX2、NOX4、3-NT的蛋白表达水平均显著增加(P < 0.01)；与力竭运动组相比，力竭运动+药物组大鼠心肌组织中NOX2、NOX4显著下降(P < 0.01)，3-NT显著下降(P < 0.05)；⑤提示一次性力竭运动可激活大鼠心肌细胞内PKC并增加其蛋白表达，进而诱导心肌内NOX2与NOX4蛋白表达增加，催化活性氧大量生成，并导致过氧亚硝酸阴离子过量生成，从而产生心肌氧化损伤。
https://orcid.org/0000-0001-5028-2040 (谢文杰)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 力竭运动, 心肌, 氧化损伤, 应激, 活性氧, 丙二醛, 动物, 模型

Abstract: BACKGROUND: Exhaustive exercise is a vigorous physical activity performed by an organism beyond its physiological limits, and it causes a series of histological changes in the body. Myocardial exercise-induced oxidative stress injury means that the organism generates free radicals through oxidative stress signal pathway to damage myocardial cells under exhaustive exercise.
OBJECTIVE: To explore the mechanism of oxidative stress injury in rat myocardium caused by one-time exhaustive exercise based on the protein kinase C (PKC)/NOX pathway.
METHODS: Thirty adult male Sprague-Dawley rats were randomly divided into a control group, an exhaustive exercise group, and an exhaustive exercise+drug group, with 10 rats in each group. The exhaustive exercise+drug group was injected with PKC inhibitor chelerythrine (5 mg/kg body weight) for 3 consecutive days. Rats in the two exercise groups exercised at a speed of 25 m/min on a 0° incline treadmill until exhaustion. Immediately after exercise, blood sample was collected from each rat, and then the rat’s left ventricle was removed for hematoxylin-eosin staining to observe the morphological changes of myocardial cells. Serum and myocardial malondialdehyde and myocardial reactive oxygen species levels were detected. The protein expressions of PKC, NOX2, NOX4 and 3-NT in rat myocardial tissue were determined by western blot.
RESULTS AND CONCLUSION: The myocardial tissues in the exhaustive exercise and exhaustive exercise+drug groups were damaged, but the damage was significantly eased in the exhaustive exercise+drug group compared with the exhaustive exercise group. Compared with the control group, the reactive oxygen species level in the myocardial tissue of the exhaustive exercise group increased significantly (P < 0.05). Compared with the control group, the content of malondialdehyde in the myocardial tissues of the exhaustive exercise and exhaustive exercise+drug groups was significantly increased (P < 0.01), and the concentration of serum malondialdehyde in the exhaustive exercise group was significantly increased (P < 0.05). Compared with the control group, the expression levels of PKC, NOX2, NOX4 and 3-NT proteins in the myocardium of rats after exhaustive exercise were significantly increased (P < 0.01). Compared with the exhaustive exercise group, the expression levels of NOX2 and NOX4 in the myocardial tissue of rats significantly decreased in the exhaustive exercise+drug group (P < 0.01), and the expression of 3-NT significantly decreased (P < 0.05). Therefore, one-time exhaustive exercise can activate PKC and increase its protein expression in rat myocardial cells, which in turn induces an increase in the expression of NOX2 and NOX4 proteins in the myocardium, catalyzes the generation of large amounts of reactive oxygen species, and leads to the excessive production of peroxynitrite anions, thereby causing oxidative damage to the myocardium.

Key words: exhaustive exercise, myocardium, oxidative injury, stress, reactive oxygen species, malondialdehyde, animal, model

中图分类号:

谢文杰, 周刚, 谢金美, 刘姣, 李鹏飞, 扬帆, 崔迪. 一次性力竭运动模型大鼠心肌氧化损伤的作用途径[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(2): 247-252.

Xie Wenjie, Zhou Gang, Xie Jinmei, Liu Jiao, Li Pengfei, Yang Fan, Cui Di. Mechanism of myocardial oxidative damage in a rat model of one-time exhaustive exercise[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(2): 247-252.

