构建运动预适应力竭运动损伤模型大鼠心脏JAK2的表达变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.20.019

摘要/Abstract

摘要：

背景：研究表明JAK2激酶在缺血预适应和药物预适应的心肌保护机制中发挥重要作用。
目的：观察运动预适应模型大鼠心脏JAK2 mRNA和蛋白表达的影响及其对心脏保护的作用机制。
方法：将SD大鼠随机分为对照组、力竭组、运动预适应组、运动预适应+AG490组。对照组和力竭组大鼠常规饲养3 d；运动预适应组和运动预适应+AG490组大鼠进行连续3 d的间歇跑台运动建立运动预适应动物模型，后一组在运动预适应前10 min腹腔注射JAK2抑制剂AG490。3 d后，力竭组、运动预适应组和运动预适应+AG490组进行一次性力竭跑台运动。观察血清乳酸脱氢酶和肌酸激酶同工酶的活性，用实时荧光定量PCR和免疫组织化学方法检测心脏JAK2 mRNA和蛋白的表达。
结果与结论：与对照组相比，力竭组血清乳酸脱氢酶和肌酸激酶同工酶活性增加，心脏JAK2 mRNA和蛋白的表达升高(P < 0.05)；与力竭组相比，运动预适应组血清乳酸脱氢酶和肌酸激酶同工酶活性降低(P < 0.05)，心脏JAK2 mRNA和蛋白表达升高(P < 0.05)；与运动预适应组相比，运动预适应+AG490组血清乳酸脱氢酶和肌酸激酶同工酶活性增加(P < 0.05)，心脏JAK2 mRNA和蛋白的表达降低(P < 0.05)。结果证实，运动预适应通过激活JAK/STAT信号通路，上调心脏JAK2 mRNA表达，增加心脏JAK2蛋白合成，减轻心肌缺血损伤，从而发挥其心脏保护作用。

关键词: 组织构建, 组织工程, 运动预适应, 缺血预适应, 力竭运动, JAK2激酶, AG490, 心脏保护, 心肌缺血, 乳酸脱氢酶, 肌酸激酶同工酶, 大鼠

Abstract:

BACKGROUND: Several studies have demonstrated that JAK2 kinase plays an important role in myocardial protection by ischemic preconditioning and medicine preconditioning.
OBJECTIVE: To investigate the effects of exercise preconditioning on JAK2 mRNA and protein expression in the rat heart and the underlying mechanism of action.
METHODS: SD rats were randomly divided into control, exhaustive, exercise preconditioning, and exercise preconditioning + AG490 groups. Rats in the control and exhaustive groups were fed routinely for 3 days. Rats in the exercise preconditioning and exercise preconditioning + AG490 groups were subjected to intermittent treadmill exercise for 3 successive days to establish exercise preconditioning animal models. Rats in the exercise preconditioning + AG490 group were intraperitoneally injected with JAK2 inhibitor AG490 at 10 minutes before exercise preconditioning. After 3 days, rats in the exhaustive, exercise preconditioning, and exercise
preconditioning + AG490 groups were subjected to exhaustive treadmill exercise. Serum levels of lactate dehydrogenase and creatine kinase isoenzyme were determined. JAK2 mRNA and protein expression in the rat myocardial tissue was detected by real-time fluorescent quantitative PCR and immunohistochemistry.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, serum levels of actate dehydrogenase and creatine kinase isoenzyme were increased, and JAK2 mRNA and protein expression in the myocardial tissue was significantly increased in the exhaustive group (P < 0.05). Compared with the exhaustive group, serum levels of actate dehydrogenase and creatine kinase isoenzyme were decreased (P < 0.05), while JAK2 mRNA and protein expression in the myocardial tissue was increased in the exercise preconditioning group (P < 0.05). Compared with the exercise preconditioning group, serum levels of actate dehydrogenase and creatine kinase isoenzyme were increased (P < 0.05), while JAK2 mRNA and protein expression in the myocardial tissue was decreased in the exercise preconditioning + AG490 group (P < 0.05). The results confirm that exercise preconditioning plays its cardioprotective role through activating JAK/STAT signaling pathway, up-regulating the expression of JAK2 mRNA and protein in the cardiac tissue and alleviating myocardial ischemia injury.

Key words: Exercise, Janus Kinases, Heart, Myocardial Ischemia

中图分类号:

R318

孙晓娟，薛海涛. 构建运动预适应力竭运动损伤模型大鼠心脏JAK2的表达变化[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(20): 3216-3220.

