运动预适应与力竭运动大鼠心肌损伤：Rho/ROCK信号通路的作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2502

中国组织工程研究 ›› 2020, Vol. 24 ›› Issue (11): 1714-1719.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2502

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运动预适应与力竭运动大鼠心肌损伤：Rho/ROCK信号通路的作用

刘晓晨¹，王改凤²

¹河南财政金融学院体育系，河南省郑州市 450046；²河南省中医院脑病一病房，河南省郑州市 450002

收稿日期:2019-04-11 修回日期:2019-04-19 接受日期:2019-07-26 出版日期:2020-04-18 发布日期:2020-02-28
通讯作者: 王改凤，硕士，主治医师，河南省中医院脑病一病房，河南省郑州市 450002
作者简介:刘晓晨，男，1981年生，河南省郑州市人，汉族，2006年郑州大学毕业，硕士，讲师，主要从事运动医学方面的研究。
基金资助:
河南省体育局课题研究项目(2018026)

Exercise preconditioning for myocardial injury in rats after exhaustive exercise based on Rho/ROCK pathway

Liu Xiaochen¹, Wang Gaifeng²

¹Department of Physical Education, Henan University of Finance and Economics, Zhengzhou 450046, Henan Province, China; ²First Ward of Encephalopathy, Henan Hospital of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450002, Henan Province, China

Received:2019-04-11 Revised:2019-04-19 Accepted:2019-07-26 Online:2020-04-18 Published:2020-02-28
Contact: Wang Gaifeng, Master, Attending physician, First Ward of Encephalopathy, Henan Hospital of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450002, Henan Province, China
About author:Liu Xiaochen, Master, Lecturer, Department of Physical Education, Henan University of Finance and Economics, Zhengzhou 450046, Henan Province, China
Supported by:
the Project of Henan Provincial Department of Sports, No. 2018026

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
Rho/ROCK信号通路：Rho蛋白是小G结合蛋白Ras超家族成员之一，其通过激活下游蛋白激酶ROCK而产生多种生物学效应，如血管平滑肌的收缩、肌动蛋白细胞骨架形成、细胞黏附与迁移、细胞增殖与凋亡、基因表达等，与临床上多种心血管疾病如心力衰竭、缺血再灌注损伤、肺动脉高压、脑血管痉挛等相关疾病发生有关。对Rho/ROCK信号通路的研究有助于了解这些疾病的发病机制，进而为治疗提供一个新的思路。
运动预适应：是指反复短暂的间歇性大强度运动能够诱导机体产生缺血预适应，进而提高心肌对长时间缺血、缺氧的耐受能力，是减少心肌缺血损伤的有效途径之一。运动预适应作为一种物理刺激，具有简单、安全和易控的特点，对于科学制定训练计划和预防运动性心肌损伤都有重要意义。

背景：目前，关于运动预适应的心肌保护机制尚未完全阐明，据报道Rho/ROCK信号通路在心血管疾病中起到关键作用，运动预适应是否通过Rho/ROCK信号通路对心肌起到保护作用有待研究。

目的：基于Rho/ROCK信号通路探讨运动预适应在力竭运动大鼠心肌损伤中的作用。

方法：将60只5周龄的SPF级SD雄性大鼠随机分为3组：安静对照组、单纯力竭运动组、运动预适应+力竭运动组，各组建模结束后1 h，取血清进行全生化分析检测心肌酶谷草转氨酶、磷酸肌酸激酶、乳酸脱氢酶水平，取心肌组织标本进行苏木精-碱性复红-苦味酸染色观察心肌组织病理变化，分析缺血缺氧程度，TUNEL法观察心肌细胞凋亡情况，ELISA法检测心肌组织肿瘤坏死因子α和白细胞介素10水平，Western blot检测心肌组织RhoA、ROCK1、ROCK2、Bax和Bcl-2蛋白的表达。

