葛根总黄酮干预长时耐力运动后再力竭运动大鼠脑组织β-连环蛋白及糖原合成酶激酶3β的表达

doi:10.12307/2022.120

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (5): 736-741.doi: 10.12307/2022.120

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葛根总黄酮干预长时耐力运动后再力竭运动大鼠脑组织β-连环蛋白及糖原合成酶激酶3β的表达

莫伟彬1，2，黄天昌1，曾智伟1，燕林博1

1广西师范大学体育与健康学院，广西壮族自治区桂林市 541004；2药用资源化学与药物分子工程国家重点实验室，广西壮族自治区桂林市 541004

收稿日期:2020-11-09 修回日期:2020-11-13 接受日期:2020-12-14 出版日期:2022-02-18 发布日期:2021-11-03
通讯作者: 曾智伟，副教授，广西师范大学体育与健康学院，广西壮族自治区桂林市 541004
作者简介:莫伟彬，男，1979年生，广西壮族自治区贵港市人，汉族，2010年广西师范大学毕业，硕士，高级实验师，主要从事运动生理学与训练研究。
基金资助:
广西教育厅科研项目(2021KY1596)，项目参与人：莫伟彬；广西教育厅科研项目(2018KY0090)，项目负责人：莫伟彬；教育发展基金会“教师成长基金”项目(EDF2016005)，项目负责人：莫伟彬；国家重点实验室开放项目(CMEMR2012-B04)，项目负责人：莫伟彬

Effects of Pueraria lobata flavonoids on expressions of beta-catenin and glycogen synthase kinase 3beta in the brain of rats undergoing exhaustive exercise after long endurance exercise

Mo Weibin1, 2, Huang Tianchang1, Zeng Zhiwei1, Yan Linbo1

1College of Physical Education and Health, Guangxi Normal University, Guilin 541004, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 2State Key Laboratory of Medicinal Resources Chemistry and Molecular Engineering, Guilin 541004, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Received:2020-11-09 Revised:2020-11-13 Accepted:2020-12-14 Online:2022-02-18 Published:2021-11-03
Contact: Zeng Zhiwei, Associate professor, College of Physical Education and Health, Guangxi Normal University, Guilin 541004, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Mo Weibin, Master, Senior experimentalist, College of Physical Education and Health, Guangxi Normal University, Guilin 541004, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; State Key Laboratory of Medicinal Resources Chemistry and Molecular Engineering, Guilin 541004, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
Scientific Research Projects of Guangxi Provincial Education Department, No. 2021KY1596 (to MWB [project participant]) and 2018KY0090 (to MWB); Education Development Foundation for Teacher Growth Project, No. EDF2016005 (to MWB); State Key Laboratory Open Project, No. CMEMR2012-B04 (to MWB)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
β-连环蛋白：是果蝇Armadillo(arm)蛋白的同源物，分为α、β、γ 3个亚型，含有781个氨基酸，分子质量72-95 kD，它是定位于人染色体3p22-p21.3上的一种多功能蛋白质，是Wnt信号通路中最关键的通道传递分子，具有调控细胞因子、转录激活蛋白、修复大脑神经血管与再生等作用。
大脑缺氧：缺氧是指氧气缺乏症，即空气中缺氧或氧气缺乏状态的总称。大脑缺氧就是脑细胞缺乏内源氧。长时间大脑缺氧会造成不可逆转的损害，甚至脑死亡。一般性的“体内缺氧”，即使不会直接发生生命危险，也会对身体健康造成损伤。