图/表（结果） 6

2.1 实验动物数量分析选用大鼠30只，随机分为3组，实验过程中无脱失，全部进入结果分析。
2.2 力竭运动后大鼠心肌组织细胞形态学变化通过形态学观察发现，对照组大鼠心肌组织细胞排列整齐、横纹清晰、细胞外间质较少；力竭运动组大鼠在一次性力竭运动后心肌组织细胞排列絮乱、横纹排列不整齐及模糊现象，并伴随细胞肿大、肌纤维变形且出现断裂、细胞核肿大、细胞间隙增加，心肌细胞受损明显；力竭运动+药物组大鼠注射chelerythrine后，心肌细胞排列整齐但略有变形，肌纤维也略有变形、肌细胞间隙增加、细胞核略有肿大现象，但与力竭运动组相比其损伤程度显著降低，见图1。

2.3 力竭运动后大鼠血清、心肌丙二醛浓度及心肌组织中ROS水平变化见表1。

运动过程中ROS的大量生成，可促使心肌细胞产生运动性氧化应激损伤。大鼠在力竭运动和注射抑制剂后，心肌组织中ROS生成变化，力竭运动组大鼠心肌组织中ROS水平与对照组相比显著升高(P < 0.05)；力竭运动+药物组与力竭运动组相比ROS水平显著下降(P < 0.05)。
丙二醛生成水平是测量机体自由基代谢及脂质过氧化程度重要指标之一。与对照组相比，力竭运动组、力竭运动+药物组大鼠心肌组织中丙二醛浓度均显著增加(P < 0.01)；力竭运动+药物组与力竭运动组相比丙二醛浓度下降(P < 0.05)。力竭运动组大鼠血清中丙二醛浓度与对照组相比显著增加(P < 0.05)。
2.4 力竭运动后大鼠心肌组织中PKC、NOX2与NOX4的蛋白表达水平变化 PKC作为一种蛋白水解激活的激酶，在一次性力竭运动后发现，心肌组织中PKC的蛋白表达变化见图2。力竭运动组、力竭运动+药物组大鼠PKC蛋白表达水平与对照组相比均显著增加(P < 0.01)。

在一次性力竭运动后，大鼠心肌组织中NOX2的蛋白表达见图3。力竭运动组大鼠心肌组织中NOX2蛋白表达水平与对照组相比显著增加(P < 0.01)，力竭运动+药物组与力竭运动组相比NOX2蛋白表达水平显著下降(P < 0.01)。

大鼠心肌组织NOX4蛋白表达在力竭运动后的变化见图4。力竭运动组与对照组相比，运动后心肌组织中NOX4的蛋白表达水平显著增加(P < 0.01)；力竭运动+药物组与对照组相比，心肌组织中NOX4蛋白表达水平增加(P < 0.05)；力竭运动+药物组心肌组织中NOX4蛋白表达水平与力竭运动组相比显著下降(P < 0.01)。

2.5 力竭运动后大鼠心肌组织中3-NT蛋白水平变化大鼠心肌组织中3-NT的生成量是推测ONOOˉ生成量的主要标记物。力竭运动后大鼠心肌组织中3-NT水平变化见图5，与对照组相比，力竭运动组大鼠心肌组织中3-NT水平显著增加(P < 0.01)；力竭运动+药物组与力竭运动组相比，3-NT水平在心肌组织中显著下降(P < 0.05)。

