模拟4 000 m高住及抗炎活血解痉中药干预力竭运动大鼠肾细胞超微结构变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.38.014

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (38): 6146-6152.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.38.014

• 组织构建基础实验 basic experiments in tissue construction • 上一篇下一篇

模拟4 000 m高住及抗炎活血解痉中药干预力竭运动大鼠肾细胞超微结构变化

林喜秀^1，2，赵用强¹，谢亚萍¹，邱继旺¹，罗自强²，瞿树林³

1湖南工业大学体育学院，湖南省株洲市 412000；2中南大学基础医学院博士后流动站，湖南省长沙市 410000；3湖南师范大学医学院，湖南省长沙市 410012

收稿日期:2014-07-07 出版日期:2014-09-10 发布日期:2014-09-10
通讯作者: 罗自强，教授，博士，中南大学基础医学院，湖南省长沙市 410000 并列通讯作者：瞿树林，教授，硕士，博士生导师，湖南师范大学医学院，湖南省长沙市 410012
作者简介:林喜秀，女，1973年生，湖南省人，苗族，1998年湖南师范大学医学院毕业，博士，讲师，主要从事低氧细胞生理研究工作。并列第一作者：赵用强，硕士，讲师。
基金资助:
中国博士后第53批面上项(2013M531794)；湖南工业大学湖湘体育文化研究基地资助(13HXTYWHO4)；湖南工业大学2013年校级教育教学改革研究项目(2013C43)；2012年湖南省博士后日常经费资助(2012，11)；2012中南大学博士后启动基金

A Chinese herb for anti-inflammation, blood circulation promotion and spasmolysis improves renal ultrastructure of rats undergoing 4-week exhaustive exercise at simulated altitude of 4 000 meters

Lin Xi-xiu^{1, 2}, Zhao Yong-qiang¹, Xie Ya-ping¹, Qiu Ji-wang¹, Luo Zi-qiang², Qu Shu-lin³

1Physical Education College of Hunan University of Technology, Zhuzhou 412000, Hunan Province, China; 2Postdoctoral Station, College of Basic Medicine, Central South University, Changsha 410000, Hunan Province, China; 3Medical College of Hunan Normal University, Changsha 410012, Hunan Province, China

Received:2014-07-07 Online:2014-09-10 Published:2014-09-10
Contact: Corresponding author: Luo Zi-qiang, M.D., Professor, Postdoctoral Station, College of Basic Medicine, Central South University, Changsha 410000, Hunan Province, China Corresponding author: Qu Shu-lin, Master, Professor, Doctoral supervisor, Medical College of Hunan Normal University, Changsha 410012, Hunan Province, China
About author:Lin Xi-xiu, M.D., Lecturer, Physical Education College of Hunan University of Technology, Zhuzhou 412000, Hunan Province, China; Postdoctoral Station, College of Basic Medicine, Central South University, Changsha 410000, Hunan Province, China Zhao Yong-qing, Master, Lecturer, Physical Education College of Hunan University of Technology, Zhuzhou 412000, Hunan Province, China Lin Xi-xiu and Zhao Yong-qiang contributed equally to this work.
Supported by:
the China Postdoctoral Program (the 53rd batch), No. 2013M531794; the grant from the Huxiang Sports Culture Research Base of Hunan University of Technology, No. 13HXTYWHO4; the Education and Teaching Reform Project of Hunan University of Technology in 2013, No. 2013C43; the Postdoctoral Daily Fund of Hunan Province, No. 2012, 11; the Postdoctoral Startup Fund of Central South University in 2012

摘要/Abstract

摘要：

背景：抗炎活血解痉中药具有修复肾脏组织，改善肾脏血液供应，降低肾小球毛细血管的通透性，增强肾小管的滤过功能的作用。
目的：探讨模拟4 000 m高住及抗炎活血解痉中药对4周力竭运动大鼠肾细胞超微结构及α-平滑肌肌动蛋白表达的影响。
方法：将大鼠在速度为10 m/min坡度为0的跑台上进行适应性跑15 min，筛选出32只能完成跑的大鼠，随机分为正常对照组、力竭运动组、高住力竭运动组和给药力竭运动组，每组8只。正常对照组不进行运动，其他3组均进行力竭运动。高住力竭运动组模拟4 000 m高住后再进行力竭运动；给药力竭运动组先给予抗炎活血解痉中药灌胃，再进行4周力竭运动。采用苏木精-伊红染色、透射电子显微镜观察各组大鼠肾细胞的超微结构，免疫组织化学法检测肾组织α-平滑肌肌动蛋白的表达。
结果与结论：力竭运动组可出现慢性肾损伤，肾小球滤过膜3层超微结构破坏，肾小管间质大量纤维化改变。与力竭运动组相比，高住力竭运动组和给药力竭运动组大鼠的运动量(跑距)增强(P < 0.05)，肾超微结构的损伤有明显的改善，α-平滑肌肌动蛋白的表达显著下降(P < 0.01)。结果证实，抗炎活血解痉中药灌胃与模拟 4 000 m高住干预对4周力竭运动诱导的肾超微结构损伤起保护作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

