2.1  实验动物数量分析  实验选用大鼠50只，分为5组，实验过程中无脱失，全部进入结果分析。

2.2  大鼠血清肿瘤坏死因子α、白细胞介素8、白细胞介素1β和白细胞介素10水平的比较  运动对照组大鼠血清肿瘤坏死因子α、白细胞介素10、白细胞介素8和白细胞介素1β水平均高于安静对照组(P < 0.01)，葛根总黄酮各剂量组大鼠血清肿瘤坏死因子α、白细胞介素10、白细胞介素8和白细胞介素1β水平均高于安静对照组(P < 0.01或P < 0.05)，葛根总黄酮中剂量和高剂量组大鼠血清肿瘤坏死因子α和白细胞介素10水平均低于运动对照组(P < 0.01)；葛根总黄酮低、中剂量和高剂量组大鼠血清白细胞介素8和白细胞介素1β水平均低于运动对照组(P < 0.01或P < 0.05)。见表2。

2.3  大鼠脑组织肿瘤坏死因子α、白细胞介素8、白细胞介素1β和白细胞介素10水平的比较   运动对照组大鼠脑组织肿瘤坏死因子α、白细胞介素10的、白细胞介素8和白细胞介素1β水平均高于安静对照组(P < 0.01)，葛根总黄酮各剂量组大鼠脑组织肿瘤坏死因子α和白细胞介素10的水平均高于安静对照组(P < 0.01)，葛根总黄酮中、高剂量组大鼠脑组织肿瘤坏死因子α和白细胞介素10的水平均低于运动对照组(P < 0.01)；葛根总黄酮低、中和高剂量组大鼠脑组织白细胞介素8和白细胞介素1β水平均低于运动对照组(P < 0.01或P < 0.05)。见表3。

2.4  大鼠脑组织STAT3 mRNA及蛋白表达  运动对照组大鼠脑组织STAT3 mRNA及蛋白表达均高于安静对照组(P < 0.01)；葛根总黄酮各剂量组大鼠脑组织STAT3 mRNA及蛋白表达均低于运动对照组(P < 0.01)。见图1，表4。

大脑是机体内缺血缺氧较为敏感的器官，且含有较低的抗氧化剂和较高的不饱和脂肪酸，易遭受氧化损伤和发生炎症反应。适量的运动训练是改善机体内缺氧损伤、氧的摄取、运输和利用的最有效方式^[1]，但长时间的大强度训练后，致使机体内脑缺血是常见的状态^[2]。高强度运动或运动负荷过大时，存在着机体内严重的缺血缺氧或导致局部脑组织缺血，致使脑组织中血和氧供应的拮抗因子平衡关系发生改变^[3]。

葛根是中国卫生部公布常用的传统中药，于1995年收载入《中国药典》和《中药志》中，属豆科类植物野葛的干燥根，葛根中含有多种氨基酸和矿质元素以及人体所需的铁、锌、铜和镁等微量元素，它的主要成分是总黄酮、淀粉和纤维素等^[4]。而葛根总黄酮则是葛根的乙醇提取物，它的有效成分主要是异黄酮类化合物(葛根甙､黄豆甙､大豆甙元和葛根素等)^[5]。葛根总黄酮的分子式为C₂₁H₂₀O₉，熔点为187-189 ℃，葛根总黄酮具有抗氧化^[6]、抗细胞凋   亡^[7]、改善脑外伤神经和保护心脑血管等作用^[8-9]。目前通过葛根总黄酮干预运动大鼠脑组织炎症因子及信号传导和转录活化因子3(signal transducer and activator of transcription-3，STAT3)的变化还鲜有报道。因此，此次研究通过建立力竭性大鼠模型，研究葛根总黄酮对运动大鼠血清及脑组织肿瘤坏死因子α、白细胞介素8、白细胞介素1β、白细胞介素10和STAT3的影响，为探讨高强度运动训练时葛根总黄酮在脑组织中的生物学作用以及为葛根总黄酮用于运动营养补剂的开发与利用提供实验依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  设计  随机对照动物实验观察。

1.2  时间及地点  实验于2018年10月至2019年7月在广西师范大学体育学院实验教学中心完成。

1.3  材料 

1.3.1  实验动物  4月龄SPF级SD雄性大鼠50只，体质量(220±15) g，平均体质量为217.3 g，购自桂林医学院实验动物中心，生产许可证编号：SCXK(桂)2013-0001。使用许可证编号SYXK(桂)2013-0001：动物批号：20180113。葛根总黄酮(Pueraria Total Flavone，PTF)由南京景竹生物科技有限公司提供(总黄酮含量80%)。