参考文献

[1] Fenning A, Harrison G, Dwyer D, et al. Cardiac adaptation to endurance exercise in rats. Mol Cell Biochem.2003; 251(1-2):51-59.
[2] 许思毛,上官若男,彭峰林,等. 运动预处理对大负荷跑台运动引起的大鼠心肌损伤干预作用及其机制探讨[J]. 体育科学, 2012, 32(7):45-52.
[3] Wang Y, Xu P, Wang Y, et al. The protection of salidroside of the heart against acute exhaustive injury and molecular mechanism in rat. Oxid Med Cell Longev. 2013;2013(5):507832.
[4] Holmström KM, Finkel T. Cellular mechanisms and physiological consequences of redox-dependent signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 2014;15(6):411-421.
[5] Finkel, T. Signal transduction by reactive oxygen species. J Cell Biol. 2011;194(1):7-15.
[6] Brown I, Griendling KK. Regulation of signal transduction by reactive oxygen species in the cardiovascular system. Circ Res. 2015; 116(3):531-549.
[7] Zeng Q, Han Y, Bao Y, et al. 20-HETE increases NADPH oxidase-derived ROS production and stimulates L-type calcium channel via PKC-dependent mechanism in cardiomyocytes. Am J Physiol Heart Circ Physiol . 2010;299(4):H1109-1117.
[8] 成永霞,刘贵波,颜彬,等.PKC/NADPH氧化应激途径对大鼠心脏微血管内皮细胞eNOS脱偶联的影响[J].基础医学与临床,2013, 33(1):82-87.
[9] Koçer G, Sentürk UK, Kuru O, et al. Potential sources of oxidative stress that induce postexercise proteinuria in rats. J Appl Physiol (1985). 2008;104(4):1063-1068.
[10] Bedford TG , Tipton CM , Wilson NC , et al. Maximum oxygen consumption of rats and its changes with various experimental procedures. J Appl Physiol. 1979;47(6):1278-1283.
[11] 陈丽娜, 周刚, 吴乐, 等. 力竭运动对大鼠肾脏的影响[J]. 中国康复理论与实践, 2016, 22(7):789-792.
[12] 王凯. 蛋白激酶C对晚期运动预处理心肌保护效应中缝隙连接蛋白43表达的影响[J]. 中国运动医学杂志, 2015, 34(11): 1079-1084, 1097.
[13] 陈丽娜, 周刚, 吴乐, 等. NADPH氧化酶抑制剂apocynin对力竭运动大鼠运动性蛋白尿的影响[J].中国应用生理学杂志, 2016, 32(2): 116-120.
[14] 李晶晶,徐鹏,平政,等. 运动预适应对力竭大鼠心功能的影响[J]. 解放军医药杂志,2019,31(7): 9-14.
[15] 路富林,余琦,魏明. 运动预处理对大鼠心脏缺血再灌注损伤的保护作用[J]. 郑州大学学报(医学版), 2018,53(3): 323-327.
[16] Muthusamy VR, Kannan S, Sadhaasivam K, et al. Acute exercise stress activates Nrf2/ARE signaling and promotes antioxidant mechanisms in the myocardium. Free Rad Biol Med. 2012;52(2): 366-376.
[17] Frankiewicz-Jóźko A, Faff J, Sieradzan-Gabelska B. Changes in concentrations of tissue free radical marker and serum creatine kinase during the post-exercise period in rats. Eur J Appl Physiol Occup Physiol. 1996;74(5):470-474.
[18] Huang CC, Tsai SC, Lin WT. Potential ergogenic effects of l-arginine against oxidative and inflammatory stress induced by acute exercise in aging rats. Exp Gerontol. 2008;43(6):571-577.
[19] 谢永磊, 徐宛玲, 黄亚男, 等. 大豆肽通过抑制氧化应激和NF-κB信号通路保护力竭运动大鼠心脏功能[J]. 中国老年学杂志, 2019, 39(5):1158-1161.
[20] Qiu Y, Ping P, Tang XL, et al. Direct evidence that protein kinase C plays an essential role in the development of late preconditioning against myocardial stunning in conscious rabbits and that epsilon is the isoform involved. J Clin Invest. 1998; 101(10):2182.