全文链接：

关键词: 组织构建, 组织工程, 力竭运动, 抗炎活血解痉中药, 模拟4 000 m高住, α-平滑肌肌动蛋白, 肾滤过屏障, 肾间质纤维化, 干预, 肾功能

Abstract:

BACKGROUND: Chinese herb for anti-inflammation, blood circulation promotion and spasmolysis can repair the kidney, supply renal blood, reduce the permeability of the glomerular capillaries, and enhance renal filtration function.
OBJECTIVE: To explore the effects of a Chinese herb for anti-inflammation, blood circulation promotion and spasmolysis on ultrastructure of renal cells and a-smooth muscle actin in rats after 4-week exhaustive exercise living at simulated altitude of 4 000 meters.
METHODS: Thirty-two rats which could complete 15-minute adaptive run on the treadmill at a speed of 10 m/min were enrolled and randomized into normal control group, exhaustive exercise group, exhaustive exercise+high-altitude group and exhaustive exercise+Chinese herb group, eight rats in each group. Except the normal control group, rats in the other three groups were subjected to exhaustive exercise, living at simulated altitude of 4 000 meters followed by exhaustive exercise, and intragastric administration of Chinese herb followed by 4-week exhaustive exercise, respectively. The ultrastructure of renal cells in rats was observed by hematoxylin eosin staining and transmission electron microscope, and expression of a-smooth muscle actin detected by immunohistochemical method.
RESULTS AND CONCLUSION: In the exhaustive exercise group, rats appeared to have chronic renal injury, the ultrastructure of glomerular filtration membrane was damaged and tubulointerstitial fibrosis occurred. As compared with the exhaustive exercise group, the movement distance of rats in the exhaustive exercise+high-altitude group and exhaustive exercise+Chinese herb group was extended (P < 0.05), and the damaged ultrastructure of the kidney was more obviously improved; in addition, the expression of a-smooth muscle actin was significantly decreased (P < 0.01). Results show that the Chinese herb for anti-inflammation, blood circulation promotion and spasmolysis combined with living at simulated altitude of 4 000 meters can protect against renal ultrastructure damage in rats following 4-week exhaustive exercise.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

全文链接：

Key words: tissue engineering, osteoblasts, proliferation, alkaline phosphatase

中图分类号:

R318

林喜秀，赵用强，谢亚萍，邱继旺，罗自强，瞿树林. 模拟4 000 m高住及抗炎活血解痉中药干预力竭运动大鼠肾细胞超微结构变化[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(38): 6146-6152.

Lin Xi-xiu, Zhao Yong-qiang, Xie Ya-ping, Qiu Ji-wang, Luo Zi-qiang, Qu Shu-lin. A Chinese herb for anti-inflammation, blood circulation promotion and spasmolysis improves renal ultrastructure of rats undergoing 4-week exhaustive exercise at simulated altitude of 4 000 meters[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(38): 6146-6152.

图/表（结果） 3

2.1 实验动物数量分析大鼠32只全部进入结果分析，无脱落。

2.2 力竭运动各组大鼠一般情况各组大鼠运动前形态

正常，活泼好动，眼睛有神，皮毛光亮。力竭运动组大鼠精神萎靡，眼睛黯淡无光，呼吸急促，站立不稳，胸腹着地，对声光刺激反应淡漠，严重者出现球结膜出血，随着反复力竭运动，以上症状越来越明显，跑距越来越短，力竭恢复期饮食明显减少，体质量明显减轻，力竭恢复期到能自由活动的时间越来越长。高住力竭运动组及给药力竭运动组大鼠运动后饮食、精神状态较反复力竭运动组好，四肢可支撑身体，对声光刺激有反应，力竭恢复期基本正常进食。

2.3 力竭运动大鼠运动跑距的影响力竭运动组大鼠力竭运动前2周跑距增加，后2周呈明显下降趋势。各组大鼠第2周大鼠跑距均显著大于第1，3，4周(P < 0.05)。与力竭运动组相比，高住力竭运动组及给药力竭运动组第3，4周跑距显著增加(P < 0.05)。见表1。

2.4 抗炎活血解痉中药与模拟4 000 m高住干预对4周力竭运动大鼠肾组织病理改变的影响(图1) 苏木精-伊红染色显示，正常对照组大鼠肾小球细胞外基质与系膜细胞分布正常，毛细血管腔开放良好；肾小管、小管-间质区结构清楚，肾小管上皮细胞呈方形，大小一致，排列整齐，间质未见纤维组织增生。力竭运动组肾小球明显淤血、肿胀、肾小囊腔变窄，肾小管上皮细胞崩解、变性、脱落，管腔扩张，可见蛋白管型和红细胞管型，同时可见管壁剥离和断裂，近曲肾小管间质组织纤维化明显；近曲小管、远曲小管、肾小球可见大量染色质浓缩，边集，印染的凋亡细胞。高住力竭运动组及给药力竭运动组织病理学改变比力竭运动组轻，肾小球基底膜较完整，淤血明显减轻，肾小管上皮细胞变性轻，管腔扩张以及管腔中的脱落绒毛和上皮细胞少，偶见蛋白管

