miR-206调控小细胞肺癌干细胞EVI1基因表达及细胞生物学行为

doi:10.12307/2022.139

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (7): 1027-1031.doi: 10.12307/2022.139

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miR-206调控小细胞肺癌干细胞EVI1基因表达及细胞生物学行为

王继芳，鲍祯，乔亚红

河南省胸科医院，河南省郑州市 450000

收稿日期:2020-07-03 修回日期:2020-07-07 接受日期:2021-01-11 出版日期:2022-03-08 发布日期:2021-10-29
通讯作者: 乔亚红，硕士，主任医师，河南省胸科医院，河南省郑州市 450000
作者简介:王继芳，女，1982年生，河南省温县人，汉族，2009年郑州大学第一临床学院毕业，硕士，主治医师，主要从事肺癌相关研究。
基金资助:
河南省医学科技攻关计划项目(LHGJ20190727)，项目负责人：王继芳

miR-206 regulates EVI1 gene expression and cell biological behavior in stem cells of small cell lung cancer

Wang Jifang, Bao Zhen, Qiao Yahong

Henan Provincial Chest Hospital, Zhengzhou 450000, Henan Province, China

Received:2020-07-03 Revised:2020-07-07 Accepted:2021-01-11 Online:2022-03-08 Published:2021-10-29
Contact: Qiao Yahong, Master, Chief physician, Henan Provincial Chest Hospital, Zhengzhou 450000, Henan Province, China
About author:Wang Jifang, Master, Attending physician, Henan Provincial Chest Hospital, Zhengzhou 450000, Henan Province, China
Supported by:
Henan Medical Science and Technology Project, No. LHGJ20190727 (to WJF)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
miRNA-206：定位于人类第6号染色体上，最早从骨骼肌中发现，它参与人体中一系列的生物学过程例如细胞增殖、组织器官的生长及肿瘤的发生等。最近大量研究显示miR-206在肿瘤细胞中表达失调，在肿瘤的生长、增殖、凋亡及侵袭、转移、耐药中发挥重要作用。
EVI1：EVI1基因定位于人染色体3q26上，能够与多种重要基因的启动子DNA序列进行有效结合，进而调控基因的转录。EVI1位点可产生剪切变异，与其他基因产生融合。EVI1在正常人骨髓和外周血细胞中均不表达，但在部分恶性肿瘤，如胃癌、白血病中可高表达。
背景：通过对小细胞肺癌体外分选鉴定，可以发现肿瘤干细胞的存在是促使肿瘤细胞恶性增殖的重要因素。肿瘤的发生与细胞内多种分子的异常表达以及靶向基因的调控障碍密切相关。前期研究发现，EVI1具备原癌基因特性，在肺癌中其表达上调。miR-206可靶向调控EVI1基因和蛋白的表达。
目的：探讨miR-206靶向调控EVI1转录基因的表达对小细胞肺癌干细胞增殖和分裂周期的影响。
方法：首先采用miR-206转染实验验证靶向调控EVI1基因，实验分3组：miR-206 mimics组、miR-206 inhibitor组和miR-NC组，分别转染小细胞肺癌干细胞，Western blot法检测细胞中EVI1蛋白的表达。然后采用慢病毒干扰法下调小细胞肺癌干细胞中miR-206表达验证细胞的信号转导通路和生物学行为，实验分3组：pLB-miR-206组、空载体组和对照组，RT-PCR法检测细胞中miR-206和EVI1 mRNA表达水平，Western blot法检测p-Akt和p-JNK蛋白表达，MTT法检测细胞增殖活性，流式细胞术检测细胞周期中分裂细胞和凋亡细胞的百分比。
结果与结论：①miR-206 mimics组Evi1蛋白水平显著高于miR-NC组(P < 0.05)，miR-206 inhibitor组Evi1蛋白水平显著低于miR-NC组(P < 0.05)，提示miR-206可能靶向调控小细胞肺癌干细胞EVI1基因的表达；②经miR-206慢病毒转染后，pLB-miR-206组miR-206和EVI1 mRNA表达水平明显低于空载体组和对照组，p-Akt和p-JNK蛋白表达水平下降，细胞增殖率减少，分裂细胞比例下降(P < 0.05)，提示miR-206可能通过靶向调控小细胞肺癌干细胞中EVI1基因的表达和Akt/JNK信号通路的激活，对细胞增殖和分裂周期产生影响。

https://orcid.org/0000-0002-6372-3500(王继芳)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 肿瘤干细胞, 肺癌干细胞, 小细胞肺癌, miR-206, EVI1基因, 信号通路, 增殖, 细胞周期