背景：长时间的力竭运动易引起大鼠缺血缺氧，致使脑组织损伤，葛根总黄酮具有保护大鼠心脑血管、改善脑损伤神经和抗氧化等作用，但运动前补充葛根总黄酮是否达到保护脑组织作用目前尚不明确。
目的：观察葛根总黄酮对运动大鼠脑组织病理改变和β-连环蛋白及糖原合成酶激酶3β表达的影响。
方法：将50只SD雄性大鼠随机分为安静对照组、运动对照组、葛根总黄酮低、中、高剂量组。除安静对照组外，其余各组大鼠进行为期6周的运动训练，于6周末即最后一次训练达到力竭。葛根总黄酮低、中、高剂量组大鼠均在运动前20 min灌胃50，100，200 mg/kg的葛根总黄酮，1次/d，直到实验结束。苏木精-伊红染色观察脑组织病理学变化，免疫组织化学法、RT-PCR法及Western blot法测定β-连环蛋白和糖原合成酶激酶3β表达。
结果与结论：①光镜观察运动对照组大鼠脑皮质和海马区有部分神经细胞胞体肿胀、胞体收缩、脑膜或室管膜显现水肿、充血和出血等现象，葛根总黄酮低剂量组有水肿、充血和出血等轻微症状，而中、高剂量组大鼠脑组织病理变化与安静对照组比较无明显差异；②免疫组织化学染色显示，运动对照组大鼠脑组织β-连环蛋白和糖原合成酶激酶3β表达均高于安静对照组(P < 0.01)，葛根总黄酮中、高剂量组大鼠脑组织β-连环蛋白和糖原合成酶激酶3β表达均低于运动对照组(P < 0.01)；③运动对照组大鼠脑组织β-连环蛋白、糖原合成酶激酶3β mRNA及蛋白表达均高于安静对照组(P < 0.05或P < 0.01)；葛根总黄酮中、高剂量组大鼠脑组织β-连环蛋白、糖原合成酶激酶3β mRNA及蛋白表达均低于运动对照组(P < 0.05或P < 0.01)；④结果表明，力竭运动引起大鼠脑组织损伤和β-连环蛋白、糖原合成酶激酶3β表达上调，葛根总黄酮可能是通过下调β-连环蛋白和糖原合成酶激酶3β的表达进而有效改善大鼠脑组织损伤，从而达到保护脑组织的作用。

https://orcid.org/0000-0001-5303-2960 (莫伟彬)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 葛根总黄酮, 力竭运动, 脑组织, β-连环蛋白, 糖原合成酶激酶3β, 通路, 大鼠

Abstract: BACKGROUND: Prolonged exhaustive exercise can easily cause ischemia and hypoxia in rats, leading to brain tissue damage. Pueraria lobata flavonoids can exert a series of roles, including cardiovascular and cerebrovascular protections, improvement of brain damage and anti-oxidation. However, whether supplementation of Pueraria lobata flavonoids prior to exercise can protect the brain tissue is still unclear.
OBJECTIVE: To observe the effect of total flavonoids in Pueraria lobata on histopathological changes and expressions of β-catenin and glycogen synthase kinase 3β in rats undergoing exercises.
METHODS: Fifty Sprague-Dawley male rats were randomly divided into five groups: a quiet control group, an exercise control group, and low-, medium-and high-dose groups of total flavonoids in Pueraria lobata. Except the quiet control group, the remaining groups were trained for 6 weeks, while the last training reached exhaustion on the 6th weekend. In the low-, middle- and high-dose groups, all the rats were given 50, 100, 200 mg/kg total flavonoids in Pueraria lobata by gavage at 20 minutes before the experiment once a day until the end of the experiment. In all the groups, hematoxylin-eosin staining was used to observe the histopathological changes of the brain, and immunohistochemistry, PCR and western blot were used to determine the expressions of β-catenin and glycogen synthase kinase 3β.
RESULTS AND CONCLUSION: Under the light microscope, in the exercise control group, some nerve cells in the cerebral cortex and hippocampus became swollen and contracted, and there were edema, hyperemia and bleeding in the meninges or ependymal membranes. The low-dose group appeared to have some mild symptoms, such as edema, congestion and hemorrhage. However, the pathological changes in the brain tissue of rats in the middle- and high-dose groups were not significantly different from those in the quiet control group. Immunohistochemical staining showed that the expression levels of β-catenin and glycogen synthase kinase 3β in the brain tissue of the exercise control group were higher than those in the quiet control group (P < 0.01). In the middle- and high-dose group, the expression levels of β-catenin and glycogen synthase kinase 3β in the brain tissue were lower than those of the exercise control group (P < 0.01). The mRNA and protein expressions of β-catenin and glycogen synthase kinase 3β in the brain tissue of the exercise control group were higher than those in the quiet control group (P < 0.05 or P < 0.01). The expressions of β-catenin and glycogen synthase kinase 3β mRNA and protein in the middle- and high-dose groups were lower than those in the exercise control group (P < 0.05 or P < 0.01). To conclude, exhaustive exercise could give rise to damage in the rat brain tissue, and upregulate the expressions of β-catenin and glycogen synthase kinase 3β, whereas the total flavonoids in Pueraria lobata may effectively reduce damage to the rat brain tissue by regulating the expressions of β-catenin and glycogen synthase kinase 3β, thereby protecting the brain tissue.

Key words: total flavonoids in Pueraria lobata, exhaustive exercise, brain tissue, β-catenin, glycogen synthase kinase 3β, pathway, rat

中图分类号:

莫伟彬, 黄天昌, 曾智伟, 燕林博. 葛根总黄酮干预长时耐力运动后再力竭运动大鼠脑组织β-连环蛋白及糖原合成酶激酶3β的表达[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 736-741.