型和细胞管型，罕见管壁剥离和断裂，凋亡细胞明显减少。

2.5 抗炎活血解痉中药与模拟4 000 m高住干预对4周力竭运动大鼠肾细胞超微结构的影响(图2) 正常对照组内皮细胞分布清晰可见，基膜厚度及电子密度均匀，肾足细胞突起分布均匀，肾小管襄腔清晰可见，细胞核形态完整，细胞膜边界清晰，染色质均匀的分布。

力竭运动组可见肾小球内皮细胞的变化：内皮细胞肿胀、成对，胞质连拱状，内皮细胞与基膜剥、离融合等，其中肾小球内皮细胞变化最为突出；基膜结构的改变包括：基膜扭曲、塌陷、3层结构消失驼峰样等变化；肾小球足细胞的变化包括肾小球外周袢足细胞胞体脱落，可见足细胞足突

融合、足细胞出现变异并有分布减少；肾小管襄腔结构模糊或肾小管囊腔明显增宽，形态不规则等改变；细胞核形态不完整，有细胞核呈分叶状的典型细胞凋亡样改变，染色质浓缩、不均匀分布、大量分布于核膜下等改变;肾小管间质大量纤维化改变，致使滤过膜3层结构改变，模糊不清；与力竭运动组相比，高住力竭运动组及抗给药力竭运动组肾组织细胞超微结构有明显改善，内皮细胞与肾足细胞突起分布较均匀，基膜厚度较均匀，边界清晰，但肾细胞核边界存在模糊现象，偶见有细胞核的分叶改变，可见线粒体脊较清晰，但有部分空泡化，微绒毛稀少或消失，未见明显肾间质纤维化改变。

2.6 抗炎活血解痉中药与模拟4 000 m高住干预对4周力竭运动大鼠肾组织α-平滑肌肌动蛋白表的影响免疫组织化学染色显示，正常对照组，近曲肾小管、远曲小管上皮细胞质细胞膜及核膜偶可见α-平滑肌肌动蛋白免疫阳性物质。力竭运动组，近曲肾小管上皮、肾小球内皮细胞α-平滑肌肌动蛋白阳染物质明显增加，呈深黄色。与力竭运动组比较，高住力竭运动组和给药力竭运动组近曲肾小管上皮、肾小球内皮细胞阳染物质减弱，有少许呈淡黄色。见图3。与正常对照组比较，力竭运动组的α-平滑肌肌动蛋白蛋白表达显著增加(P < 0.01)；与力竭运动组相比，高住力竭运动组及给药力竭运动组的α-平滑肌肌动蛋白表达显著下降(P < 0.01)。见表2。