Abstract: BACKGROUND: Through sorting and identification of small cell lung cancer in vitro, the existence of tumor stem cells has been shown to be an important factor to promote the malignant proliferation of tumor cells. Tumorigenesis is closely related to the abnormal expression of various molecules in cells and the regulation of targeted genes. Previous studies have found that EVI1 has the characteristics of proto oncogene and can be up-regulated in lung cancer. miRNA-206 can target the expression of EVI1 gene and protein.
OBJECTIVE: To investigate the influence of miRNA-206 on cell proliferation and division cycle by targeted regulating the expression of EVI1 transcription gene in stem cells of small cell lung cancer.
METHODS: Firstly, miRNA-206 transfection experiment was used to verify the targeted regulation of EVI1 gene. The experiment was divided into three groups: miRNA-206 mimics, miR-206 inhibitor, and miR-NC. The expression of EVI1 protein in the stem cells was detected by western blot assay. miRNA-206 lentivirus transfection experiment was used to verify the signal transduction pathway and biological behavior of the cells. The experiment was divided into three groups: pLB-miR-206 group, empty vector group, and control group. The expression levels of miR-206 and EVI1 mRNA in stem cells were detected by RT-PCR. The expression levels of p-Akt and p-JNK protein were detected by western blot assay. The cell proliferation rate was detected by MTT method. Percentage of mitotic and apoptotic cells in cell cycle was detected by flow cytometry.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The Evi1 protein level in the miR-206 mimics group was significantly higher than that in the miR-NC group (P < 0.05), and the Evi1 protein level in the miR-206 inhibitor group was significantly lower than that in the miR-NC group (P < 0.05). It was suggested that miR-206 may target the expression of EVI1 gene in stem cells. (2) After transfection with miRNA-206 lentivirus, the expression levels of miR-206 and EVI1 mRNA in pLB-miR-206 group were significantly lower than those in the empty vector and control groups; the protein expression levels of p-Akt and p-JNK decreased; the cell proliferation rate decreased; and the proportion of cell division cycle decreased (P < 0.05). It was found that miR-206 may target to regulate the expression of EVI1 transcription gene and the activation of Akt/JNK signaling pathway in stem cells of small cell lung cancer, which has an impact on cell proliferation and division cycle.

Key words: stem cells, cancer stem cells, lung cancer stem cells, small cell lung cancer, miR-206, EVI1 gene, signal pathway, proliferation, cell cycle

中图分类号:

王继芳, 鲍祯, 乔亚红. miR-206调控小细胞肺癌干细胞EVI1基因表达及细胞生物学行为[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1027-1031.

Wang Jifang, Bao Zhen, Qiao Yahong. miR-206 regulates EVI1 gene expression and cell biological behavior in stem cells of small cell lung cancer[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(7): 1027-1031.

图/表（结果） 6

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引言

肺癌仍然是世界范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌比例高于70%，相比非小细胞肺癌，小细胞肺癌的总体发生率较低，但是早期恶性程度更强，临床干预效果更差，预后极不理想[1-2]。目前国内外仍然以非小细胞肺癌的基础和临床研究报道为主，对小细胞肺癌的发生机制和临床治疗转归涉及较少，经验相对缺乏。
干细胞具有定向分化和增殖潜能，在肿瘤发生和发展、临床治疗应答、肿瘤复发以及临床预后方面表现出重要作
用[3-4]。通过对小细胞肺癌体外分选鉴定，可以发现肿瘤干细胞的存在是促使肿瘤细胞恶性增殖的重要因素[5]。肿瘤的发生与细胞内多种分子的异常表达以及靶向基因的调控障碍密切相关。EVI1具备原癌基因特性，在髓系血液肿瘤的发生和发展中表达水平明显升高，可能与基因激活有关[6]。采用高通量微阵列基因芯片技术筛选肺癌细胞差异性基因表达，发现EVI1可明显表达上调，提示EVI1基因参与了肺癌的发生[7]。采用生物信息学靶向预测软件计算发现EVI1转录上游位点可与miR-206结合，影响EVI1基因和蛋白的功能表达[8]。
PI3K/Akt通路在参与细胞生长、分化、损伤修复、炎症和应激反应等生命活动中发挥重要作用，在恶性肿瘤的发生和发展中扮演重要角色[9-10]。PI3K/Akt通路过度激活促进了小细胞肺癌干细胞恶性增殖和定向分化[11-12]。
基于此，该研究主要探讨miR-206靶向调控EVI1基因在小细胞肺癌干细胞中的表达是否与Akt/JNK信号通路的激活有关，以及对干细胞增殖和分裂周期的影响，为小细胞肺癌的基因靶向治疗提供新思路。