Sun Xiao-juan, Xue Hai-tao. JAK2 expression in myocardial tissue of rats after exercise preconditioning and exhaustive exercise injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(20): 3216-3220.

图/表（结果） 3

2.1 造模成功动物数量及过程实验纳入大鼠80只，运动预适应组和运动预适应+AG490组各淘汰2只，淘汰原因为不能坚持进行跑台运动，对照组和力竭运动组大鼠无脱落。最终有76只大鼠进入结果分析。造模流程图见图1。

2.2 构建的模型稳定性更好这种动物模型建立方法简单，重复性好，已被其他学者^[14-17]，以及本课题组前期实验多次采用^[4，18]，已成为国内外研究运动预适应心肌保护作用的常用模型。
2.3 运动预适应力竭运动损伤模型大鼠血清乳酸脱氢酶和肌酸激酶同工酶活性变化与对照组相比，力竭组血清乳酸脱氢酶和肌酸激酶同工酶活性显著升高(P < 0.05)；运动预适应组血清乳酸脱氢酶和肌酸激酶同工酶活性较力竭组明显降低(P < 0.05)；与运动预适应组相比，运动预适应+AG490组血清乳酸脱氢酶和肌酸激酶同工酶活性明显升高(P < 0.05)，见表1。
2.4 运动预适应力竭运动损伤模型大鼠心脏JAK2 mRNA表达变化与对照组相比，力竭组心脏JAK2 mRNA表达上调(P < 0.05)；运动预适应组心脏JAK2 mRNA表达又较力竭组明显上调(P < 0.05)；与运动预适应组相比，运动预适应+AG490组心脏JAK2 mRNA表达明显下调(P < 0.05)，见表1。

2.5 运动预适应力竭运动损伤模型大鼠心脏JAK2的表达变化免疫组织化学染色显示，心脏JAK2免疫反应阳性表达主要位于心肌细胞的细胞核，呈棕褐色，正常心肌细胞核被苏木精复染呈蓝色。对照组心脏JAK2免疫反应极少，可见散在分布的棕褐色细胞核(图2A)；力竭组心脏JAK2免疫反应较强，可见一定量的棕褐色细胞核(图2B)；运动预适应组心脏JAK2免疫反应增强，可见大量的棕褐色细胞核(图2C)；运动预适应+AG490组心脏JAK2免疫反应减弱，可见少量的棕褐色细胞核(图2D)。 2.5 运动预适应力竭运动损伤模型大鼠心脏JAK2的表达变化免疫组织化学染色显示，心脏JAK2免疫反应阳性表达主要位于心肌细胞的细胞核，呈棕褐色，正常心肌细胞核被苏木精复染呈蓝色。对照组心脏JAK2免疫反应极少，可见散在分布的棕褐色细胞核(图2A)；力竭组心脏JAK2免疫反应较强，可见一定量的棕褐色细胞核(图2B)；运动预适应组心脏JAK2免疫反应增强，可见大量的棕褐色细胞核(图2C)；运动预适应+AG490组心脏JAK2免疫反应减弱，可见少量的棕褐色细胞核(图2D)。