参考文献

[1] 林喜秀,瞿树林,周桔,等.低氧训练对大鼠心、肝、肾、海马组织细胞凋亡的影响及其机制研究[J].中国运动医学杂志,2012,(2): 47-57.
[2] 林喜秀,周桔,罗自强,等.低氧训练与低氧大鼠心肌细胞凋亡及凋亡因子的表达[J].中国组织工程研究杂志,2013,17(11): 1951- 1958.
[3] 林喜秀,瞿树林.低氧、运动对肾脏组织细胞凋亡及凋亡相关因子HIF-1a、Bax、Bcl-2表达的影响[J].中国运动医学杂志, 2008, 9(27):571-574.
[4] 林喜秀.低氧训练对大鼠肾组织细胞凋亡相关因子的影响[D].长沙:湖南师范大学,2008.
[5] 林喜秀.力竭运动致大鼠慢性肾损伤机制及促红细胞生成素干预研究[D].长沙:湖南师范大学,2011.
[6] Lin X, Qu S, Hu M, et al. Protective effect of Erythropoietin on renal injury induced by acute exhaustive exercise in the rat. Int J Sports Med. 2010;31(12):847-853.
[7] Lin X, Jiang C, Luo Z, et al. Protective effect of Erythropoietin on renal injuryinduced in rats by four weeks of exhaustiveexercise. BMC Nephrology. 2013;14:130.
[8] Dussaule JC, Chatziantoniou C. Reversal of renal disease: is it enough to inhibit the action of angiotensinⅡ. Cell Death Differ. 2007;14(7):1343-1349.
[9] Hayashi K, Sasamura H, Ishiguro K, et al. Regression of glomerulosclerosis in response to transient treatment with angiotensinIIblockers is attenuated by blockade of matrix metallo proteinase. Kidney Int. 2012;78(1):69-78.
[10] Srisawat N, Hoste EE, Kellum JA. Modern ciassification of arute kidney injury Blood Purif. 2013;29(3):300-307.
[11] 姚丽,孙立,杨爽.雷公藤多苷治疗慢性肾小球肾炎蛋白尿的疗效观察[J].中国中西医结合肾病杂志,2011,6(12)6,538-539.
[12] 张书征,杨巧红,苏俊芳,等. 糖肾安对糖尿病肾病大鼠的保护作用及对肾脏ICAM-1的影响[J].畅新中医,2011,8(43):142-144.
[13] The Ministry of Science and Technology of the People’s Republic of China. Guidance Suggestions for the Care and Use of Laboratory Animals. 2006-09-30.
[14] 郑澜.低氧运动促进肌组织血管生成的机制[M].北京:北京体育大学出版社,2005.
[15] 李秋霞,熊正英,张全江.褪黒激素对耐力训练小鼠一次力竭运动后肝肾细胞超微结构的影响[J].中国运动医学杂志, 2004,23(4): 404.
[16] 吴广礼.力竭运动致急性肾损伤的分子机制及解痉抗炎抗氧化中药的防治作用[D].石家庄:河北医科大学,2007.
[17] Hostetter TH, Troy JL, Brenner BM. Glomerular hemodynamics in experimental diabetes. Kidney Int. 1981;19: 419-421.
[18] Bjorn SF, Bangstad HJ, Hanssen KF, et al. Glomerular epithelialfoot processes and filtratino slits in IDDM patients. Diabetologia. 1995;38(10):1197-1204.
[19] Blum S, Nakhoul F, Khankin E, et al. Renal slit diaphragm-the open zipper and the failing heart. Isr Med Assoc J. 2007;9(2): 107-111.
[20] 钱莺,傅旭春,白海波,等.车前草醇提液降大鼠血尿酸作用的研究[J].中国现代应用药学,2011,28(5):406-408.
[21] 赵良斌.虫类药治疗慢性肾小球肾炎蛋白尿的临床疗效观察[D].成都:成都中医药大学,2010.
[22] Vesey DA ,Cheung C, Pat B, et al. Erythropoietin protects against ischaemic acute renal injury. Nephrol Dial Transplant. 2004;19(2):348-355.
[23] De Borst MH, Van Timmeren MM, Vaidya VS, et al. Induction of kidney injury molecule-1 in homozygous Ren2 rats is atteuated by blockade of the renin- angiotensin system or p38 MAP kinase. Am J Physiol Renal Physiol. 2007;292(1): F313-F320.

引言

长期的大强度运动或运动的总负荷超过了人体所能承受的限度后，运动刺激或低氧刺激就由量变产生了质变，从生理性刺激物变成了病理性刺激，最终可能导致人体结构、功能产生病理改变。过度运动可致急、慢性肾损伤^[1-7]，肾损伤是严重危害健康的泌尿系统疾病，是各种肾脏疾病发展至终末期肾病的必由途径。全世界有超过5亿人患有不同程度的慢性肾病，每年超过百万人死于该病及并发症，资料表明，肾损伤的发病率仍然在增加，每年达到7%以上^[8]。由于对肾损伤的发病机制尚未阐明^[9]，临床上各种抗肾损伤的疗效不佳，亦不能有效地改善其不良预后^[10]。现代西医利用肾损伤的动物模型进行实验研究的些许进展^[11]，主要集中在对抗急性肾损伤机制的研究，对慢性肾损伤调控即抗慢性肾损伤机制的研究甚少，同时，不同机制和因素之间相互联系形成复杂的网络系统共同作用于慢性肾损伤、肾纤维化。因此，加强对中药作用机制的研究，寻找一条中医治疗的突破性的防治新路迫在需要。

在慢性肾损伤的过程中，普遍存在低氧状态，肾间质病变过程中的水肿、炎症、纤维化可增加血氧弥散的距离，而随着纤维化进展，球后微血管网会不断受损和减少，使局部的血流量进一步降低，另外低氧能致使肾小球后毛细血管内皮细胞的损伤，组织因子的暴露，从而激活外源性凝血途径，进而加剧血供障碍；肾纤维化是急、慢性肾病发展的终末期改变，有研究证明，肾间质纤维化的实质可能为肾脏微血管的一种炎症反应^[12]，减轻肾间质微血管的炎症状态能明显抑制肾病的进展。可知，局部缺血低氧和微炎症状态的发生是肾病发展到终末期最为重要的影响因素。目前尚缺乏针对以上病理改变的现代药物，而对抗炎活血解痉中药及模拟4 000 m高住对4周力竭运动致慢性肾损伤的研究，有利于深入阐明慢性肾损伤、肾纤维化的发病机制并为临床提供新的治疗思路或策略。实验不仅是目前慢性肾损伤研究的热点，亦是慢性肾损伤防治研究的迫切需要或理论基础。