1.3.2  实验用主要试剂及仪器  肿瘤坏死因子α试剂盒(货号：EK0526)；白细胞介素8(货号：EK0413)；白细胞介素10(货号：EK0418)白细胞介素1β(货号：EK0393)，均为武汉博士德生物工程有限公司产品；M1000酶标测定仪(瑞士TeCAn)。

1.4  实验方法

1.4.1  动物分组及给药量  将50只雄性SD大鼠适应性饲养1周后随机分为5组(每组10只)：安静对照组、力竭运动对照组(运动对照组)、运动+葛根总黄酮低剂量组(葛根总黄酮低剂量组)、运动+葛根总黄酮中剂量组(葛根总黄酮中剂量组)和运动+葛根总黄酮高剂量组(葛根总黄酮高剂量组)。葛根总黄酮低、中和高剂量组均在运动前半小时灌胃，灌胃葛根总黄酮体积为10.0 mL/kg，质量浓度分别为50，100，200 mg/kg。连续灌胃6周，1次/d，直到实验结束。

1.4.2  动物模型与取材  运动对照组和葛根总黄酮低、中、高剂量组大鼠进行为期3 d的适应性跑台训练(坡度为0°)，速度控制在15 m/min，每天运动15 min。适应性训练结束后，运动训练模型按BEDFORD^[10-11]方案进行设计并做适当的调整，设定大鼠运动跑台的速度为19.3 m/min(6%的   VO_{2 max}左右)，其中跑台坡度为5°，每天训练1次，每次训练30 min，6 d/周，连续训练6周，于6周末即最后一次训练达到力竭，记录力竭时间(对于短时间力竭的大鼠，休息5 min以后，再继续训练到力竭，保证大鼠运动时间达到  60 min以上)。力竭判断标准为大鼠四肢伏地，声光电刺激不能继续运动，并无法完成翻正反射。

1.4.3  取材  6周训练结束后大鼠禁食24 h，然后配制浓度为20%的乌拉坦溶液按3 mL/kg腹腔注射麻醉后解剖，抽取主动脉血液10 mL，放入离心管中，经3 000 r/min离心10 min( 4 ℃)，取血清于EP管中，标记，-80 ℃冰箱中保存。取血后迅速解剖取脑组织，经生理盐水清洗，滤纸吸干，包裹后放入-80 ℃冰箱中保存待测。

1.4.4  指标测定  取各组大鼠脑组织150 mg左右，经生理盐水配成10%的脑组织进行研磨制成匀浆，并经4 ℃离心12 000 r/min，15 min取上清液，按ELISA法试剂盒说明书步骤进行，采用M1000酶标测定仪测定大鼠血清及脑组织肿瘤坏死因子α、白细胞介素8、白细胞介素1β和白细胞介素10的水平。

1.4.5  大鼠脑组织STAT3 mRNA及蛋白表达的测定

(1)采用RT-PCR检测大鼠脑组织STAT3蛋白表达：取脑组织150 mg进行研碎致匀浆化，再采用Trizol法提取脑组织总RNA；经紫外分光光度计检测RNA纯度和浓度后，进行cDNA的合成，取2.5 μL样本严格按照RT-PCR说明书进行检测，其引物信息见表1。最后，取10 μL转录产物于2.0%的琼脂糖凝胶模板电泳(95 V，75 min)。其比值均采用脑组织STAT3/β-actin来表示。

(2)Western Blot检测大鼠脑组织STAT3蛋白表达：取大鼠脑组织150 mg经研磨并充分裂解后，经过12 000 r/min离心5 min后取上清液，并采用BCA法测定蛋白浓度定量，然后以35 µL总蛋白上样，经10%的SDS-PAGE电泳后，将蛋白转移至PVDF膜上，恒定电流14 V，100 mA，转印2 h后，封闭过夜，加STAT3抗体(1∶1 000)、β-actin抗体        (1∶500)4℃孵育过夜。加羊抗鼠(二抗)IgG-Biotin(1∶1 000)孵育60 min，经PBST 洗膜后，加ECL化学发光底物于膜上，    5 min后置于转移膜上进行曝光，显影、定影并对各蛋白条带进行灰度扫描并用STAT3/β-Actin比值表示。