Mo Weibin, Huang Tianchang, Zeng Zhiwei, Yan Linbo. Effects of Pueraria lobata flavonoids on expressions of beta-catenin and glycogen synthase kinase 3beta in the brain of rats undergoing exhaustive exercise after long endurance exercise[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(5): 736-741.

图/表（结果） 8

2.1 实验动物数量分析实验选用SD大鼠50只，随机分为5组，每组10只，实验过程中无脱失，全部进入结果分析。
2.2 组织病理形态学分析安静对照组大鼠脑皮质和海马区细胞排列整齐，组织结构与层次未见病变，脑膜或室管膜未见水肿、充血和出血等现象；力竭运动对照组大鼠脑皮质和海马区部分神经细胞胞体肿胀、胞体收缩、脑膜或室管膜显现水肿、充血和出血等现象；葛根总黄酮低剂量组大鼠脑组织病变程度比力竭运动对照组大鼠轻，但脑膜或室管膜还显现水肿、充血和出血等现象；葛根总黄酮中剂量组和高剂量组大鼠脑组织皮质区细胞排列整齐，灰、白质细胞和间质未见水肿、充血和出血等现象，与安静对照组比较无明显差异，见图1。

2.3 免疫组织化学染色检测各组大鼠脑组织β-连环蛋白、糖原合成酶激酶3β表达由图2，图3和表2可见，运动对照组大鼠脑组织β-连环蛋白表达高于安静对照组(P < 0.01)，葛根总黄酮低剂量组大鼠脑组织β-连环蛋白表达高于安静对照组(P < 0.01)而低于运动对照组(P < 0.05)，葛根总黄酮中剂组和高剂量组大鼠脑组织β-连环蛋白表达均低于运动对照组(P < 0.05或P < 0.01)，葛根总黄酮高剂量组大鼠脑组织β-连环蛋白表达低于葛根总黄酮低剂量组(P < 0.05)。运动对照组和葛根总黄酮低剂量组大鼠脑组织糖原合成酶激酶3β表达均高于安静对照组(P < 0.01)，葛根总黄酮中剂量组和高剂量组大鼠脑组织糖原合成酶激酶3β表达均低于运动对照组(P < 0.01)，而葛根总黄酮中剂量组大鼠脑组织糖原合成酶激酶3β表达高于安静对照组(P < 0.01)，葛根总黄酮高剂量组大鼠脑组织糖原合成酶激酶3β表达低于葛根总黄酮低剂量组(P < 0.05)。

2.4 大鼠脑组织β-连环蛋白、糖原合成酶激酶3β mRNA表达由图4和表3可见，运动对照组和葛根总黄酮低剂量组大鼠脑组织β-连环蛋白 mRNA表达均高于安静对照组(P < 0.01)，葛根总黄酮中、高剂量组大鼠脑组织β-连环蛋白 mRNA表达均低于运动对照组(P < 0.01)，中、高剂量组大鼠脑组织β-连环蛋白mRNA表达均低于低剂量组(P < 0.01)。运动对照组和葛根总黄酮低剂量组大鼠脑组织糖原合成酶激酶3β mRNA表达均高于安静对照组(P < 0.05)，葛根总黄酮中、高剂量组大鼠脑组织糖原合成酶激酶3β mRNA表达均低于运动对照组(P < 0.05)，中、高剂量组大鼠脑组织糖原合成酶激酶3β mRNA表达均低于低剂量组(P < 0.05)。

2.5 大鼠脑组织β-连环蛋白、糖原合成酶激酶3β蛋白表达由图5和表4可见，运动对照组和葛根总黄酮低剂量组大鼠脑组织β-连环蛋白表达均高于安静对照组(P < 0.01)，葛根总黄酮中、高剂量组大鼠脑组织β-连环蛋白表达均低于运动对照组(P < 0.01)，中、高剂量组大鼠脑组织β-连环蛋白表达均低于低剂量组(P < 0.01)。运动对照组和葛根总黄酮低剂量组大鼠脑组织糖原合成酶激酶3β蛋白表达均高于安静对照组 (P < 0.05)，葛根总黄酮中、高剂量组大鼠脑组织糖原合成酶激酶3β 蛋白表达均低于运动对照组(P < 0.05或P < 0.01)，中、高剂量组大鼠脑组织糖原合成酶激酶3β蛋白表达均低于低剂量组(P < 0.01)。