实验通过模拟4 000 m高住及“益肾抗炎活血解痉”中药对4周力竭运动大鼠肾细胞超微结构及α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)影响的研究，为探讨过度运动、竞技训练提供理论依据，同时为传统中药对慢性肾病的防治的开发和推广起促进作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

全文链接：

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2011年1月至2014年4月在湖南师范大学医学院应用生理学实验室、中南大学基础实验室、湖南省肿瘤医院基础实验室及及湖南中医药大学、湖南工业大学体育学院基础实验室完成。

材料：

实验动物：健康8周龄雄性SD大鼠32只，购自湖南农业大学动物研究所。动物许可证号：SCXK(湘)2003-0003。体质量180-220 g，分笼饲养，每笼8只，自由饮食，室温23-25 ℃，湿度40%-60%，自然光照，自由饮食。饲养室、用具等定期消毒灭菌。实验过程中对动物的处理方法符合中华人民共和国科学技术部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》^[13]。

药物：抗炎活血解痉中药方：由鱼腥草25 g、益母草25 g、蒲公英25 g、白茅根25 g、冬瓜皮10 g、车前草15 g、空心草10 g、竹叶青15 g、斑鸠窝10 g组成，由湖南中医药大学第一附属医院药剂科提供。先将药材用相当于药材5倍的自来水浸泡2 h，煮沸后再微火煎煮30 min，过滤后收集煎液，原药渣加少量水煎煮，得二煎液。两煎液混合，于水浴恒温器上浓缩至浓度为每毫升药液含生药 1 g。

模拟4 000 m高住及“益肾抗炎活血解痉”中药对4周力竭运动大鼠肾细胞超微结构及α-平滑肌肌动蛋白的影响实验相关主要试剂和仪器：
试剂及仪器	来源
速眠新Ⅱ	军事医学科学院、军事兽医研究所
α-平滑肌肌动蛋白测试剂盒	北京华美生物工程公司
BX52显微照相图像采集系统	日本奥林巴斯公司
AG325R型切片机	美国AO公司
JEM1230透射电子显微镜	日本电子公司

方法：

力竭运动大鼠模型的建立及运动方案：所有大鼠先进行1周适应性训练(每日以15 m/min跑15-20 min)，后筛选出32只雄性大鼠，按体质量随机分为4组，正常对照组、力竭运动组、高住力竭运动组(模拟4 000 m高住+力竭运动组)以及给药力竭运动组(抗炎活血解痉中药+力竭运动组)，每组8只。实验在Ai-jun运动方案基础上进行改进^[5]，建立4周反复力竭运动的过度训练动物模型，力竭运动组、高住力竭运动组以及给药力竭运动组进行4周力竭运动，每日以30 m/min(坡度为10°)直至大鼠力竭，每周6 d，1次/d，共4周，均在下午2:00-6:00训练(力竭状态：连续予大鼠施加声、光、机械刺激后，大鼠不能继续跑动，下跑台后伏地喘息，暂时无逃避反应)。给药力竭运动组于力竭运动第1天开始晨间给予抗炎活血解痉中药灌胃给药，按照实验动物学中人与大鼠用药换算公式，抗炎活血解痉中药采用 10 mL/(kg·d)，2次/d，每日晨间8:00和下午18:00经灌胃给药，力竭运动后第1天开始至4周大鼠处死当天结束。模拟4 000 m高住组大鼠，每日早上8:00至下午2:00放置低氧帐篷6 h，之后进行力竭运动，至4周结束。正常对照组不运动，正常饲养。

取材：力竭运动组、高住力竭运动组及给药力竭运动组均在最后力竭运动实验后恢复24 h取材，安静组均在运动组前1 d取材。按3 mL/kg剂量腹腔注射体积分数10%水合三氯乙醛溶液麻醉大鼠，麻醉理想后心脏取血致死，取肾组织进行光镜、电镜标本的制备：迅速取出肾脏，取皮髓质交界的肾组织，10 g/L多聚甲醛固定，制备肾组织石蜡切片，苏木精-伊红染色待测；尽快将皮髓质交界的肾组织分切成< 1 mm³的小块，放于滴有戊二醛固定液的载玻片上，在4 ℃ 20 g/L多聚甲醛和体积分数2.5%的戊二醛中固定2 h。然后用二甲砷酸钠缓冲液(pH 7.2)充分冲洗组织3次，每次10 min，吸干水分后加入体积分数1%饿酸，4 ℃下固定2 h；然后再冲洗3遍，每次10 min，加入0.1 mol/L二甲胂酸钠缓冲液，4 ℃保存，电镜待测。余分离肾皮质液氮速冻后-70 ℃保存，备作相关检查。正常对照组做相同处理。

