2  结果  Results

2.1  实验动物数量分析  参加实验动物16只，14 d后进入结果分析小鼠16只，中途无脱落。

2.2  小鼠临床急性移植物抗宿主病评分  根据上述制订的临床急性移植物抗宿主病评分标准，治疗组整体情况较模型组好，两组比较差异有显著性意义(P < 0.05，P < 0.01)，见表2。

2.3  小肠黏膜病理急性移植物抗宿主病分级  模型组小鼠肠黏膜可见大量炎性细胞浸润，隐窝内及隐窝上皮均可见大量中性粒细胞浸润，伴杯状细胞减少，并可出现黏膜上皮脱落、缺失或坏死，见图1A；治疗组小肠黏膜上皮结构相对完整，可见少量炎性细胞浸润，腺体细胞排列相对整齐，杯状细胞较多，存在少量的黏膜上皮脱落坏死，见图1B。急性移植物抗宿主病分级见表3，模型组均为Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级急性移植物抗宿主病，治疗组发生0、Ⅰ级急性移植物抗宿主病占50%，提示黄芩苷在改善肠道急性移植物抗宿主病方面的总体效果明显。

2.4  透射电镜下观察自噬泡结构  伴随着放疗对小肠黏膜的破坏，造模后小鼠可以观察到自噬泡的产生。模型组可以观察到较少的自噬泡，线粒体结构破坏、嵴消失、正常线粒体数量减少，见图2A；治疗组自噬泡多见，线粒体结构相对完整，见图2B，证明黄芩苷可以促进自噬，减少线粒体的破坏，保护肠黏膜屏障。

2.5  小肠细胞内活性氧水平  治疗组活性氧水平明显低于模型组(1.81±0.08 vs. 2.43±0.08)，差异有显著性意义 (P < 0.01)，见图3。因此，可以认为黄芩苷可通过降低活性氧水平，从而降低对肠道黏膜屏障的损伤。

2.6  各组小鼠小肠黏膜上皮细胞LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1的表达  Western blot法测定小肠黏膜上皮细胞LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1的表达，见图4。模型组小鼠组织中LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1表达均较低，说明移植后小肠自噬水平较低，而应用黄芩苷后自噬水平升高，标志着处理异常物质的代谢水平提高。

根据发病时间或特异征象、临床理化特点，可将移植物抗宿主病分为急性和慢性2种类型，急性移植物抗宿主病发生在移植后早期，若移植后未及时给予免疫抑制剂等药物预防急性移植物抗宿主病，其发生率可达100%，死亡率非常高。即便是同胞全相合造血干细胞移植，应用标准的免疫抑制剂方案预防后，仍有30%-60%的患者有发生急性移植物抗宿主病的风险^[1]。

预处理化疗后肠黏膜屏障损伤是急性移植物抗宿主病发生的初始机制，而自噬失衡、氧自由基释放失控是一个非常重要的影响因素^[2]。在氧化应激下，氧自由基能诱导线粒体内膜过氧化损伤，导致细胞肿胀坏死。氧自由基也可经由线粒体的钙超载级联活化caspase，导致细胞凋  亡^[3-4]，而供者T细胞也可以通过此途径进一步加重肠黏膜屏障损伤。目前，西药的一线治疗主要为激素，但长期应用激素可能会加重感染并诱发消化道溃疡，而中药干预肠道移植物抗宿主病的相关研究较少。研究发现，黄芩汤、黄芩苷等治疗消化系统疾病尤其是溃疡性结肠炎疗效满 意^[5-6]。如何应用中药干预肠黏膜屏障损伤后的自噬失衡状态，从而最终打断急性移植物抗宿主病进程是临床亟需解决的问题。该研究探讨黄芩苷调控自噬干预肠道急性移植物抗宿主病发生率和临床症状的机制。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1  材料和方法  Materials and methods

1.1  设计  随机对照动物实验。

1.2  时间及地点  实验于2019年1至7月在北京科忠智实验有限公司完成。

1.3  材料

1.3.1  实验动物及分组  供鼠：Balb/c H-2d小鼠5只，雄性，10-12周龄，清洁级；受鼠：CB6F1小鼠(Balb/c×C57BL/6 F1 H-2d/b)16只，雌性，10-12周龄，清洁级。实验动物由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物生产许可证号SCXK(京)2012-0001。

1.3.2  实验药物、试剂和仪器  黄芩苷(98%)购于西安源森生物科技公司，生产批号：YS121121。LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、Beclin-1单克隆抗体(美国Affinity Biosciences公司)；病理切片机(莱卡公司，ULTRACUT UCT/UC6)；透射电镜(美国FEI公司，TECNAI SPIRIT)。

1.4  实验方法

1.4.1  小鼠单倍体造血干细胞移植后急性移植物抗宿主病模型的建立  参照文献[7]，近交系Balb/c H-2d小鼠脱臼处死，无菌制成骨髓及脾脏单细胞悬液。⁶⁰Co全身照射(总照射剂量5 Gy)CB6F1小鼠后4 h内，经尾静脉输注Balb/c小鼠单个核细胞悬液，骨髓细胞8×10⁷/只+脾细胞8×10⁷/只。