参考文献

[1] TATEMOTO T, TANAKA S, MAEDA K, et al. Skillful Cycling Training Induces Cortical Plasticity in the Lower Extremity Motor Cortex Area in Healthy Persons. Front Neurosci. 2019;13:927.
[2] 陈双.低氧训练对肥胖大鼠脑组织线粒体能量代谢的影响[D].西安:西安体育学院,2016.
[3] 杨丽君,崔红.缺血低氧性脑损伤对未成熟新生大鼠神经元和髓鞘的影响[J].中国现代医生,2017,55(25):30-32.
[4] 刘猛.急性力竭运动大鼠脑皮质运动区组织中caspase-3的表达[J].新乡医学院学报,2017,34(1):22-25.
[5] 刘利江,熊正英.补充竹叶提取物对大强度运动大鼠脑组织生化指标的影响[J].浙江农业学报,2013, 25(5):961-964.
[6] 方雯,李泽,刘晓华,等.一次性力竭运动对大鼠PHB1表达及线粒体功能的影响[J].中国应用生理学杂志,2017,33(6):544-549.
[7] 王轲,张晓琴,刘军,等.沙苑子对运动训练大鼠脑组织的保护作用及机制[J].陕西师范大学学报(自然科学版),2018,46(5):126-130.
[8] TANG Y, ZHANG Y, ZHENG M, et al. Effects of treadmill exercise on cerebral angiogenesis and MT1-MMP expression after cerebral ischemia in rats. Brain Behav. 2018;8(8):e01079.
[9] 张瑞婷,周涛,宋潇潇,等.葛根的活性成分及其药理作用研究进展[J].安徽农学通报,2018,24(1):15-17.
[10] 孙华,李春燕,薛金涛.葛根的化学成分及药理作用研究进展[J].新乡医学院学报,2019,36(11):1097-1011.
[11] 王兰,蓝璟,龚频,等.葛根异黄酮降血糖活性及作用机制的研究[J].食品科技,2017,42(3):223-226.
[12] 孟淑辉,李国铭,冯梅,等.葛酮通络胶囊治疗脑梗死的作用机制及不良反应[J].中国药理学通报,2019,35(8):1058-1060.
[13] 刘英辉,周东方,金国华,等.葛根素对急性肝衰竭小鼠的治疗作用及其作用机制[J].中国比较医学杂志,2019,29(8):68-74.
[14] 徐叔云.药理试验方法学(第3版)[M].北京:人民卫生出版社,2005.
[15] BEDFORD TG, TIPTON CM, WILSON NC, et al. Maximum oxygen consumption of rats and its changes with various experimental procedures. J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol. 1979;47(6): 1278-1283.
[16] 莫伟彬,杨衍滔,郭艳菊,等.益生菌干预对运动大鼠胃肠激素与AQP4表达的影响[J].中国实验动物学报,2018,26(4):411-417.
[17] HUANG L, XIANG M, YE P, et al. Beta-catenin promotes macrophage-mediated acute inflammatory response after myocardial infarction. Immunol Cell Biol. 2018;96(1):100-113.
[18] QIU F, SHIN Y, CHEN D, et al. Anti-angiogenic effect of a humanized antibody blocking the Wnt/beta-catenin signaling pathway. Microvasc Res. 2018;119:29-37.
[19] PAZHOHAN A, AMIDI F, AKBARI-ASBAGH F, et al. The Wnt/β-catenin signaling in endometriosis, the expression of total and active forms of β-catenin, total and inactive forms of glycogen synthase kinase-3β, WNT7a and DICKKOPF-1. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2018;220:1-5.
[20] SALEHI A, JULLIENNE A, BAGHCHECHI M, et al. Up-regulation of Wnt/β-catenin expression is accompanied with vascular repair after traumatic brain injury. J Cereb Blood Flow Metab. 2018;38(2):274-289.
[21] 盛宝英,姜尧佳,李莹,等. Wnt/β-catenin信号调控对海马区Aβ1-42诱导的神经干细胞损伤的影响[J]. 黑龙江医药科学,2017,40(6): 101-103.
[22] 张吉芳,韩冰,孙国栋.电针干预对大鼠脑缺血再灌注损伤的神经保护作用及其机制[J].山东医药,2019, 59(19):35-38.
[23] 赵慧,张利,何标,等.运动激活Wnt/β-catenin信号通路转运清除脑内Aβ的机制[J].南京体育学院学报(自然科学版),2017,16(1): 23-27,51.
[24] CHEN D, ZHANG Y, ZHANG M, et al. Exercise Attenuates Brain Aging by Rescuing Down-Regulated Wnt/β-Catenin Signaling in Aged Rats. Front Aging Neurosci. 2020;12:105.
[25] KIM DY, JUNG SY, KIM K, et al. Treadmill exercise ameliorates Alzheimer disease-associated memory loss through the Wnt signaling pathway in the streptozotocin-induced diabetic rats. J Exerc Rehabil. 2016;12(4):276-283.
[26] SHARMA AK, THANIKACHALAM PV, BHATIA S. The signaling interplay of GSK-3beta in myocardial disorders. Drug Discov Today. 2020;25(4): 633-641.
[27] MA R, WEI Y, HUANG X, et al. Inhibition of GSK 3β activity is associated with excessive EZH2 expression and enhanced tumour invasion in nasopharyngeal carcinoma. PLoS One. 2013;8(7):e68614.
[28] 余锋,贾芳芳.运动调控GSK-3β介导阿尔茨海默症的机制探析[J].南京体育学院学报,2020,19(2):52-59.
[29] 房国梁,李鹏飞,于涛,等.急性有氧运动对大鼠海马组织PI3K/Akt /GSK3β信号通路的影响[J].北京体育大学学报,2016,39(4):55-59.
[30] BAYOD S, MENNELLA I, SANCHEZ-ROIGE S, et al. Wnt pathway regulation by long-term moderate exercise in rat hippocampus. Brain Res. 2014;1543:38-48.
[31] 阳晓晴,唐雪梅,苏湲淇,等.绞股蓝总苷对慢性脑缺血大鼠海马神经元的保护作用及其机制研究[J].中国现代应用药学,2019, 36(12):1487-1491.
[32] 夏杰,刘微娜,漆正堂. GSK3β/β-catenin信号通路在运动和氟西汀改善CUMS小鼠抑郁行为中的作用机制[J].西安体育学院学报, 2019,36(5):610-618,630.
[33] 任增辉.大强度递增负荷运动对大鼠海马细胞凋亡PI3K/AKT信号通路的影响[D].济南:山东体育学院,2015.