苏木精-伊红染色：运用酸性物质对于碱性染料较易吸附，且吸附作用稳固，碱性物质对酸性染料较易于吸附的原理染色。切片经二甲苯浸泡，5 min×3次，进行脱蜡；体积分数100%、95%、85%、70%乙醇梯度脱水；蒸馏水冲洗；放入苏木精染液染色15 min；自来水冲洗后，将切片放入体积分数1%盐酸乙醇液中分色，见切片变粉红即可；将切片再次放入自来水流水中冲洗 15-30 min，使其恢复蓝色；用体积分数0.5%伊红染液染色1 min；再依次经体积分数70%，85%，95%，100%乙醇脱水，各级为2 min；再经二甲苯浸泡，5 min×2次，进行透明；中性树胶封固，用Olympus BX52显微摄像系统进行拍照(40×10倍)。

透射电镜观察：梯度脱水：在4 ℃下进行，分别为体积分数50%乙醇10 min；体积分数70%乙醇(饱和铀)过夜；体积分数90%乙醇10 min；体积分数100%乙醇2次各 15 min。置换：环氧丙烷，2次，各15 min；环氧丙烷：树脂为1∶1，1 h室温；环氧丙烷∶树脂为1∶4，1 h室温；纯树脂浸透2 h室温；环氧树脂Epon812包埋；聚合：35 ℃恒温箱中聚合16 h；45 ℃恒温箱中聚合8 h；55 ℃恒温箱中聚合14 h；60 ℃恒温箱中聚合48 h；修整包埋块；1 μm半薄切片：天青-青兰染色光学显微镜定位；超薄切片：醋酸双氧铀/枸橼酸铅染色Philips EM208s透射电镜观察、拍片。

免疫组织化学染色：α-平滑肌肌动蛋白蛋白免疫组织化学检测试剂盒，由北京中杉金桥生物工程有限公司提供，Santa Cruz Biotechnology LNC公司产品。肾组织石蜡切片常规脱蜡水化；抗原修复DAB显色；复染；梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封固、镜检。在光学显微镜(×400)下每张切片随机观察6个视野(向同一方向移动切片，不重复，不重叠)，以Simple PCI图像分析软件测试阳性产物的表达采用一定面积中吸光度值与阳性面积值的乘积做为阳性指数(positive index，PI)，即阳性指数=阳性强度吸光度值×阳性反应面积/测量面积^[14]。

主要观察指标：各组肾组织的超微结构及α-平滑肌肌动蛋白蛋白的表达。

统计学分析：计量资料用x(_)±s表示。所有数据均用SPSS 11.5统计学软件进行处理。多组间均数差异的比较采用单因素方差分析、LSD法和SNK法，检验水准α=0.05。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

全文链接：

讨论

肾滤过屏障结构的完整对人体内环境稳定及正常生理功能具有重要意义。实验结果显示，正常对照组光镜可见，大鼠肾小球细胞外基质与系膜细胞分布正常，毛细血管腔开放良好；肾小管、小管-间质区结构清楚，肾小管上皮细胞呈方形，大小一致，排列整齐；间质未见纤维组织增生；同时，正常对照组相应超微结构正常，内皮细胞分布清晰可见，基膜厚度及电子密度均匀，肾足细胞突起分布均匀，肾小管襄腔清晰可见，细胞核形态完整，细胞膜边界清晰，染色质均匀的分布，未见肾间质纤维化改变。4周力竭运动

组光学显微镜检测可见：肾小球肾小囊腔变窄，肾小管上皮细胞崩解、变性、脱落，管腔扩张，肾小管间质组织纤维化改变；近曲小管、远曲小管、肾小球可见大量染色质浓缩，边集，印染的凋亡细胞等病理性改变；相应该组肾组织超微结构出现明显变异，肾小球滤过膜内皮细胞肿胀、成对，胞质连拱状，内皮细胞与基膜剥、离融合等；基膜扭曲、塌陷、驼峰样变化；肾小球足细胞足突融合或分布减少；肾小管襄腔结构模糊或襄腔明显增宽，形态不规则；细胞核形态不完整，染色质浓缩、不均匀分布、大量分布于核膜下、细胞核呈分叶状的典型细胞凋亡样改变；肾小管间质大量纤维化改变，致使滤过膜3层模糊不清，其结构改变。说明每日以30 m/min(坡度为10°)4周反复力竭运动大强度运动跑台跑，可致大鼠肾滤过屏障超微结构的病理改变。相关研究表明，急性力竭运动可致肾小球滤过膜部分内皮肿胀，基膜亚层模糊，可见上皮足突融合，近曲小管上皮微绒毛结构不清，有融合黏连，线粒体肿胀，空泡化，嵴减少，核染色质浓缩，电子密度增高，部分形成半月状的凋亡细胞^[15-16]。

实验大鼠经过4周力竭运动，肾超微结构出现典型病理改变，肾小球滤过屏障滤过膜3层模糊不清，肾间质明显纤维化改变，细胞核分叶、染色质浓缩的细胞凋亡改变等。肾小球内皮细胞是肾小球滤过屏障的第1层，与血循环直接接触，它不仅受人体血液成分变化的影响，还直接受肾小球内高灌注、高滤过和高压力等作用的直接损害^[17]。