结果与结论：①单纯力竭运动组谷草转氨酶、磷酸肌酸激酶、乳酸脱氢酶水平显著高于安静对照组(P < 0.05)；而运动预适应+力竭运动组谷草转氨酶、磷酸肌酸激酶、乳酸脱氢酶水平显著低于单纯力竭运动组(P < 0.05)；②单纯力竭运动组心肌细胞界限不清楚，呈现出较多斑块状或片状艳红色样区域，与安静对照组相比，有明显的缺血缺氧改变；运动预适应+力竭运动组部分心肌细胞界限不清楚，出现部分斑块状艳红色染色，较单纯力竭运动组缺血缺氧程度明显减轻；③单纯力竭运动组较安静对照组凋亡指数值明显升高，运动预适应+力竭运动组与单纯力竭运动组相比凋亡指数值明显下降(P < 0.05)；④单纯力竭运动组的肿瘤坏死因子α和白细胞介素10水平显著高于安静对照组(P < 0.05)，运动预适应+力竭运动组肿瘤坏死因子α和白细胞介素10水平显著低于单纯力竭运动组(P < 0.05)；⑤单纯力竭运动组的Bcl-2/Bax显著低于安静对照组(P < 0.05)，运动预适应+力竭运动组Bcl-2/Bax显著高于单纯力竭运动组(P < 0.05)；⑥与安静对照组相比，单纯力竭运动组RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白水平明显升高，而运动预适应+力竭运动组RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白水平显著低于单纯力竭运动组(P < 0.05)；⑦结果表明，运动预适应对心肌损伤具有保护作用，可改善大鼠的心脏功能，其作用机制可能与Rho/ROCK通路有关。

ORCID: 0000-0002-0145-8270(刘晓晨)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 运动预适应, 力竭运动, Rho/ROCK, 心肌损伤, 心功能, 细胞凋亡, 蛋白表达

Abstract:

BACKGROUND: At present, the mechanism of exercise preconditioning for myocardial protection has not been fully elucidated. It is reported that Rho/ROCK pathway plays a key role in cardiovascular disease. Whether exercise preconditioning adapts to the myocardium through the Rho/ROCK signaling pathway remains to be studied.

OBJECTIVE: To investigate the role of exercise preconditioning in rats with myocardial injury after exhaustive exercise.

METHODS: Sixty male Sprague-Dawley rats of 5 weeks old were randomly divided into three groups: control group, simple exhaustive exercise group (EE group), and exercise preconditioning group after exhaustive exercise (EP+EE group). At 1 hour after modeling, a serum sample from each rat was taken for biochemical analysis. The levels of aspartate aminotransferase, phosphocreatine kinase, and lactate dehydrogenase were detected. Myocardial tissue samples from each rat were taken for pathological observation using hematoxylin-alkaline reddish-picric acid staining. TUNEL method was used to observe apoptosis in the myocardial tissue. The levels of tumor necrosis factor-α and interleukin-10 in the myocardial tissue were detected by ELISA. The expression of RhoA, ROCK1, ROCK2, Bax, and Bcl-2 protein was analyzed by western blot.

RESULTS AND CONCLUSION: The levels of aspartate aminotransferase, phosphocreatine kinase, and lactate dehydrogenase of the EE group were significantly higher than those of the control group (P < 0.05). The levels of aspartate aminotransferase, phosphocreatine kinase, and lactate dehydrogenase of the EP+EE group were significantly lower than those of the EE group (P < 0.05). The boundary of cardiomyocytes was unclear in the EE group, in which there were more plaque-like or flaky red-like areas as well as more obvious ischemia-anoxia changes as compared with the control group. Some cardiomyocytes presented with unclear boundary in the EP+EE group with some plaque-like brilliant red-like areas, and the degree of ischemia and anoxemia was significantly lower in the EP+EE group than the EE group. The apoptotic index value of the EE group was significantly higher than that of the control group, and the apoptotic index value of the EP+EE group was significantly lower than that of the EE group (P < 0.05). The tumor necrosis factor-α and interleukin-10 levels in the EE group were significantly higher than those in the control group (P < 0.05). The tumor necrosis factor-α and interleukin-10 levels in the EP+EE group were significantly lower than those in the EE group (P < 0.05). The Bcl-2/Bax of the EE group was significantly lower than that of the control group (P < 0.05). The Bcl-2/Bax of the EP+EE group was significantly higher than that of the EE group (P < 0.05). The levels of RhoA, ROCK1 and ROCK2 in the EE group were significantly higher than those in the control group. The levels of RhoA, ROCK1 and ROCK2 in the EP+EE group were significantly lower than those in the EE group (P < 0.05). These findings indicate that exercise preconditioning has a protective effect against myocardial injury and improves cardiac function in rats. The mechanism may be related to the Rho/ROCK pathway.