1.4.2  骨髓及脾脏单细胞悬液移植后小鼠一般生存状况观察  移植后每天给小鼠称质量，观察小鼠进食、毛发改变及腹泻情况。参照文献[8]，对小鼠进行临床急性移植物抗宿主病症状评分，每项评分超过1.5分或临床总评分超过3分以上，视为急性移植物抗宿主病发作，见表1。

1.4.3  实验动物分组及干预  CB6F1小鼠16只，随机分为模型组和治疗组，每组8只。参照上述方法造模，造模后当天开始模型组灌胃生理盐水，治疗组灌胃黄芩苷，剂量为30 mg/(kg·d)，共14 d；14 d后处死全部小鼠，留取小肠组织备用。

1.5  主要观察指标

1.5.1  小肠黏膜组织病理学形态  取由40 g/L多聚甲醛固定的小肠组织，石蜡包埋，组织切片，苏木精-伊红染色，镜下观察并拍照记录小肠组织病理学形态。

1.5.2  肠黏膜上皮细胞的提取  参考EVANS等^[9]方法进行小肠黏膜上皮细胞的分离。将十二指肠和空肠分别剪碎成小片，加入蛋白酶进行消化，清洗后再用分散液多次分离，最终得到小肠黏膜上皮细胞悬液，用于检测活性氧水平、自噬相关蛋白表达水平。

1.5.3  透射电镜观察小肠黏膜上皮自噬泡结构  小肠黏膜上皮组织经戊二醛固定过夜，环氧树脂包埋，制成超薄切片，经醋酸铀和柠檬酸铅染色后透射电镜观察并拍片，阳性为存在自噬泡，阴性为未观察到自噬泡。

1.5.4  流式细胞仪检测活性氧水平  取各组小肠黏膜上皮细胞接种于96孔板，避光加入用无血清1640培养基配置好的DCFH-DA探针，孵育，行流式细胞仪检测。

1.5.5  Western blot检测自噬相关蛋白表达  各组小肠黏膜上皮细胞培养48 h，抽提总蛋白，参照试剂盒说明进行SDS-PAGE电泳，4 ℃转移过夜，TBS/T洗膜，分别加入一抗(LC3Ⅱ、LC3-Ⅰ、Beclin1单克隆抗体)4 ℃孵育过夜，再与HRP标记的二抗孵育4 h，加入ECL发光剂，采用灰度扫描系统测定软件分析目的蛋白条带。

1.6  统计学分析  使用SPSS 19.0进行数据的统计分析，计量资料以x(_)±s表示，组间差异应用单因素方差分析，多重比较应用修正的F 检验。

由于预处理方案导致炎症因子风暴介导的炎症反应和以及化疗后机体相对低下的免疫力是肠道急性移植物抗宿主病发生的关键原因。预处理的损伤及供体T细胞活化均可激活炎症因子瀑布级联样效应损伤组织，其中某些细菌产物(如脂多糖)和其他病原体分子的系统性易位，进一步促进宿主APC细胞活化并进入循环，刺激供者T细胞分泌大量细胞因子，导致细胞因子风暴，损伤小肠隐窝内的肠道干细胞、潘氏细胞，从而破坏肠道上皮细胞，并导致肠道菌群的异常^[10-11]。最近研究也证明了肠道固有淋巴细胞RORγt(+) ILC3亚群对于保护肠黏膜屏障、预防肠道急性移植物抗宿主病具有重要意义^[12]。

研究发现，抗凋亡蛋白(inhibitors of apoptosis proteins，IAP)缺陷鼠的LC3水平也降低，这提示移植物抗宿主病不仅存在凋亡活化，还同时伴有自噬的抑制^[13]。自噬依赖的Treg细胞对于移植后的免疫调节及重建至关重要，它能维持造血干细胞的植入状态并通过促进自噬功能的恢复以减轻移植物抗宿主病^[14-15]。自噬相关基因Atg16L1可以通过抑制T淋巴细胞的活化从而降低移植物抗宿主病的发生率^[16]；如果沉默miR-142-3p，通过增加ATG16L1的mRNA表达提高自噬水平，从而增加胸腺来源的Treg细胞的活性，也可以干预移植物抗宿主病的病程^[17]。有意思的是，如果抑制C3aR/C5aR复合物，诱导受者树突状细胞的线粒体自噬，将有可能在保证移植物抗白血病效应的基础上减轻移植物抗宿主病的相关症状^[18]。研究发现，在模拟高原反应的模型上，肠上皮细胞自噬水平升高、肠黏膜屏障破坏^[19]。通过干预KEAP1-NRF2信号通路，可以调控小肠黏膜上皮细胞的自噬，降低其氧化应激水平，从而保护肠黏膜屏障^[20]。