[21] Zhao J, Renner O, Wightman L, et al. The Expression of Constitutively Active Isotypes of Protein Kinase C to Investigate Preconditioning. J Biol Chem. 1998;273(36):23072-23079.
[22] Bowman JC, Steinberg SF, Jiang T, et al. Expression of protein kinase C β in the heart causes hypertrophy in adult mice and sudden death in neonates. J Clin Invest. 1997;100(9):2189-2195.
[23] Braz JC, Bueno OF, Molkentin WJD. PKCα Regulates the Hypertrophic Growth of Cardiomyocytes through Extracellular Signal-Regulated Kinase1/2 (ERK1/2). J Cell Biol. 2002;156(5):905-919.
[24] Pinton P, Rimessi A, Marchi S, et al. Protein Kinase C β and Prolyl Isomerase 1 Regulate Mitochondrial Effects of the Life-Span Determinant p66Shc. Science. 2007;315(5812):659-663.
[25] Voris JP, Sitailo LA, Rahn HR, et al. Functional alterations in protein kinase C beta II expression in melanoma. Pigment Cell Melanoma Res. 2009; 23(2):216-224.
[26] Drummond GR, Selemidis S, Griendling KK, et al. Combating oxidative stress in vascular disease: NADPH oxidases as therapeutic targets. Nat Rev Drug Discov. 2011;10(6):453-471.
[27] Giordano FJ. Oxygen, oxidative stress, hypoxia, and heart failure. J Clin Invest. 2005; 115(3):500-508.
[28] Lassegue B, San MA, Griendling KK. Biochemistry，physiol-ogy，and pathophysiology of NADPH oxidases in the cardi-ovascular system. Circ Res. 2012;110(10):1364-1390.
[29] Bey EA, Xu B, Bhattacharjee A, et al. Protein kinase C delta is required for p47phox phosphorylation and translocation in activated human monocytes. J Immunol. 2004;173(9):5730-5738.
[30] Petry A, Djordjevic T, Weitnauer M, et al. NOX2 and NOX4 mediate proliferative response in endothelial cells. Antioxid Redox Signal. 2006; 8(9-10):1473-1484.
[31] Kim YM, Kim SJ, Tatsunami R, et al. ROS-induced ROS Release Orchestrated by Nox4, Nox2 and Mitochondria in VEGF Signaling and Angiogenesis. Am J Physiol Cell Physiol . 2017;312(6):C749-C764.
[32] Raad H, Paclet M H, Boussetta T, et al. Regulation of the phagocyte NADPH oxidase activity: phosphorylation of gp91phox/NOX2 by protein kinase C enhances its diaphorase activity and binding to Rac2, p67phox, and p47phox. FASEB J. 2009;23(4):1011-1022.
[33] 丁勇,王建月,许思毛.PKCδ/NOX途径介导一次性力竭运动大鼠心肌过氧化损伤的研究[J]. 北京体育大学学报, 2016, 39(3):73-80, 105.
[34] Xu H, Goettsch C, Xia N, et al. Differential roles of PKCα and PKCɛ in controlling the gene expression of Nox4 in human endothelial cells. Free Radic Biol Med. 2008;44(8):1656-1667.
[35] Gill EK, Edgar KS, Wilson AJ, et al. 7 NOX4 NADPH oxidase is a key regulator of endothelial cell function in experimental diabetes. Br Heart J. 2018;104(Suppl 4):A7.
[36] 余薇, 闵清, 郭霜. NADPH氧化酶在高糖诱导的H9C2心肌细胞损伤中的作用[J]. 中国药理学通报, 2015,31(10):1379-1382.
[37] 黄礼兵,邹蓉,朱明慧,等.NADPH氧化酶抑制剂Apocynin预防脂多糖心肌纤维化的研究[J].实用药物与临床,2017,20(10): 1119-1122.
[38] Lokuta AJ. Increased Nitration of Sarcoplasmic Reticulum Ca2+-ATPase in Human Heart Failure. Circulation. 2005;111(8):988-995.