1.5  主要观察指标  ①大鼠脑组织和血清肿瘤坏死因子α、白细胞介素8、白细胞介素1β和白细胞介素10水平；②大鼠脑组织STAT3 mRNA及蛋白表达。

1.6  统计学分析  数据统计采用SPSS 19.0统计软件处理，计量资料用x(_)±s表示，组间差异采用单因素方差分析，组间两两比较采用Dunnett-t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

3.1  力竭运动对大鼠血清和脑组织肿瘤坏死因子α、白细胞介素8、白细胞介素1β和白细胞介素10水平的影响  长时间的大强度运动训练可引起机体内各器官组织产生过度的应激，从而致使机体内各器官组织承受的生理负荷超出了正常的生理范围，使机体受到损伤^[12]。而大脑是重要的人体器官，在长时间的大强度运动训练时易引起缺血缺氧，从而产生多种炎性因子发生变化，引发一系列的炎性反  应^[13-14]。肿瘤坏死因子α、白细胞介素8、白细胞介素1β和白细胞介素10是非常重要的炎性细胞因子，对于调节大脑缺血缺氧产生的炎症反应起到非常重要的作用。

肿瘤坏死因子α是肿瘤坏死因子亚型的一种，是促炎症细胞因子，主要是在中枢神经内星形细胞、神经元和血管内皮细胞等中产生，具有参与机体的免疫应答和炎症反应的作用^[15]。BUFFO等^[16]研究发现，野生型鼠在脑缺血早期激活了神经内星形胶质细胞，激活后肿瘤坏死因子α参与了脑缺血炎症反应。林华等^[17]研究发现，力竭运动后大鼠血清肿瘤坏死因子α水平没有明显变化，而通过灌服Flor-Essence营养保健品后肿瘤坏死因子α水平有所下降。朱祖建^[18]研究发现，急性脑梗死患者采用早期的运动训练和服用丁苯酞软胶囊，血浆中肿瘤坏死因子α的水平受到抑制。白明等^[19]通过研究葛花总黄酮对脑缺血再灌注模型小鼠的作用后发现，葛花总黄酮各剂量组小鼠脑组织肿瘤坏死因子α水平降低，表明葛花总黄酮对脑组织具有保护作用。张玲等^[20]通过研究脑缺血模型大鼠后发现，白莱子总黄酮降低了大鼠脑组织肿瘤坏死因子α水平，表明白莱子总黄酮对大鼠脑缺血具有很好的改善作用。此次研究发现，力竭运动后大鼠血清和脑组织肿瘤坏死因子α水平均高于安静对照组，提示肿瘤坏死因子α水平的增加可能引起大鼠脑缺血缺氧和脑组织的缺血性损伤^[15]，从而影响大鼠的运动能力；通过补充不同剂量的葛根总黄酮后发现，大鼠血清和脑组织肿瘤坏死因子α水平均低于运动对照组，特别是在中剂量组和高剂量组下降较明显，提示葛根总黄酮具有降低大鼠肿瘤坏死因子α的水平，防止脑缺血缺氧，从而达到保护脑组织的作用。

白细胞介素8是CXC家族成员，属于α趋化因子，又称中性粒细胞趋化/激活蛋白1(NAP1)，主要是在机体内的炎症、感染、损伤和组织缺氧的情况下产生，具有趋化和激活中性粒细胞的作用，是重要的介导炎症细胞因子^[21-22]。此外，白细胞介素8在机体内还会生成氧化代谢产物和释放细胞内酶以及加快缺血脑组织的炎症反应^[23]。白细胞介素8水平的高低则反映机体急性脑梗死的严重程度^[24]。千玲玲等^[25]研究发现，脑梗死发生后患者血清白细胞介素8水平升高，通过注射中成药后降低了白细胞介素8水平，改善了脑梗死后的缺损。来小音等^[26]和SHISHKOVA等^[27]研究表明，脑梗死患者血中白细胞介素8水平的高低与脑卒中的严重程度密切相关。王家祥等^[28]对运动前后大鼠进行推拿后发现，运动前推拿组大鼠血清白细胞介素8水平高于运动后推拿组。胡昱月^[29]通过研究过氧化氢诱导人脐静脉内皮细胞氧化应激损伤后发现，海风藤总黄酮能够降低白细胞介素8的水平，表明海风藤总黄酮能够提高氧化应激损伤的人脐静脉内皮细胞的存活率。此次研究发现，力竭运动后大鼠血清和脑组织白细胞介素8水平均高于安静对照组，推测力竭运动趋化和激活了中性粒细胞数目的增多、吞噬活性的增强和氧化代谢产物的增加，致使脑组织在缺氧的情况下产生炎症反应；通过补充不同剂量的葛根总黄酮后发现，大鼠血清和脑组织白细胞介素8水平均低于运动对照组，特别是在高剂量组大鼠血清和脑组织白细胞介素8水平基本上降到安静对照组水平，推测葛根总黄酮可以预防大鼠白细胞介素8发生异常，抑制炎性细胞的增多，防止力竭运动后产生脑组织的损伤和炎症的趋化。