移植后的急性移植物抗宿主病患者肠道受累主要表现为顽固性腹泻，每日排便量可达1 000 mL以上，严重者出现肠绞痛、便血和肠梗阻，会影响植入并危及生命。该病中医病机为热邪内迫，令胃气不降、大小肠受承传导失司，出现呕吐、腹泻等症。根据《黄帝内经》病机十九条中“诸呕吐酸，暴注下迫，皆属于热”，结合《伤寒论》六经辨证，移植后患者急性移植物抗宿主病符合热邪内迫的情况，可以选用黄芩汤治疗。近年来，国外学者在黄芩汤基础上研发了PHY906药物，发现其能干预结肠癌Wnt信号通路，促进化疗后肠上皮细胞的增殖及恢复^[21]；降低肠道炎性因子如肿瘤坏死因子α水平，抑制环氧合酶2和诱导型一氧化氮合酶活性，发挥抗炎作用^[22]。近年研究发现，黄芩汤尤其能干预异常免疫对湿热型结肠炎疗效较好^[5，23]。移植后肠道急性移植物抗宿主病中医病因病机也属于湿热内迫，应用黄芩汤治疗符合中医传统理论。黄芩汤的君药黄芩，《神农本草经》谓可治“肠辟泄利”，性苦寒，可清肺胃胆及大肠经之湿热，黄芩苷是黄芩中提取的一种黄酮类化合物，具有抑菌、清除氧自由基的作用，减轻蛋白酶与炎性因子对组织的损害^[24]。黄芩苷可以通过抑制白细胞介素6水平，降低结肠组织凋亡相关蛋白的表达^[25]，还可以通过调节异常的STAT4、STAT6表达，抑制NF-κB活化，抑制IFN-γ等炎性因子的释放^[6，26-27]，并可以通过干预TLRs/MyD88通路^[28]，减轻肠道的异常免疫反应。已有文献证实了黄芩苷促进自噬的功能，例如黄芩苷可以活化自噬、抗凋亡，减轻创伤性脑损伤小鼠血脑屏障的损伤^[29]。

该实验结果表明，急性移植物抗宿主病小鼠小肠黏膜上皮组织活性氧水平升高，伴随低水平的自噬难以分解崩解坏死的细胞器等物质，从而造成肠黏膜屏障的破坏。应用黄芩苷通过降低活性氧水平，提高LC3-II/Ⅰ、Beclin1等自噬相关蛋白的表达，从而增加自噬泡的产生，促进细胞对异常物质的代谢、改善线粒体功能状态，减轻小肠黏膜上皮细胞的凋亡、脱落，阐明了黄芩苷改善肠黏膜屏障的可能机制，证明它可以作为一个治疗选择应用于肠道的急性排异。中药单体通过干预自噬调控肠道急性移植物抗宿主病的相关研究较少，该研究揭示了中药治疗该病的一个新的靶点，具有较大的临床意义，下一步将研究黄芩苷对该模型T淋巴细胞亚群的影响，以进一步揭示其通过干预免疫保护肠黏膜屏障的作用机制。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

文题释义：

移植物抗宿主病：是由于移植后异体供者移植物中的T淋巴细胞，经受者发动的一系列“细胞因子风暴”刺激，显著增强了其对受者抗原的免疫反应，以受者靶细胞为目标发动细胞毒攻击，其中皮肤、肝及肠道是主要的靶目标。根据移植物抗宿主病在移植后发生的时间，如在100 d内发生者称为急性移植物抗宿主病，在100 d后发生者称为慢性移植物抗宿主病。

黄芩苷：黄芩汤的君药黄芩，《神农本草经》谓可治“肠辟泄利”，性苦寒，可清肺胃胆及大肠经之湿热，黄芩苷是黄芩中提取的一种黄酮类化合物，具有抑菌、清除氧自由基等作用，减轻蛋白酶与炎性因子对组织的损害。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

已经有多项研究指出，黄芩汤可以调节Th17/Treg 的平衡减轻肠黏膜屏障损伤，这可能是其干预异常免疫治疗结肠炎的一个重要机制。黄芩汤中含有多种成分，其中黄芩苷能明显改善脑缺血损伤并促进自噬的发生，其机制可能与上调Beclin-1 蛋白的表达从而促进Ⅲ型 PI3K信号传导通路的激活有关。黄芩素处理PC12细胞后发现，其可降低p62表达，增加LC3-Ⅱ表达，诱导自噬。而黄芩素、黄芩苷、汉黄芩素和汉黄芩苷均对脑线粒体氧化损伤具有保护作用。甘草提取物能显著抑制鼠肝线粒体的氧化损伤，并能防止线粒体肿胀和ATP酶活力下降，降低蛋白质羰基化水平，并能有效清除线粒体产生的超氧阴离子自由基。芍药苷能够通过调控TLR4通路，抑制鼠肠道线粒体的氧化损伤。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程