肾小球内皮细胞受损后使其合成带负电荷的糖蛋白能力下降是致使微量白蛋白尿的重要原因。本实验观察内皮细胞结构变化如内皮细胞与基膜剥离、内皮下疏松、区域增宽等，内皮细胞这些结构的变化，可能破坏了肾小球内皮细胞带负电荷的糖蛋白屏障，改变了内皮细胞的通透性，从而造成微量白蛋白尿甚至大量蛋白尿的肾功能改变。肾小球基膜是滤过屏障的第2层。在许多病理状态下可引起基底膜发生形态学改变，形态学变化主要有以下几类：①基底膜的变薄或变细，可同时伴有或不伴有基底膜完整性的破坏。②基底膜的增厚。③基底膜的“双层化”，“裂开”或“网化”。④基底膜致密沉积物，常为沉积的免疫复合物，主要包括上皮下、基底膜内、内皮下和系膜内几种类型。⑤基底膜内有形成分的出现。实验中除后3种情况较为少见外，其他各种类型的基底膜改变都比较明显。肾小球足细胞是滤过屏障的最后一部分。

众多研究已证实，肾小球裂孔膜是大分子蛋白的主要滤过屏障^[18]。由于肾小球足细胞足突宽度增加致使单位长度肾小球基膜上裂隙孔数目减少，并导致裂孔膜形状改变，从而影响了机械屏障的完整性是形成蛋白尿的重要原因之一^[19]。实验发现，4周力竭运动，肾小球足细胞足突融合或分布减少，可影响肾小球滤过功能的改变的原因之一。

肾急、慢性损伤其形成有多个因素、多个途径、多个方面所介导的动态发展过程，其机制主要与活性氧的作用，细胞内钙超载，炎症细胞、各种细胞因子、黏附分子共同作用引发的炎症级联反应，细胞凋亡，一氧化氮、内皮素等密切相关^[1^，^5-8]。实验模拟4 000 m高住+力竭运动及抗炎活血解痉中药+力竭运动两组大鼠，较4周力竭运动组肾滤过屏障超微结构的病理改变有明显改善，内皮细胞与肾足细胞突起分布较均匀，基膜边界清晰，但肾细胞核边界存在模糊现象，偶见有细胞核的分叶改变，线粒体脊较清晰，但有部分空泡化，微绒毛稀少或消失，可见少许肾间质纤维化改变。结构改变必然影响其功能，与力竭运动组相比，模拟力竭运动组及给药力竭运动组大鼠可明显增加大鼠的跑距，即运动能力明显提高。

抗炎活血解痉中药中白茅根清热解毒，利湿利尿，散瘀解毒、凉血止血；无心草能止尿血；利尿通淋；蒲公英、鱼腥草清热解毒、利湿通淋；益母草活血利水，清热解毒；车前草具有清热利尿、祛痰、凉血、解毒等功效，用于水肿尿少，热淋涩痛，暑湿泻痢，痰热咳嗽，痛肿疮毒等诸症；冬瓜皮利水化湿、清热利湿解毒的功能；海金沙草(斑鸠窝)能清热解毒，利尿除湿，治肾性水肿、尿血等；竹叶青草，有清热利湿，行血，消肿毒等功效^[20]。现代药理研究表明：白茅根、鱼腥草、蒲公英不但有抗菌、抗病毒作用，也可以通过激发非特异性的免疫功能，抑制炎症反应，从而改善组织损伤；益母草能改善微循环，增加血流量，降低血小板的表面活性，抑制血小板聚集，促进纤维蛋白溶解的作用；诸药合用，可达到修复肾脏，改善肾脏血液供应，降低肾小球毛细血管的通透性，增强肾小管的滤过功能^[21]。模拟4 000 m高住，出现低氧，启动机体内源性活性保护因子^[4]，其中保护性因子促红细胞生成素开始分泌增加。近年来，人们发现促红细胞生成素具有造血系统以外的重要生物学功能。在心脑缺血性病变、视网膜损伤及肾急、慢性损伤的研究中发现，促红细胞生成素通过抑制抗炎、抗凋亡对损伤组织起到保护作用^[6-7^，^21]。

α-平滑肌肌动蛋白是平滑肌和肌成纤维细胞的标志蛋白，肌动蛋白的重组和α-平滑肌肌动蛋白的表达不仅标志着上皮细胞形态学上的转化，同时也使其具有迁移、浸润和收缩的功能，同样，肌动蛋白细胞骨架，胞质微丝也由上皮细胞型的角蛋白向间充质细胞的波形蛋白转化。已转型的上皮细胞必将进入间质中发挥作用，已观察到转型细胞具有很强的活动能力，能通过破损的肾小管基底膜进入间质中，转型细胞在迁移过程中也破坏肾小管基底膜。相关研究说明，肾间质纤维化指标α-平滑肌肌动蛋白和Ⅲ型胶原水平以及间质纤维化程度相关^[23]。实验结果发现，力竭运动组近曲肾小管上皮、肾小球内皮细胞α-平滑肌肌动蛋白阳染物质明显增加，呈深黄色，而高住力竭运动组和给药力竭运动组与比力竭运动组比较，近曲肾小管上皮、肾小球内皮细胞阳染物质减弱，有少许呈淡黄色。