引言

人体大脑对机体内各种反应具有调节和认识的功能，且耗氧量也很大，神经组织的代谢能力也极高，但由于大脑组织的能源贮备极限性，脑组织对缺氧的耐受性极差。研究表明，合理的有氧运动是抗氧化损伤、改善脑损伤神经和提高机体内氧摄取、运输及利用的最有效方式[1]。陈双[2]研究表明低氧与运动的叠加刺激能够提高氧的运输能力和脑组织线粒体的氧化呼吸链；杨丽君等[3]研究发现缺血缺氧导致新生小鼠脑组织神经和髓鞘损伤；刘猛[4]研究发现，运动强度越大，大鼠脑皮质运动区细胞凋亡越明显；刘利江等[5]研究发现长时间的大强度运动训练后大鼠脑组织自由基增加，造成器官缺氧性损伤；方雯等[6]研究发现一次性力竭运动后大鼠脑组织线粒体功能减弱，能量代谢降低。但最近有研究发现，长时间的高强度或超负荷运动训练后，机体脑组织发生缺血缺氧或局部脑组织细胞受损，使脑组织发生不同程度炎症反应[7-8]。葛根是常用的药食两用传统中药材之一，具有很高的营养食用和保健以及药用价值[9]，而葛根总黄酮是豆科植物野葛或甘葛藤的葛根(干燥根)乙醇提取物，其有效成分是异黄酮类化合物(葛根素、葛根甙、大豆苷和大豆素等)[9]，具有保护心脑血管、改善脑损伤神经[10]、降血糖和血脂[11]、抗氧化[12]、保护肝脏等作用[13]。该实验通过建立力竭性运动大鼠模型，探究补充葛根总黄酮对运动训练大鼠脑组织病理形态学及β-连环蛋白(beta-catenin，β-catenin)及糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β)表达变化，为进一步研究葛根总黄酮用于运动营养补剂的开发与利用提供实验依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计完全随机分组，模型对照动物实验；组织结构、细胞功能检测数据采用单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2019年7月至2020年9月在广西师范大学体育与健康学院及药用资源化学与药物分子工程国家重点实验室完成。
1.3 材料 10周龄SD雄性大鼠50只(SPF级)，体质量210-240 g，由桂林医学院动物教学中心提供，许可证号：SCXK(桂)2013-0001。所有大鼠在广西师范大学体育学院动物房内饲养和训练，许可证号：SYXK(桂)2013-0021。饲养期间所有大鼠自由饮食，室内温度20-25 ℃，湿度45%-55%。实验操作均符合实验动物伦理学要求(GXMU201902038)。葛根总黄酮(pueraria total flavone，PTF，总黄酮含量≥80%)购于南京景竹生物科技有限公司(批号：2019032)。
1.4 方法
1.4.1 动物分组及给药量大鼠适应性饲养1周后，按随机分组法将大鼠分为5组，每组10只：安静对照组、运动对照组、运动+葛根总黄酮低剂量组、中剂量组和高剂量组。灌胃的量和浓度根据徐叔云主编的《药理试验方法学》设定[14]，不同剂量葛根总黄酮组均在运动前20 min采用灌胃器灌胃葛根总黄酮10.0 mL/kg，浓度分别为50，100，200 mg/kg，1 次/d，每周6 次，周日休息，共持续6 周。
1.4.2 动物模型制作与取材运动方案参照BEDFORD等[15-16]设计，大鼠适应性饲养1周后开始实验，安静对照组不做任何运动，运动对照组和运动+葛根总黄酮组适应性跑台运动3 d后，正式运动设定跑台速度为19.3 m/min(76%的VO2 max左右)，坡度为5°，1次/d，每次训练40 min，6 d/周，周日休息，连续训练6周，于6周末即最后一次训练达到力竭，并记录力竭时间。力竭判断标准：连续对大鼠进行光、声、电和机械刺激后，大鼠臀部压在跑台后壁上并伏地喘息，不能完成翻正。力竭运动结束后即刻用20%乌拉坦溶液(2.5 mL/kg)麻醉后迅速解剖取脑组织，经生理盐水处理投入液氮速冻，然后转入-80 ℃冰箱保存，用于后续检测。