Key words:

exercise preconditioning, exhaustive exercise, Rho/ROCK, myocardial injury, cardiac function, apoptosis, protein expression

中图分类号:

刘晓晨, 王改凤. 运动预适应与力竭运动大鼠心肌损伤：Rho/ROCK信号通路的作用[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(11): 1714-1719.

Liu Xiaochen, Wang Gaifeng. Exercise preconditioning for myocardial injury in rats after exhaustive exercise based on Rho/ROCK pathway[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2020, 24(11): 1714-1719.

图/表（结果） 7

2.1 运动预适应对力竭运动大鼠心功能的影响单纯力竭运动组谷草转氨酶、磷酸肌酸激酶、乳酸脱氢酶水平显著高于安静对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)，运动预适应+力竭运动组谷草转氨酶、磷酸肌酸激酶、乳酸脱氢酶显著低于单纯力竭运动组，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图1。

2.2 各组心肌组织苏木精-碱性复红-苦味酸染色结果安静对照组心肌细胞轮廓清楚，细胞质较丰富，细胞核被染为淡蓝黑色位于细胞中央，染色均匀，未见艳红色缺血缺氧改变，见图2A；单纯力竭运动组心肌细胞界限不清楚，呈现出较多斑块状或片状艳红色区域，与安静对照组相比，有明显的缺血缺氧改变，见图2B；运动预适应+力竭运动组部分心肌细胞界限不清楚，出现部分斑块状艳红色染色，较单纯力竭运动组缺血缺氧程度明显降低，见图2C。

2.3 心肌组织苏木精-碱性复红-苦味酸染色图像分析结果见表1。单位面积内缺血缺氧程度用平均吸光度值表示。与安静对照组相比，单纯力竭运动组的平均吸光度值显著升高，差异有显著性意义(P < 0.05)，与单纯力竭运动组相比，运动预适应+力竭运动组的平均吸光度值显著降低，差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.4 运动预适应对力竭运动大鼠心肌细胞凋亡的影响正常心肌细胞核呈蓝色，TUNEL染色凋亡阳性心肌细胞核呈棕黄色。与安静对照组相比，单纯力竭运动组凋亡阳性指数值明显升高，运动预适应+力竭运动组与单纯力竭运动组相比凋亡阳性指数值明显下降，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图3。单纯力竭运动组的Bcl-2/Bax显著低于安静对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)，运动预适应+力竭运动组Bcl-2/Bax显著高于单纯力竭运动组，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图4。

2.5 运动预适应对力竭运动大鼠心肌组织肿瘤坏死因子α和白细胞介素10水平的影响单纯力竭运动组的肿瘤坏死因子α和白细胞介素10水平显著高于安静对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)，运动预适应+力竭运动组肿瘤坏死因子α和白细胞介素10水平显著低于单纯力竭运动组，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图5。