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引言

激烈运动或超负荷体力劳动时，易出现心肌的缺血缺氧，造成心脏结构的损伤性改变，因此对心肌缺血损伤的机制及保护措施的研究成为当今运动医学领域热点问题。缺血预适应是目前证实的最为有效的内源性心肌保护机制^[1-2]，是指心脏遭受短暂缺血后，能够增强其对长时间缺血的耐受现象。随着对缺血预适应研究的深入，发现大强度运动作为一种刺激因素，极大地提高了心肌耗氧量，造成短暂的心肌相对缺血，反复的运动则造成反复短暂的心肌缺血，这种通过运动致心肌相对缺血诱导机体产生缺血预适应的保护效应，从而提高心肌耐受缺血能力的现象称为运动预适应^[3]。
研究证实运动预适应对心肌具强大的保护作用，可以使运动至缺血时间延长，减少缺血/再灌注后心肌梗死面积，改善心肌收缩功能，抑制心肌细胞凋亡，减少心律失常的发生率，增强心肌对大强度运动的抵抗能力等^[4-5]。运动预适应作为一种物理刺激，由于其简单、安全和易控，对于科学制定训练计划和预防运动性心肌损伤都具有重要的理论价值和实际意义。但目前关于运动预适应的心肌保护作用机制尚未完全阐明。
Janus激酶信号转导子和转录激活子(Janus kinase signal transducers and activators of transcription, JAK/STAT)信号通路是细胞因子信号转导的重要途径之一，广泛参与细胞增殖、分化、凋亡、肿瘤以及免疫调节等多种生物学效应^[6]。近年来研究发现，JAK/STAT信号通路与心脏疾病发生的相关病理机制关系密切，其涉及心肌细胞的生长、存活和凋亡，并参与血管生成的调节，在心脏疾病的发生机制中发挥重要作用^[7]。JAK2激酶(Janus kinase 2，JAK2)是JAK/STAT信号通路的重要组成部分，活化的JAK2分子使STAT分子磷酸化，后者形成同源或异源二聚体再转入细胞核内，与相应的靶基因结合而激活相应的基因转录而发挥生理生化功能。已有研究表明JAK2在缺血预适应和药物预适应的心肌保护机制中发挥重要作用^[8-13]，但JAK2是否参与运动预适应的心肌保护作用尚未见报道。
实验通过建立运动预适应动物模型，力竭运动造成大鼠运动性心肌损伤，采用血清乳酸脱氢酶和肌酸激酶同工酶活性检测评价心肌的损伤情况；采用实时荧光定量PCR和免疫组织化学方法检测心脏JAK2 mRNA和蛋白的表达变化，探讨JAK2在运动预适应心肌保护中的作用，从而为揭示运动预适应心肌保护作用机制提供理论基础和实验依据，为运动心脏研究提供新的思路和参考。

材料方法

1.1 造模动物及材料实验于2013年6月至2013年12月在咸阳师范学院体育系运动人体科学实验室完成。健康雄性Sprague-Dawley大鼠80只，体质量220-250 g。常规分笼饲养，5只/笼，自由饮食，室温20-22 ℃，相对湿度45%-50%，每日光照时间为12 h。将大鼠80只适应性饲养1周，每天以15 m/min的速度进行10 min适应性跑台练习。1周后将大鼠按体质量分层，随机分为4组，对照组、力竭组、运动预适应组、运动预适应+AG490组，每组20只。

运动预适应力竭运动损伤模型大鼠心脏JAK2表达作用分析实验的主要试剂及仪器：
试剂及仪器	来源
JAK2激酶抑制剂(AG490)	美国Calbiochem公司
JAK2单克隆抗体	美国Cell signaling公司
免疫组化检测试剂盒，DAB显色试剂盒	北京中杉公司
血清乳酸脱氢酶检测试剂盒、肌酸激酶同工酶MB检测试剂盒	南京建成公司
Rotor-Gene 3000 Realtime PCR仪	美国Corbett Research公司
CX31系统显微镜、显微图像软件cellSens Entry	日本Olympus公司

1.2 造模方法参照Demirel等[11]和Lennon等[12]的文献建立运动预适应模型大鼠。运动预适应组和运动预适应+ AG490组大鼠进行连续3 d的间歇跑台运动，速度为28- 30 m/min，运动60 min/d，在60 min的运动过程中，运动15 min，休息5 min，重复3次。运动预适应+AG490组在每日运动预适应前10 min，腹腔注射JAK2抑制剂AG490 (3 mg/kg)。经过3 d实验后，力竭组、运动预适应组、运动预适应+AG490组以30 m/min的速度运动至力竭。 1.3 造模成功的检测标准力竭判断标准为大鼠连续10次以上滞留在跑道的后段，光电声刺激无效。
1.4 样本采集建模后30 min，将各组大鼠以体积分数0.4%戊巴比妥钠(10 μL/g)腹腔麻醉后，呈仰卧位固定，打开腹腔，从下腔静脉取血5 mL，静置15-30 min，3 000 r/min离心15 min，取血清-20 ℃保存待测。每组半数大鼠迅速开胸取心脏，经预冷的灭菌生理盐水清洗后，置液氮速冻，-80 ℃冰箱保存待用，用于荧光定量PCR检测。剩余半数大鼠经左心室常规灌注固定后，取出心脏，置于40 g/L多聚甲醛中后固定24 h。组织常规乙醇梯度脱水、二甲苯透明、浸蜡、石蜡包埋和切片，用于心脏免疫组织化学实验。
1.5 血清乳酸脱氢酶和肌酸激酶同工酶活性检测建模后30 min，从大鼠下腔静脉取血，离心，分离血清，按试剂盒说明测定血清乳酸脱氢酶和肌酸激酶同工酶活性。
1.6 实时荧光定量PCR检测心脏JAK2 mRNA表达建模后1周，分别取各组心肌组织100 mg用眼科剪剪碎，用Trizol试剂裂解提取总RNA，反转录合成cDNA，以cDNA为模板进行PCR。反应体系50 μL：SYBRGreen Mix 32.5 μL，上下游引物各0.5 μL，ddH2O 14.5 μL，cDNA 模板2 μL。反应程序：95 ℃ 10 min，然后95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s，共40个循环。每个样本设置3个重复孔。根据定量PCR原始检测结果，按照2-??Ct相对定量计算公式，以β-actin基因为内参。定量PCR检测在Rotor-Gene 3000 Realtime PCR仪上进行。