引言

不同强度的体育锻炼对机体的影响各不相同，中低强度的有氧运动对于提高机体身心健康是有益的，但是长时间耐力性运动引起机体过度疲劳或力竭状态时，会对机体健康有害而无益。体育锻炼不仅会对机体产生影响，而且也会对机体的各器官产生广泛影响，例如心肌细胞的代谢[1]。目前已有研究表明，过度运动会诱导大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)在心肌细胞内生成，进而发生氧化应激反应，引起心肌组织产生过氧化损伤[2-3]。
心肌细胞中ROS的生成主要来源于线粒体呼吸链、黄嘌呤氧化酶、脂氧合酶、髓过氧化物酶、非偶联一氧化氮合酶和NADPH氧化酶NOX，其中发挥着主要作用的是线粒体呼吸链酶和NOX[4-6]。NOX是一种产生ROS的多亚基跨膜蛋白，根据其结构特异性可将NOX分为7种亚型，分别为NOX1-5、DUOX1、DUOX2，这些同工酶不仅在不同的组织中其表达和作用各不相同，而且它们的活性也受不同蛋白的调节。最近研究发现，蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)作为蛋白水解激酶在诱导NOX产生大量ROS致使心肌损伤中发挥重要作用[7]。也有研究发现，产生心肌氧化应激的机制可能是糖末基化终末产物通过激活PKC诱导心肌NOX生成大量ROS所导致[8]。
然而，PKC在力竭运动中是否会被激活并通过调节心肌细胞内NOX产生ROS，进而促进心肌细胞氧化应激损伤，目前尚不清楚。因此，此次实验通过建立大鼠一次性力竭运动模型，在PKC抑制剂chelerythrine(主要抑制亚型PKCα、PKCβ、PKCγ)的干预下，探究是否在PKC/NOX/ROS途径下，促进大鼠心肌组织氧化应激损伤。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。
1.2 时间及地点于2018年10月至2019年7月在湖南大学人体科学基础实验室完成。
1.3 材料体质量250-280 g的雄性SD大鼠共30只，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物许可证号：SCXK (湘)2016-0002。大鼠自由进水、饮食，在20-25 ℃室温及40%-60%的环境湿度下饲养，光线昼夜自然变化。
PKC抗体购于SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY；NOX2、NOX4、二抗抗体购于武汉博士德生物工程有限公司；3-NT抗体购于美国Sigma-aldrich公司；GADPH抗体购于杭州贤至生物科技有限公司。
1.4 方法
1.4.1 动物分组与运动方案饲养3 d后，随机将大鼠分为对照组、力竭运动组、力竭运动+药物组。力竭运动模型根据KOÇER等[9]的运动方案进行改进，运动强度根据BEDFORD等[10]对大鼠最大摄氧量的研究进行设定。对照组恒定环境下自由活动，无任何运动负荷施加，饲养于笼内。力竭运动组首先进行连续3 d的适应性跑台运动，每次以5 m/min的速度运动5 min；第4天采用无坡度跑台，以初速度为5 m/min，且每5 min速度增加5 m/min直至达到25 m/min速度时恒定不变，使大鼠运动至力竭。整个运动过程采用声、光、电等方法刺激大鼠持续运动。力竭标准[11]：眼睛无光，毛发竖起，进行声、光、电等刺激无反应，翻正反射消失。力竭运动+药物组大鼠的运动方案与力竭运动组相同，连续3 d于适应性运动前1 h腹腔注射PKC抑制剂chelerythrine(5 mg/kg，由上海羽朵生物科技有限公司提供，批号：JS90286)，1次/d[12-13]。同时，对照组、力竭运动组腹腔注射相同剂量的生理盐水。
1.4.2 样本的采集与处理在力竭运动结束后立即麻醉进行解剖取样。麻醉后进行左心室取血，用10 mL离心管封闭，静置3 h离心取上清。采血结束后，取出心脏组织用NaCl溶液清洗表面，剔除结缔组织，滤纸滤干进行样品管封闭，放入液氮，然后保存在-80 ℃冰箱，以备匀浆。
石蜡切片的制作过程：样本采集时取出心脏组织后立即取心尖，放入固定液，再经脱水、透明、透蜡后进行石蜡包埋。制备5 μm厚度切片，石蜡切片依次通过脱蜡、水化、苏木精染色、分化、反蓝、伊红染色、脱水、透明、封固的过程，制成苏木精-伊红染色切片。将切片放大400倍，进行显微镜形态学观察，并随机选取视野进行组间对比观察。
丙二醛测试：首先进行倍比稀释TEP原液，取5种不同浓度TEP各100 μL放入标准管。然后配置混合液，分别向样品管、空白管、标准管加入3 mL。2%BHT分别取40 μL加入样品管、空白管、标准管，空白管加入100 μL乙醇。每样品管中加入100 μL样品后立即混匀，水浴60 min(水温95 ℃)，加入4 mL正丁醇混匀，离心15 min，取上清液，采用721分光光度计测定吸光度(A)值，丙二醛浓度由测试各样品的A值带入标准曲线计算，单位μmol/L。
ROS测定：采用荧光探针法(DCFH-DA)检测，试剂购于美国Sigma-aldrich公司。用96孔板检测，检测孔每孔心肌组织匀浆100 μg，每个样品添加4份，其中2孔添加生理盐水20 μL，另外2孔添加20 μL混合液。最后加入DCF工作液60 μL，避光后混匀1 min，孵育30 min(37 ℃)，多功能酶标仪检测，激发波长485 nm，发射波长525 nm，读取A值，然后取对照组A值为100%，其他各组与之比较，得出的数值为检测值。
心肌组织蛋白浓度测量：采用BCA蛋白浓度测定法，试剂盒由碧云天生物技术研究所提供，并根据试剂盒说明操作。
心肌组织中PKC、NOX2、NOX4、3-NT(3-nitrotyrosine)、GADPH蛋白水平测定：采用蛋白免疫印迹法(Western blotting)检测：①制备12%丙烯酰胺PAGE胶；②加样；③电泳；④转膜，PVDF膜；⑤5%牛奶封闭30 min；⑥加入一抗4 ℃下旋转过夜；⑦1%TBS-T漂洗；⑧加入二抗，孵育1 h；⑨1%TBS-T洗膜；⑩ECL荧光显色；⑪洗片。一抗和二抗与内参之间的浓度比例依据抗体说明书进行取量，一抗：PKC浓度比是1∶500，NOX2、NOX4、3-NT 浓度比是1∶1 000；二抗：羊抗兔、羊抗小鼠浓度比均为1∶5 000。
1.5 主要观察指标运动后即刻取样，先进行采血，再取出左心室以苏木精-伊红染色，观察心肌细胞形态学变化；检测血清与心肌组织丙二醛、心肌ROS水平；大鼠心肌组织中PKC、NOX2、NOX4、3-NT的蛋白表达采用Western blotting法测定。
1.6 统计学分析以SPASS for Windows 21.0统计软件分析测量结果。数据结果采用x±s表示，并进行多因素方差分析，P < 0.05代表差异有显著性意义。