2.6 运动预适应对力竭运动大鼠心肌组织RhoA、ROCK1、ROCK2的影响与安静对照组相比，单纯力竭运动组RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表达明显升高，而运动预适应+力竭运动组RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表达显著低于单纯力竭运动组，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图6。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2018年5至7月在河南财政金融学院体育系完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物清洁级雄性SD大鼠60只，5周龄，体质量(210±20) g，购自军事医学科学院实验动物中心，动物合格证号：SCXK(京)2003-1-003。大鼠进食标准饲料，自由饮水；室温20-23 ℃，相对湿度45%-50%，光照时间为12 h/d。参照随机数字表分为安静对照组、单纯力竭运动组、运动预适应+力竭运动组，每组20只。

1.3.2 实验试剂及仪器 TUNEL试剂盒(批号20180225)购自博士德生物公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒(批号20180221)、化学发光试剂盒(批号20180506)购自广东锐博生物科技技术股份有限公司；兔抗大鼠Rho、兔抗ROCK1抗体、兔抗ROCK2、兔抗GAPDH以及山羊抗兔IgG购自美国Abcam公司；小鼠白细胞介素10(批号B500037)、肿瘤坏死因子α(批号A37927)检测试剂盒购自上海西唐生物科技有限公司；酶标仪购自美国BIO-TEK公司；PVDF膜(孔径为0.22 µm)购自美国Millipore公司；电泳仪购自北京百晶生物技术有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 实验动物造模安静对照组不运动，单纯力竭运动组仅于第2周的最后1 d将大鼠放在(32±1) ℃水温的桶内进行一次尾部负重3%体质量重物的游泳力竭运动；运动预适应+力竭运动组要求每天游泳15 min，休息5 min，重复3次，每周6 d，持续训练2周，并于第2周的最后1 d进行一次游泳力竭运动。参考THOMAS等^[9]力竭标准：大鼠连续沉入水中超过10 s不能浮出或大鼠无法协调运动且伴随无方向性乱窜。该研究中动物处置方法均符合动物伦理学标准。

1.4.2 取材造模结束后1 h，将各组大鼠麻醉，尾静脉空腹采血用于检测心肌酶水平，迅速开胸剥离心脏用于各项生物学指标检测。

1.4.3 大鼠心功能指标检测采血前禁食6 h，尾静脉空腹采血，全自动生化仪检测谷草转氨酶、磷酸肌酸激酶、乳酸脱氢酶水平。

1.4.4 心肌组织苏木精-碱性复红-苦味酸染色(haematoxylin basin fuchsin picric acid，HBFP) 取材后的心肌4 µm切片，脱蜡后入苏木精染液30 s，蒸馏水冲洗；入碱性复红染色液3 min，蒸馏水冲洗；丙酮洗30 s，0.1%苦味酸纯丙酮迅速浸染15-20 s，二甲苯透明，中性树胶封固。正常心肌组织和缺血缺氧心肌组织分别被染成棕黄色和艳红色，根据显色不同清楚地显示心肌组织缺血缺氧变化。

1.4.5 心肌组织苏木精-碱性复红-苦味酸染色图像采集及分析每组随机选取5张组织切片，每张切片随机采集5个视野，在同一放大倍数(×400)下，使用Olympus DP80显微镜进行形态学观察及采集图像。利用计算机图像分析系统Image-ProPlus 6.0进行图像分析，检测指标为缺血缺氧面积(ischemia-hypoxia area，IHA)和积分吸光度(integral optical density，IOD)，并计算平均吸光度，平均吸光度=积分吸光度/缺血缺氧面积。单位面积内缺血缺氧损伤的程度用平均吸光度值表示。

1.4.6 TUNEL染色检测大鼠心肌组织细胞凋亡情况制作心肌组织石蜡切片，切片厚度5 µm，40 g/L多聚甲醛浸洗2次，PBS洗涤3次；加入蛋白酶K工作液在30 ℃室温水解15 min，PBS洗涤4次；加入含体积分数为2%过氧化氢的PBS反应10 min，PBS洗涤；加入TUNNEL反应混合液，加封口膜在暗湿盒中反应60 min，温度37 ℃，PBS漂洗；加入50 μL的conberter-POD，加封口膜在暗湿盒中反应 60 min，温度37 ℃，PBS漂洗；加入DAB 20 ℃反应 15 min，PBS漂洗，苏木精复染色，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封固，光学显微镜下观察，凋亡阳性细胞呈棕黄色，在光学显微镜下计数，5个高倍视野中凋亡阳性心肌细胞数量占总细胞数量为细胞凋亡阳性指数。