引物信息：
引物名称	序列(5’-3’)	片段长度
JAK2	上游：5’-TCA TAA ACC TGG AGA CCC TG-3’ 下游：5’-ATA CCC GTC AAT TAA CGA CA-3’	432 bp
β-actin	上游：5’-CTG AGA GGG AAA TCG TGC GT-3’ 下游：5’-TGG AAG GTG GAC AGT GAG GC-3’	448 bp

1.7 免疫组织化学染色检测大鼠心脏JAK2蛋白表达采用SP两步法免疫组织化学方法。制作常规石蜡切片，切片脱蜡至水；体积分数3%H2O2去离子水室温孵育10 min；滴加复合消化液室温孵育10 min；滴加兔抗人JAK2抗体(1∶200)，4 ℃孵育24 h；滴加HRP标记的羊抗兔IgG (1∶400)，37 ℃孵育30 min；DAB显色；脱水，透明，封固。以PBS代替一抗作为阴性对照。免疫组织化学染色结果用计算机图像分析系统采集照片并进行定量分析。将各组心脏JAK2免疫反应切片随机选片5张，在同一放大倍数下(10×40)，每张切片在光学显微镜下随机选择5个视野，每组共测25个视野，测定心脏JAK2免疫反应阳性表达的积分吸光度(A)。
1.8 主要观察指标各组大鼠血清乳酸脱氢酶和肌酸激酶同工酶活性；实时荧光定量PCR和免疫组织化学方法检测心脏JAK2 mRNA和蛋白的表达。
1.9 统计学分析实验数据采用SPSS 17.0统计软件处理，所有数据均用x±s表示，组间比较采用单因素方差分析法，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

实验通过检测血清乳酸脱氢酶和肌酸激酶同工酶活性，观察运动预适应是否能够减轻力竭运动所致的心肌缺血损伤，结果显示，力竭运动可造成心肌细胞损伤，导致大量心肌酶释放入血，血清乳酸脱氢酶和肌酸激酶同工酶活性明显增高；先经运动预适应再进行力竭运动后，血清乳酸脱氢酶和肌酸激酶同工酶活性明显降低，表明运动预适应能够减轻力竭运动引发的心肌细胞损伤，对心肌产生保护作用。
鉴于缺血预适应和药物预适应的心肌保护作用均与心脏JAK2表达增加有关，而运动预适应是缺血预适应的一种特殊形式，实验推测心脏JAK2可能参与了运动预适应的心肌保护作用。实验采用实时荧光定量PCR和免疫组织化学方法观察了运动预适应对心脏JAK2 mRNA和蛋白表达的影响，结果发现，力竭运动后心脏JAK2 mRNA和蛋白表达轻度升高，血清乳酸脱氢酶和肌酸激酶同工酶活性增加；先经运动预适应再进行力竭运动后，心脏JAK2 mRNA和蛋白的表达明显升高，而血清乳酸脱氢酶和肌酸激酶同工酶活性明显降低。提示运动预适应能够上调心脏JAK2 mRNA表达，进而促进了JAK2蛋白的合成，减轻力竭运动造成的心肌损伤。实验在运动预适应前给予JAK2抑制剂AG490处理后，心脏JAK2 mRNA和蛋白的表达明显降低，而血清乳酸脱氢酶和肌酸激酶同工酶活性升高。说明JAK2抑制剂AG490能够抑制运动预适应诱导的JAK2表达的增加，进而消除了运动预适应对心肌损伤的保护作用。
总之，运动预适应通过激活JAK/STAT信号通路，上调心脏JAK2 mRNA表达，增加心脏JAK2蛋白合成，从而减轻心肌缺血损伤，对心脏发挥保护作用。深入研究运动预适应细胞信号转导途径，有助于阐明其细胞分子机制，为防治运动性心肌损伤以及冠心病的预防和康复提供新的思路。