1.4.3 光镜观察大鼠脑组织病理形态各组大鼠脑组织经 40 g/L多聚甲醛固定24 h后，梯度乙醇和二甲苯脱水，然后进行石蜡包埋，制备5 μm厚度切片，切片依次通过脱蜡、复水、苏木精染色、分化、返蓝、伊红染色、脱水、透明、封固等过程，进行苏木精-伊红染色，显微镜观察。
1.4.4 免疫组织化学染色将大鼠脑组织进行切片、脱蜡、复水、抗原修复、双氧水封闭；滴加一抗β-连环蛋白(1∶100)、糖原合成酶激酶3β(1∶100)后于4 ℃冰箱过夜，PBS浸洗；滴加二抗，DAB常温显色，待目标出现阳性后，PBS水洗终止反应；冰冻切片进行脱水、苏木精复染、二甲苯透明及中性树胶封固，显微镜观察拍照；采用Image-pro Plus 6.0图像分析软件进行定量分析，所得数据为免疫组织化学染色阳性信号累积吸光度，以累积吸光度值作为表达定量标准，累积吸光度=平均吸光度×阳性面积。
1.4.5 大鼠脑组织β-连环蛋白、糖原合成酶激酶3β mRNA及蛋白表达的测定
(1)β-连环蛋白、糖原合成酶激酶3β mRNA 测定：取各组大鼠脑组织200 mg研碎致匀浆化，再根据Trizol说明书的方法提取脑组织总RNA；经紫外分光光度计检测RNA的纯度，A260/A280比值为1.8-2.0。利用PCR仪根据其说明书将mRNA反转录为cDNA，取各组合成的cDNA 2.5 μL和β-连环蛋白、糖原合成酶激酶3β和β-actin mRNA上、下游引物各0.5 μL，按照RT-PCR试剂盒说明书检测，其引物信息见表1，最后取10 μL转录产物于2.0%琼脂糖凝胶模板电泳(95 V， 75 min)，结果用β-连环蛋白或糖原合成酶激酶3β/β-actin比值来表示。

(2)β-连环蛋白、糖原合成酶激酶3β 蛋白表达：取各组大鼠脑组织200 mg在液氮中充分研磨，用BCA试剂盒(编号：P0012S，上海碧云天生物技术有限公司)进行蛋白提取并进行蛋白定量，然后取30 µL总蛋白上样并进行电泳(80 V， 30 min)，将蛋白转移至PVDF膜上(4 V，100 mA，转印2 h)，封闭过夜，加入β-连环蛋白抗体(1∶1 000)、糖原合成酶激酶3β抗体(1∶500)和内参蛋白β-actin抗体(1∶500) 4 ℃孵育过夜，加入羊抗鼠(二抗)IgG-Biotin(1∶200)室温孵育2 h，0.1%TBST漂洗3×5 min，ECL化学发光显影、定影，结果以目的蛋白灰度值/β-actin灰度值(Image Lab 6.0， Bio-Rad，美国)来表示。
1.5 主要观察指标 ①大鼠脑组织病理学变化；②免疫组织化学法、RT-PCR法及Western blot法检测大鼠脑组织β-连环蛋白和糖原合成酶激酶3β表达。
1.6 统计学分析采用SPSS 19.0统计软件处理，计量资料用x±s表示，组间差异采用单因素方差分析，组间比较采用多重比较，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