1.4.7 ELISA法检测心肌组织肿瘤坏死因子α和白细胞介素10水平称取200 mg心肌组织，加入裂解液，超声裂解30 s，12 000 r/min，4 ℃离心10 min，收集上清，置于-20 ℃保存，加入100 µL蛋白质于96孔板中，37 ℃孵育30 min，PBS洗涤3次，滤纸吸干，加入一抗，37 ℃孵育20 min，PBS洗涤，加酶标二抗，37 ℃ 10 min，加入底物显色，终止液终止反应，酶标仪在450 nm处测吸光度值。

1.4.8 蛋白免疫印迹检测RhoA、ROCK1、ROCK2、Bax和Bcl-2蛋白的表达按1.4.7方法提取蛋白质。BCA定量法检测蛋白浓度，待测样品和Loading buffer混合，100 ℃水浴变性5 min，然后加入至制备好的SDS-PAGE凝胶(5%浓缩胶，10%分离胶)上样孔中，每孔25 μL，浓缩胶时调整电压为60 V，分离胶电压为120 V，结束后取出凝胶，4 ℃转膜1.5 h，采用5%脱脂奶粉封闭PVDF膜2 h，加入一抗，4 ℃过夜，TBST洗膜后加入辣根过氧化物标记的羊抗兔IgG，37 ℃孵育2 h，加入ECL显影，采用自动凝胶成像系统采集图像，以GAPDH作为内参，分析蛋白水平。

1.5 主要观察指标 ①谷草转氨酶、磷酸肌酸激酶、乳酸脱氢酶水平；②心肌组织病理变化；③TUNEL法观察心肌细胞凋亡情况；④ELISA法检测心肌组织肿瘤坏死因子α和白细胞介素10水平；⑤Western blot检测心肌组织RhoA、ROCK1、ROCK2、Bax和Bcl-2蛋白的表达。

1.6 统计学分析数据统计采用SPSS 17.0软件，作图工具采用Graphpad5.01，组间比较采用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

机体超负荷过度运动可导致心肌发生病理性改变，陈淦等^[10]对大鼠进行力竭运动训练8周，发现大鼠心肌组织横纹不清或消失，心肌细胞出现纤维断裂、线粒体严重变形等病理学变化。研究证实，运动预适应具有降低心肌缺血再灌注损伤，改善心肌功能的作用^[11-12]。赵沐霖^[13]发现大鼠大强度力竭运动前进行运动预适应，可以明显减轻力竭运动所致的心肌损伤。李翠霞等^[14]对大鼠进行间歇性游泳运动2周诱导运动预适应，结束后进行一次力竭运动，发现运动预适应诱导的保护效应可以显著减轻心肌缺血缺氧病变程度。目前关于运动预适应对心肌的保护机制尚未研究清楚。Rho/ROCK信号通路是机体内与细胞生长、增殖、分化有关的信号通路，机体的多种病理及生理过程都有其参与。Rho/ROCK信号主要包括Rho蛋白、ROCK1和ROCK2蛋白，其作用机制是通过上调上下游系列蛋白实现的^[15-16]。该研究采用力竭运动构建心肌细胞损伤模型，探讨运动预适应对心肌损伤的保护作用，同时分析其对Rho/ROCK信号通路的调控作用。