实验结果提示：高住力竭运动组和给药力竭运动组大鼠光、电镜偶可见凋亡细胞核，未见肾间质纤维化明显改变，α-平滑肌肌动蛋白阳染物质与力竭运动组相比显著减低，从而保护了肾功能，大鼠运动能力提高，由此可知，抗炎活血解痉中药、模拟4 000 m高住对4周力竭运动诱导的肾超微结构的病理改变起保护作用，可能抗炎活血解痉中药及模拟4 000 m高住启动了肾损伤的内源性保护，考虑与抗炎、抑制细胞凋亡及抗α-平滑肌肌动蛋白蛋白表达，从而改善肾结构、功能、抑制肾间质纤维化有关。

总之，4周力竭运动引起肾损伤，可致肾小球滤过膜3层超微结构破坏，肾小管间质大量纤维化改变，因此医务监督和伤病预防应是过度运动首先要重视的问题。抗炎活血解痉中药、模拟4 000 m高住对4周力竭运动诱导的肾超微结构破坏起保护作用，可能抗炎活血解痉中药及模拟 4 000 m高住启动了肾损伤的内源性保护，考虑与抗炎、抑制细胞凋亡及抗α-平滑肌肌动蛋白蛋白表达从而抑制肾间质纤维化有关。因此，模拟4 000 m高住、抗炎活血解痉中药有利于肾滤过屏障及肾小管的正常结构及其功能的保护与恢复，对维持人体内环境的稳定起到良好作用，但其确切的分子作用机制及靶位点有待进一步研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

全文链接：

模拟4 000 m高住及抗炎活血解痉中药干预力竭运动大鼠肾细胞超微结构变化

A Chinese herb for anti-inflammation, blood circulation promotion and spasmolysis improves renal ultrastructure of rats undergoing 4-week exhaustive exercise at simulated altitude of 4 000 meters

PDF

可视化

被引次数

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 3

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	张同同, 王中华, 文杰, 宋玉鑫, 刘林. 3D打印模型在颈椎肿瘤手术切除与重建中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1335-1339.
[2]	曾祯, 胡经纬, 李璇, 唐琳梅, 黄志强, 李明星. 超声造影定量分析重度失血性休克再灌注模型大鼠复苏期的肾血流灌注[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1201-1206.
[3]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.
[4]	徐东紫, 张婷, 欧阳昭连. 心脏组织工程领域全球专利竞争态势分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 807-812.
[5]	吴子健, 胡昭端, 谢有琼, 王峰, 李佳, 李柏村, 蔡国伟, 彭锐. 3D打印技术与骨组织工程研究文献计量及研究热点可视化分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 564-569.
[6]	常文辽, 赵杰, 孙晓亮, 王锟, 吴国锋, 周剑, 李树祥, 孙晗. 人工骨膜的材料选择、理论设计及生物仿生功能[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 600-606.
[7]	刘旒, 周箐竹, 龚桌, 刘博言, 杨斌, 赵娴. 胶原/无机材料构建组织工程骨的特点及制造技术[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 607-613.
[8]	刘飞, 崔宇韬, 刘贺. 局部抗生素递送系统治疗骨髓炎的优势与问题[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 614-620.
[9]	李晓壮, 段浩, 王伟舟, 唐志宏, 王旸昊, 何飞. 骨组织工程材料治疗骨缺损疾病在体内实验中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 626-631.
[10]	张振坤, 李喆, 李亚, 王莹莹, 王亚苹, 周馨魁, 马珊珊, 关方霞. 海藻酸盐基水凝胶/敷料在创面愈合中的应用：持续、动态与顺序释放[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 638-643.
[11]	陈佳娜, 邱燕玲, 聂敏海, 刘旭倩. 组织工程支架材料修复口腔颌面部软组织缺损[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 644-650.
[12]	邢浩, 张永红, 王栋. 长骨大段骨缺损修复方法的优势与不足[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(3): 426-430.
[13]	张亮, 马晓燕, 王佳虹. 肾衰饮调控慢性肾功能衰竭大鼠肾脏细胞凋亡的机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3672-3677.
[14]	王皓, 陈明学, 李俊康, 罗旭江, 彭礼庆, 李获, 黄波, 田广招, 刘舒云, 眭翔, 黄靖香, 郭全义, 鲁晓波. 脱细胞猪皮基质构建组织工程半月板支架[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3473-3478.
[15]	莫剑玲, 何少茹, 冯博文, 简敏桥, 张晓晖, 刘财盛, 梁一晶, 刘玉梅, 陈亮, 周海榆, 刘艳辉. 构建预血管化细胞膜片及血管形成相关因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3479-3486.