讨论

3.1 一次性力竭运动对大鼠心肌组织氧化应激损伤的影响氧化应激是由ROS的大量生成和抗氧化防御机制之间的不平衡而引起,它在较低水平下会引起细胞过氧化损伤，但较高水平下会引起细胞功能障碍和损伤。尤其在过度运动下可通过诱导ROS在心肌细胞内大量生成，进而发生氧化应激反应，可引起心肌组织产生过氧化损伤[14-15]。
在一次性大强度长时间的运动下，可增加心肌氧的消耗，进而会生成大量ROS并与抗氧化剂之间失去平衡，诱发ROS急剧增加并导致氧化应激和心脏结构、代谢受损。已有研究表明，力竭运动会导致ROS和抗氧化防御之间失衡，从而导致心肌氧化应激[16]。同时也有研究表明,力竭运动会在体内诱导自由基大量生成，并导致大鼠心脏发生氧化损伤[17-18]。然而，通过抑制心脏内氧化应激传导信号途径，也可有效减轻力竭运动下心肌氧化应激损伤的程度[19]。
此次研究结果发现，在大鼠一次性力竭运动模型下，与对照组相比力竭组大鼠心肌ROS生成量显著增加，且血清与心肌组织中脂质过氧化产物丙二醛水平上升，与对照组相比差异有显著性意义；同时通过显微镜形态学观察发现，力竭组大鼠在一次性力竭运动后心肌组织细胞排列絮乱、横纹排列不整齐及模糊现象，并伴随细胞肿大、肌纤维变形且出现断裂、细胞核肿大、细胞间隙增加，心肌细胞受损明显，在PKC抑制剂chelerythrine干预下大鼠心肌组织损伤显著降低。因此，该研究认为在大鼠一次性力竭运动后ROS的大量生成会导致心肌氧化应激的产生，进而介导心肌细胞氧化损伤，而力竭药物组在注射PKC抑制剂chelerythrine后，心肌细胞损伤程度显著降低。
3.2 一次性力竭运动下PKC抑制剂对大鼠心肌组织中PKC蛋白表达及ROS的生成的影响 ROS介导细胞信号传导途径在医学及运动生理学领域的重要性日益增加，因此关于通过蛋白调节进而调节ROS生成的研究也引起了人们的极大兴趣。而细胞中蛋白激酶和磷酸酶在介导ROS生成、并促进信号传递中具有关键作用，它们可通过被氧化修饰进而调节ROS的生成的原因是，这些蛋白质含有氧化还原敏感的半胱氨酸残基。
而PKC在参与多种细胞信号通路中具有易于氧化修饰的独特特征。PKC家族是由丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶组成，它们参与调节细胞生长、分化、凋亡、转化等多种途径。已有研究表明，心脏中存在多种PKC同工酶，每个同工酶都在心脏中发挥的作用也各不相同，例如适当激活PKCδ和PKCɛ可减轻鼠心肌的缺氧损伤[20-21]，而PKCα、PKCβⅠ和PKCβⅡ的过度表达可导致心脏病理生理性肥厚和收缩功能障碍[22-23]。此外，PKC还被证明可以促进内源性ROS的产生，已有研究表明，PKCβ可通过线粒体损伤诱导ROS的产生[24]；在黑色素瘤中，PKCβⅡ的表达减少会降低ROS的产生，并促进黑色素瘤细胞在氧化应激条件下的存活和生长[25]。
此次研究在一次性力竭运动下，通过PKC抑制剂 chelerythrine干预后，大鼠心肌ROS生成较力竭组显著降低。同时，在力竭运动后PKC抑制剂并未影响其蛋白表达，且与对照组相比力竭组及力竭运动+药物组PKC的蛋白表达均显著性增加。
3.3 一次性力竭运动下PKC抑制剂对大鼠心肌组织中NOX2、NOX4的蛋白表达影响力竭运动诱导心肌氧化应激损伤是运动过程中导致其心肌功能下降的重要因素。运动性心肌ROS可通过多种途径产生，NOX就是其中最重要的一种，它通过NADPH作为电子供体利用氧分子生成ROS[26]，进而促使心肌细胞产生缺血性损伤[27-28]。且NOX也可通过多种途径被激活进而产生ROS，而PKC作为蛋白水解激活的激酶，在调节NOX亚基产生ROS中起关键作用[29]。