3.1 葛根总黄酮对运动大鼠脑组织病理学变化及β-连环蛋白表达的影响 β-连环蛋白是果蝇Armadillo(arm)蛋白的同源物，分为α、β、γ 3个亚型，含有781个氨基酸，分子质量72-95 kD，它是定位于人染色体3p22-p21.3上的一种多功能蛋白质[17]，是Wnt信号通路中最关键的通道传递分子，具有调控细胞因子、转录激活蛋白、修复大脑神经血管与再生等作用[18-19]。SALEHI等[20]发现β-连环蛋白可调控脑缺血后脑组织的血脑屏障稳态和血管的生成以及脑神经的调控。盛宝英等[21]研究发现β-连环蛋白能够抑制β-淀粉样蛋白1-42，减轻神经干细胞损伤，从而改善大脑的认知功能；张吉芳等[22]研究发现大鼠脑组织缺血时β-连环蛋白表达上升，通过电针干预后大鼠脑组织β-连环蛋白表达下降，从而达到保护脑神经的作用。在运动方面，不同的运动强度对β-连环蛋白表达调节存在差异性。运动能激活Wnt/β-连环蛋白信号通路，激活后脑组织细胞β-连环蛋白表达升高至稳定并在细胞核中转录和外排转运蛋白，防治阿尔茨海默病[23]。CHEN等[24]对大鼠进行12周不同强度的运动干预，研究发现阻力运动和大强度的跑台运动能够激活β-连环蛋白信号通路；KIM等[25]对大鼠进行12周的小强度耐力训练，也表明小强度耐力训练能够激活大鼠脑组织Wnt/β-连环蛋白信号通路，从而清除脑细胞外大量β-淀粉样蛋白的沉积。此研究发现，免疫组织化学染色显示力竭运动对照组大鼠脑组织β-连环蛋白表达高于安静对照组，而在病理状态下运动对照组大鼠大脑皮质和海马区部分神经细胞胞体肿胀、胞体收缩、脑膜或室管膜显现水肿、充血和出血等现象，进一步检测发现力竭运动对照组大鼠脑组织β-连环蛋白mRNA和蛋白表达均高于安静对照组，提示力竭运动引起大鼠脑组织缺血缺氧性损伤和上调了大鼠脑组织中β-连环蛋白表达。通过补充不同剂量的葛根总黄酮后，葛根总黄酮各剂量组大鼠脑组织病理出现不同的变化，特别是中、高剂量组大鼠脑组织的病理形态基本恢复到与安静对照组相似。免疫组织化学检测发现葛根总黄酮中剂量组和高剂量组大鼠脑组织β-连环蛋白阳性表达均低于运动对照组，进一步检测葛根总黄酮各剂量组大鼠脑组织β-连环蛋白mRNA和蛋白表达均低于运动对照组，特别是高剂量组大鼠脑组织β-连环蛋白mRNA和蛋白表达基本上恢复到安静时的表达水平，提示葛根总黄酮可能起到调节β-连环蛋白的表达进而有效降低大鼠缺血缺氧性脑损伤，达到保护大鼠脑组织的作用，但其机制还要有待深入研究。
3.2 葛根总黄酮对运动大鼠脑组织糖原合成酶激酶3β表达的影响长时间的力竭运动易引起大脑缺血缺氧性损伤、脑循环障碍和脑组织代谢紊乱。糖原合成酶激酶3β作为大脑组织的调控因子，它主要是糖原合成酶激酶3蛋白激酶家族成员，由N末端的前134个氨基酸以及C末端343-433个氨基酸组成，相对分子质量为47 000，广泛表达于脑、肝和心肌等组织[26-27]，具有调节糖代谢、细胞传导信号、细胞生长、应答和炎症等作用[28]。房国梁等[29]研究发现急性有氧运动能够在短期内提高大鼠海马组织PI3K/Akt/GSK3β信号通路活性，但BAYOD等[30]研究发现长时间的小强度训练使大鼠脑组织中糖原合成酶激酶3β蛋白表达受到抑制，促进了脑突触可塑性及神经的发生；阳晓晴等[31]对慢性脑缺血大鼠灌胃不同剂量的绞股蓝总苷，发现绞股蓝总苷各剂量组大鼠脑组织糖原合成酶激酶3β表达降低，表明绞股蓝总苷具有保护大鼠脑组织的作用。在运动干预下糖原合成酶激酶3β磷酸化水平上调，提高了β-连环蛋白的稳定性，逆转了糖原合成酶激酶3β信号通路紊乱[32]。此研究苏木精-伊红染色发现大鼠皮质和海马区部分神经细胞胞体肿胀、胞体收缩、脑膜或室管膜显现水肿、充血和出血等现象，提示力竭运动导致大鼠脑组织损伤；力竭运动后上调了大鼠脑组织糖原合成酶激酶3β的表达，这与任增辉[33]研究的结果相一致，这些结果提示长期的力竭运动激活了糖原合成酶激酶3β表达。通过补充不同剂量的葛根总黄酮，下调了大鼠脑组织糖原合成酶激酶3β表达，特别是高剂量组大鼠脑组织病理变化和糖原合成酶激酶3β表达基本上恢复到安静时的水平。据此认为，葛根总黄酮可能具有调节大鼠脑织糖原合成酶激酶3β活性以及对力竭运动大鼠脑组织缺血缺氧性损伤具有一定的治疗和预防作用，但其机制还有待进一步深入研究。
综上所述，葛根总黄酮对长期耐力训练后再做力竭运动大鼠的脑组织损伤具有保护作用，其机制可能与下调β-连环蛋白和糖原合成酶激酶3β表达有关。据此认为，葛根总黄酮可能对运动训练引起缺氧性损伤具有一定的治疗作用，但是何等剂量的葛根总黄酮作用效果较理想，尚需多中心、大样本的研究来进一步证实。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