心肌损伤是一种以心功能障碍为主要临床症状的疾病，文献报道称心肌损伤主要表现为心功能异常^[17-19]，1%的心肌细胞损伤将会导致谷草转氨酶、磷酸肌酸激酶、乳酸脱氢酶水平成倍增长。该研究中利用全生化自动分析仪检测显示单纯力竭运动组的谷草转氨酶、磷酸肌酸激酶、乳酸脱氢酶水平显著高于安静对照组，提示心功能受到了严重的损害，而运动预适应+力竭运动组的上述3种酶的水平显著低于单纯力竭运动组，说明运动预适应具有保护大鼠心功能的作用。心肌损伤发病机制尚无定论，文献报道称心肌细胞凋亡对心肌细胞损伤的发生发展起着重要作用^[20-21]，心肌细胞过度凋亡会引发心肌组织的缺血缺氧变化，改变正常的心肌细胞形态，造成心功能障碍，因此阻断心肌细胞凋亡成为改善心功能的重要方向。苏木精-碱性复红-苦味酸染色利用缺血缺氧心肌的亲复红性原理，可以清楚地显示心肌组织的缺血缺氧改变，且具有特异性，是一种常用的心肌缺血缺氧形态学检测指标^[22]。该研究苏木精-碱性复红-苦味酸染色结果显示单纯力竭运动组心肌细胞界限不清楚，呈现出较多斑块状或片状艳红色区域，与安静对照组相比，有明显的缺血缺氧改变，且平均吸光度值明显升高，提示力竭运动导致大鼠心肌形态结构发生改变，引起严重缺血缺氧损伤；而运动预适应+力竭运动组心肌细胞部分界限不清楚，出现部分斑块状艳红色染色，较单纯力竭运动组缺血缺氧程度明显降低，同时运动预适应+力竭运动组的平均吸光度值明显降低，提示运动预适应对大鼠心肌产生保护作用，可以明显减轻力竭运动所致的心肌损伤。既往研究结果显示运动预适应可以明显降低细胞凋亡^[23]，该研究中TUNEL染色结果显示单纯力竭运动组大鼠心肌细胞凋亡明显，凋亡指数明显高于安静对照组；而运动预适应+力竭运动组与单纯力竭运动组相比凋亡指数明显下降。Bax作为促凋亡基因，主要通过与线粒体结合，促进其释放促凋亡蛋白诱导凋亡，而Bcl-2则会阻止Bax与线粒体结合，从而抑制细胞凋亡^[24-25]，该研究结果显示单纯力竭运动组的Bcl-2/Bax显著低于安静对照组，运动预适应+力竭运动组Bcl-2/Bax显著高于单纯力竭运动组，进一步提示运动预适应在心肌细胞凋亡中的重要作用。

文献报道称Rho/ROCK信号通路通过整合炎症递质介导的生物学效应^[26-27]，机体发生炎性刺激后释放白细胞介素1、白细胞介素10、肿瘤坏死因子α多种细胞因子活化该信号通路，通过一系列激酶活性逐级放大，影响细胞炎症因子反应，改善心脏细胞的功能状态。研究发现，病理性心脏重构与Rho/ROCK信号通路激活存在重要关联，抑制通路活性可以介导抗氧化、抗炎等多种作用，从而改善心肌结构损伤，表现出对心脏的保护作用^[28-29]。该研究结果显示采用力竭运动诱导心肌损伤模型后白细胞介素10、肿瘤坏死因子α水平明显升高，同时Rho/ROCK信号通路中特异性蛋白RhoA、ROCK1、ROCK2明显升高，从而提示炎症因子激活Rho/ROCK信号通路参与了心肌细胞的发生发展，而运动预适应+力竭运动组的白细胞介素10、肿瘤坏死因子α以及RhoA、ROCK1、ROCK2水平明显降低，说明运动预适应可能是通过抑制Rho/ROCK信号通路，进而改善心肌结构损伤，来保护心功能。

综上所述，运动预适应对心肌损伤具有保护作用，可改善大鼠的心脏功能，其作用机制可能与Rho/ROCK通路有关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

运动预适应与力竭运动大鼠心肌损伤：Rho/ROCK信号通路的作用

Exercise preconditioning for myocardial injury in rats after exhaustive exercise based on Rho/ROCK pathway

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