白细胞介素1β是白细胞介素1的家族成员之一，主要是由机体内单核巨核噬细胞中分泌产生，在炎性反应、细胞生长和抗原呈递等过程中起到非常重要的作用。CASO等^[30]通过对大鼠大脑中动脉栓塞后发现，大鼠脑组织中白细胞介素1β水平升高，表明白细胞介素1β参与了大鼠脑组织损伤后的炎症反应。李宁川等^[31]研究发现，力竭运动后大鼠血浆白细胞介素1β水平升高，表明大负荷运动引起机体内骨骼肌损伤，进而诱发局部的炎症反应。赖红梅等^[32]通过对大鼠进行3个月的游泳运动训练后发现，大鼠下丘脑和垂体白细胞介素1β表达水平有所下降，表明有氧运动抑制了白细胞介素1β的表达水平，从而降低老年期神经细胞对炎症的反应。康峰^[33]研究发现，长时间的运动训练能够降低大鼠巨噬细胞分泌的白细胞介素1β水平，通过补充灵芝多糖后巨噬细胞分泌的白细胞介素1β水平得到恢复。彭丽娜等^[34]研究发现，力竭运动后大鼠血清白细胞介素1β水平升高，但通过补充玛咖溶液后大鼠血清白细胞介素1β水平有所下降，表明玛咖可以提高机体的免疫功能。马历历等^[35]通过研究黄芪总黄酮对脑缺血再灌注损伤大鼠的作用后发现，黄芪总黄酮降低了大鼠脑组织白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α水平，表明黄芪总黄酮对大鼠的脑损伤具有保护作用。此次研究发现，力竭运动后大鼠血清和脑组织白细胞介素1β水平升高，表明运动强度的增大，大脑组织的需氧量和机体氧化代谢产物的增多，引起大鼠缺血缺氧，降低了机体的免疫力和增加了炎症反应；通过补充不同剂量的葛根总黄酮发现，大鼠血清和脑组织白细胞介素1β水平有所下降，特别是在高剂量组大鼠血清和脑组织白细胞介素1β水平基本上得到恢复，这与彭丽娜等^[34]研究相一致，表明葛根总黄酮具有提高机体的免疫力和防止细胞炎症的增加，防止大脑缺血缺氧性损伤。

白细胞介素10是一种单肽链糖蛋白，由178个氨基酸组成，主要是在机体内Th2细胞、某些Th0细胞和Th1细胞以及单核-巨噬细胞和活化的肥大细胞中产生^[36]。白细胞介素10是一种抗炎因子，当机体大脑缺血受到损伤时，白细胞介素10具有抗炎、神经保护、抗自由基、抗凋亡以及抑制单核细胞来源的促炎因子肿瘤坏死因子α、白细胞介素8、白细胞介素10β和MIP-1α等因子的增殖^[37-38]。LEE等^[39]研究发现，白细胞介素10作为机体内抗炎性细胞因子，除了具有抑制机体内脑缺血后产生的炎症反应和免疫损伤外，还具有拮抗肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β介导的促炎反应。刘善云等^[40]通过对小鼠进行12周的耐力训练后发现，白细胞介素10的表达水平增加。最近有研究也发现，急性脑梗死患者采用早期的康复运动能明显提高白细胞介素10的水平以及抑制白细胞介素8、白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α等炎症因子的表达水平，表明康复运动具有保护脑细胞作用^[18，41]。刘显斌等^[42]对大鼠进行长时间的大强度运动增加了白细胞介素10的表达水平，说明长时间大强度训练致使脑缺血缺氧和激活促炎和抗炎反应，但通过补充中药后降低了炎症细胞因子水平，同时表明中药具有减轻缺血缺氧脑的损伤和保护脑组织神经功能。刘银花等^[43]通过研究脑缺血模型大鼠预处理后发现，白子菜总黄酮大剂量组和小剂量组大鼠脑组织白细胞介素10水平有所增加，表明白子菜总黄酮具有改善脑组织的损伤。此次研究发现，力竭运动后大鼠血清和脑组织白细胞介素10的水平均升高，表明力竭运动引起大鼠缺血缺氧和抗炎细胞因子的反应；但通过补充不同剂量的葛根总黄酮后，大鼠血清和脑组织白细胞介素10水平均有所下降，高剂量下降较明显，提示葛根总黄酮可能通过抑制大鼠机体内的炎症因子或减轻炎症反应，从而起到防止由力竭运动引起的缺血缺氧性脑损伤。