葛根总黄酮干预长时耐力运动后再力竭运动大鼠脑组织β-连环蛋白及糖原合成酶激酶3β的表达

Effects of Pueraria lobata flavonoids on expressions of beta-catenin and glycogen synthase kinase 3beta in the brain of rats undergoing exhaustive exercise after long endurance exercise

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[1]	王宝娟, 郑曙光, 张琪, 李田洋. 苗药熏蒸治疗膝骨关节炎模型兔可延缓细胞外基质的破坏[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1180-1186.
[2]	项鑫健, 柳芳, 吴亮亮, 贾大平, 陶越, 赵政男, 赵宇. 高剂量维生素C促进大鼠自体脂肪移植成活[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1242-1246.
[3]	梁学振, 杨曦, 李嘉程, 骆帝, 许波, 李刚. 补肾活血胶囊介导Hedgehog信号通路调控大鼠骨髓间充质干细胞成骨成脂分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1020-1026.
[4]	王继芳, 鲍祯, 乔亚红. miR-206调控小细胞肺癌干细胞EVI1基因表达及细胞生物学行为[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1027-1031.
[5]	高俞锦, 彭双麟, 马治超, 陆诗, 曹花月, 王浪, 肖金刚. 糖尿病骨质疏松症模型小鼠脂肪干细胞的成骨能力[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 999-1004.
[6]	范建超, 徐派的, 韩永丽, 文彩玉珠, 张红星, 潘小丽. 电针足三里对功能性消化不良模型大鼠内脏高敏感性的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 663-668.
[7]	李嘉骏, 夏天, 刘佳敏, 陈锋, 陈豪特, 卓映宏, 吴炜锋. 淫羊藿苷调控成骨信号相关通路治疗激素性股骨头缺血性坏死的分子机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 780-785.
[8]	刘进, 李振, 郝慧琴, 王泽, 赵彩虹, 芦文静. 二妙散水提物调控胶原诱导性关节炎大鼠成纤维样滑膜细胞增殖、迁移和炎性因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 688-693.
[9]	冯建波, 李陈诚, 刘金月, 王小敏, 彭笳宸. 金黄色葡萄球菌生物膜克氏针置入建立创伤性大鼠骨髓炎模型[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 700-705.
[10]	李为明, 许青文, 李奕俊, 孙岩波, 崔进, 徐鹏远. 深层海水通过激活PI3K/Akt通路促进糖尿病小鼠创伤的愈合[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 724-729.
[11]	税晓平, 李春莹, 李顺昌, 孙君志, 苏全生. 有氧和抗阻运动干预2型糖尿病大鼠骨骼肌脑源性神经营养因子、核因子κB及炎症指标的表达[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 669-675.
[12]	娜日松, 孙亮, 赵振群, 梁戎, 王鑫. miR-26b调控脂肪酸结合蛋白4介导脂肪细胞分化的分子机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(2): 260-265.
[13]	曹炜, 冒符荣, 胡小华, 杨晓红. N-6甲基腺嘌呤RNA甲基化调控骨髓间充质干细胞的成骨及成脂分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(2): 266-270.
[14]	耿元文, 林琴琴, 李若明, 唐韶慨, 王柏慧, 田振军. 一次性力竭运动模型促进大鼠肾脏NOD样受体蛋白3炎性小体的表达[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(2): 190-196.
[15]	李安安, 姜涛, 詹敏, 蔡宇宁, 宋敏, 李聪聪, 林文政, 张家媛, 刘文刚. 参苓白术散治疗膝骨关节炎作用机制的网络药理学和分子对接技术分析[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(2): 197-204.