在NOX同工酶中NOX2、NOX4是心脏中ROS生成的主要来源，它们广泛分布在心血管系统中，例如内皮细胞、心肌细胞、成纤维细胞和血管平滑肌细胞中。NOX4通常与NOX2共同表达发挥其作用，且NOX2和NOX4都是生成ROS的必要物质[30]。有研究表明，在内皮细胞中NOX4产生的H2O2通过pSer36-p66Shc可激活NOX2以增加mtROS[31]；也有学者研究发现，NOX2的2种亚基p47phox和p40phox，均可介导细胞溶质亚基易位并与细胞色素C结合进而激活NOX2活性[32]，并促进ROS的生成。在力竭运动的研究中发现，一次性力竭运动下可激活PKCδ，并诱导gp22 phox与gp91 phox mRNA表达而提高NOX活性，催生过量ROS并引起心肌可逆性过氧化损伤[33]。同时也有研究发现，通过siRNA介导NOX4降低可以有效防止ROS的增加[34]。而高糖诱导的NOX4被激活后，可调节内皮细胞中ROS的生成和内源性抗氧化剂表达，从而促进成纤维细胞分化[35]。然而，关于NOX活性在心肌氧化应激损伤的研究中也有学者发现，NOX活性的升高可诱导心肌细胞产生氧化应激损伤[36]，并且通过NOX抑制剂抑制NOX2、NOX4的表达可预防脂多糖引起的小鼠心肌纤维化[37]。
因此，此次研究通过建立大鼠一次性力竭运动模型，发现NOX2、NOX4在心肌组织中的蛋白表达明显增加，进而催化更多的ROS生成，并促进心肌氧化应激损伤，这与之前的研究结果相一致。
3.4 一次性力竭运动对大鼠心肌组织中3-NT生成的影响ONOO¯是一种强效的非自由基氧化剂，它的生成主要是由于NO和O2•¯的快速非酶促反应生成，且反应不可逆。因此，心肌细胞中ONOO¯水平变化，直接受ROS生成量的影响。ONOO¯在心肌细胞中，主要通过强氧化作用、硝基化作用、影响能量代谢及干扰钙运转4条途径发挥其毒性作用。
ONOO¯的过量产生可导致DNA、脂质和蛋白质的损伤，以及血管病变。由于蛋白质中的酪氨酸残基可通过ONOO¯的硝基化生成3-NT，而ONOO¯在机体产生后会迅速消失，此次研究通过检测其标记物3-NT的生成量推测ONOO¯生成水平。有学者研究发现，心衰中SERCA2a特定残基介导的3-NT大量增加，会导致钙泵活性及心脏舒张率降低，进而促使心功能下降[38]。
此次实验发现，力竭组与对照组相比，大鼠心肌组织中3-NT水平显著增加；在PKC抑制剂chelerythrine干预后，力竭药物组与力竭组相比，3-NT水平显著降低。因此，作者认为3-NT的产生机制是力竭运动促使PKC活性增加，并诱导NOX2、NOX4蛋白表达明显增加进而使ROS大量生成，而心肌细胞中ROS的大量生成导致一氧化氮和O2•¯的快速非酶促反应迅速上升，进而促进3-NT的生成，使心肌细胞产生氧化损伤更为严重。
结论：此次实验通过建立大鼠一次性力竭运动模型，发现大鼠心肌氧化应激损伤产生的原因是：①力竭运动可通过激活心肌组织中PKC并增加其蛋白表达，进而诱导NOX2、NOX4在心肌中蛋白表达增加，使其产生大量的ROS，对心肌细胞造成过氧化损伤；②ROS的大量生成可促使O2•¯与NO结合导致ONOO¯的急剧增加，进而促进蛋白质酪氨酸硝基化产生3-NT，对心肌细胞造成过氧化损伤；③在PKC抑制剂chelerythrine干预下，力竭运动后大鼠心肌组织损伤显著降低。因此，研究认为PKC/NOX/ROS途径是产生心肌氧化应激损伤的重要机制。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