3.2  力竭运动对大鼠脑组织STAT3 mRNA及蛋白表达的影响  STAT3是STATS家族成员，是JAKs激酶的直接底物，其中JAK2(Janus激酶2)和STAT3是重要的脑缺血信号通路。STAT3广泛存在于机体内的中枢神经系统和脑组织中^[44]。STAT3是机体重要的细胞因子信号转导途径，具有参与调节机体内脑组织的炎性反应、脑组织细胞损伤、细胞凋亡及坏死、生殖和免疫调节等作用^[45-46]。王洪海等^[47]通过对大鼠脑缺血再灌注后研究发现，缺血再灌注模型组STAT3和JAK2表达升高，表明STAT3和JAK2调控了大鼠脑缺血再灌注损伤的炎性反应。梅志刚等^[48]研究发现，对脑缺血再灌注模型大鼠进行灌注葛根素后STAT3表达升高，表明葛根素对脑缺血再灌注大鼠具有抗炎作用。陈媛等^[49]研究发现，大鼠脑缺血再灌注组STAT3和JAK2表达升高，葛根素组STAT3表达下降，表明葛根素抑制了STAT3和JAK2信号通路发生异常，防止脑损伤。谈艳等^[50]研究发现，普通膳食运动组大鼠致使STAT3表达显著升高。唐智伟等^[51]对大鼠进行缺氧预处理大鼠缺血性脑损伤研究发现，缺氧预处理大鼠脑梗死组STAT3表达升高，表明大鼠缺血性脑损伤致使STAT3信号通路被激活。此次研究发现，通过6周的运动训练至力竭运动后大鼠脑组织STAT3 mRNA及蛋白表达均高于安静对照组，提示长时间的运动训练导致大鼠脑组织缺血缺氧，影响脑组织的免疫功能，产生炎症反应；也可能是由于力竭运动引起STAT3表达的升高，激活了脑组织的信号通路，从而达到保护脑组织受到损伤。通过补充不同剂量的葛根总黄酮后，大鼠脑组织STAT3 mRNA及蛋白表达均低于运动对照组，基本上恢复到安静对照组时的水平，提示葛根总黄酮具有调节机体内脑组织细胞因子的信号转导途径，从而达到保护机体脑组织免受运动应激的损伤，但其机制还要有待深入研究。

总之，长时间的力竭运动训练致使大鼠脑组织在缺氧的情况下产生炎症反应；引起STAT3表达的升高。通过补充葛根总黄酮后，炎症细胞因子水平和STAT3表达基本上恢复到安静时的水平，表明葛根总黄酮具有调节STAT3表达水平和抑制炎症反应，但其机制还有待深入研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：

细胞因子：细胞因子是由多种组织细胞(主要为免疫细胞)所合成和分泌的小分子多肽或糖蛋白。根据种类的不同分为淋巴因子、单核因子、非淋巴细胞和非单核-巨噬细胞产生的细胞因子；根据功能不同分为白细胞介素、集落刺激因子、干扰素、肿瘤坏死因子、生长因子、趋化因子家族和转化生长因子β家族。

JAK2(Janus激酶2)：是非跨膜型的酪氨酸激酶JAKs其中的细胞信号转导因子，是重要的脑缺血信号通路。常与STATs一起参与细胞炎性反应、应激和免疫调节等多个环节，此外，AG490 是JAK2 的抑制剂，能抑制JAK2 的络氨酸磷酸化和信号传导及转录活化因子3 的磷酸化及活化。

STAT3是STATS家族成员，是JAKs激酶的直接底物，其中JAK2（Janus激酶2）和STAT3是重要的脑缺血信号通路。STAT3广泛存在于机体内的中枢神经系统和脑组织中。STAT3是机体重要的细胞因子信号转导途径，具有参与调节机体内脑组织的炎性反应、脑组织细胞损伤、细胞凋亡及坏死、生殖和免疫调节等作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程