一次性力竭运动模型大鼠心肌氧化损伤的作用途径

Mechanism of myocardial oxidative damage in a rat model of one-time exhaustive exercise

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 6

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	莫伟彬, 黄天昌, 曾智伟, 燕林博. 葛根总黄酮干预长时耐力运动后再力竭运动大鼠脑组织β-连环蛋白及糖原合成酶激酶3β的表达[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 736-741.
[2]	耿元文, 林琴琴, 李若明, 唐韶慨, 王柏慧, 田振军. 一次性力竭运动模型促进大鼠肾脏NOD样受体蛋白3炎性小体的表达[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(2): 190-196.
[3]	朱蕊, 曾庆, 黄国志. 铁死亡与脑卒中[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3734-3739.
[4]	黄旭东, 易志勇, 韩清民. 经筋手法干预膝骨关节炎模型兔骨骼肌收缩力学的改变[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(2): 201-204.
[5]	赵一朗, 刘滔, 杨惠林, 何帆. 细胞外基质增强人脐带干细胞的抗氧化能力[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(25): 3953-3958.
[6]	钟萍, 崔兴 . 黄芩苷调控自噬保护肠黏膜屏障干预肠道急性移植物抗宿主病 [J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(25): 4028-4032.
[7]	蒋宇凌, 莫伟彬, 唐健, 李敏华. 葛根总黄酮干预力竭性运动模型大鼠脑组织炎症细胞因子及信号传导和转录活化因子3的表达[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(23): 3678-3684.
[8]	刘晓晨, 王改凤. 运动预适应与力竭运动大鼠心肌损伤：Rho/ROCK信号通路的作用[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(11): 1714-1719.
[9]	赵延礼, 秦海兰, 崔浩, 甘罗曼, 司立宁 . 低氧训练中过表达血红素加氧酶1促进小鼠骨骼肌线粒体的生物合成[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(19): 2991-2995.
[10]	莫伟彬，周琰，杨衍滔. 跑台运动和益生菌干预对大鼠不同组织细胞膜的保护作用[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(12): 1877-1882.
[11]	彭峰林，黄丽丽，郭艳菊. 运动性心肌缺血损伤模型大鼠的制备[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(40): 6007-6013.
[12]	孙晓娟，薛海涛. 构建运动预适应力竭运动损伤模型大鼠心脏JAK2的表达变化[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(20): 3216-3220.
[13]	刘霞，蒋嘉烨，陆海英，顾翠英，蔡美琴. 力竭运动后24 h模型大鼠肾脏结构和炎症因子对黑加仑提取物干预的反应[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(49): 8020-8025.
[14]	林喜秀，赵用强，谢亚萍，邱继旺，罗自强，瞿树林. 模拟4 000 m高住及抗炎活血解痉中药干预力竭运动大鼠肾细胞超微结构变化[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(38): 6146-6152.
[15]	林喜秀，邱继旺，罗自强，瞿树林，赵用强. 急性力竭运动模型大鼠鱼腥草素干预后的肾滤过屏障变化[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(36): 5793-5798.