材料方法

1.1 设计细胞学实验，3组间比较采用单因素ANOVA分析，然后两两组间比较再采用LSD-t检验。
1.2 时间及地点实验于2019年3月至2020年6月在河南省胸科医院基础实验室完成。
1.3 材料小细胞肺癌系H592细胞购自中科院上海细胞库。miR-206 mimics和miRNA-206 inhibitor(美国Sigma公司)；Lipofectamine 2000转染试剂(美国R&D公司)；EVI1蛋白一抗和二抗(中国南京碧云天科技有限公司)；细胞培养基(中国北京中杉金桥生物有限公司)；流式细胞仪(美国BD公司)；96孔细胞板(美国CA公司)；PCR电泳仪(北京六一厂)。
1.4 实验方法
1.4.1 细胞培养参照小细胞肺癌系H592细胞培养说明书步骤进行，妥善解冻后进行离心(1 000×g离心5 min)，用新鲜配制的RPMI1640重悬，转移至新培养瓶中，在37 ℃、体积分数为5%CO2、饱和湿度培养箱中培养，隔天换液，待细胞融合至85%时终止传代，选择第3代细胞经PBS洗涤、重悬在500 μL FACS缓冲液中，加入5 μL CD13-PE和5 μL
CD133-APC抗体混匀，4 ℃避光孵育30 min，弃上清，PBS洗涤，用流式分选仪筛选获得 CD13+CD133+干细胞，调整细胞浓度为1×108 L-1，-80 ℃分装保存，具体步骤可参照文献[13]。
1.4.2 采用miR-206转染实验验证靶向调控EVI1基因实验分3组：miR-206 mimics组(100 nmol/L)、miR-206 inhibitor组
(100 nmol/L)和miR-NC组(100 nmol/L)，分别转染小细胞肺癌干细胞，Western blot法检测干细胞中EVI1蛋白的表达。miR-206 mimics、miR-206 inhibitor、miR-NC分别转染干细胞24 h后离心去除培养基，使用4 ℃预冷的PBS洗涤3遍，加入100 μL PMSF与RIRP按照1∶100比例混匀裂解液，各组均设3个复孔，重复3次。
Western blot法检测EVI1蛋白表达[14]：加入细胞裂解液后以4 000×g离心10 min，静置15 min待分层后取上层清液获得总蛋白。改良Lowrry法(Follin-酚法)对总蛋白定量，取100 μg总蛋白上样进行SDS-PAGE电泳，半干转膜进行蛋白质电泳转移，选用NBT/BCIP显色系统结合相应Marker鉴定目的基因蛋白。
1.4.3 慢病毒载体构建与鉴定查询miRBase数据库获得miRNA-206前体pre-miRNA-206序列(UGC UUC CCG AGG CCA CAU GCU UCU UUA UAU CCC C AUA UGG AUU ACU UUG CUA UGG AAU GUA AGG AAG UGU GUG GUU UCG GCA AGU G)，可选择多个插入位点(一般为3个)建立预筛选载体，然后经PCR扩增后选择稳定高效率表达的慢病毒重组载体。具体程序如下：应用Primer 5.0软件设计多个引物序列，由美国Invitrogen公司合成，PCR扩增pre-miR-206，回收分离纯化PCR产物；回收产物和转移质粒pLB进行双酶切后连接重组，命名为pLB-miR-206；将连接产物转化感受态大肠杆菌，添加适宜培养基后挑取单菌落扩大培养，提取质粒，对质粒进行酶切鉴定。具体步骤可参照文献[15]。
1.4.4 慢病毒载体包装与滴度鉴定根据转染试剂
Lipofectamine 2000操作说明书步骤进行，将包装细胞293FT接种于10 cm培养皿上，然后将pLB-miR-206、pCMVΔ8.91、pMD.G三质粒进行共转染48 h，最后采用荧光显微镜观察转染效率，具体步骤可参照文献[16]。
1.4.5 慢病毒感染干细胞采用慢病毒干扰法下调干细胞中miR-206表达验证细胞的信号转导通路和生物学行为，实验分3组：pLB-miR-206组、空载体组和对照组。取生长期小细胞肺癌干细胞1×108 L-1在含体积分数为10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中培养，根据MOI=3加入浓缩的慢病毒颗粒，加入终质量浓度为8 mg/L聚凝胺，感染6 h后换液，72 h后在荧光显微镜下观察感染情况，具体步骤可参照文献[17]，
采用RT-PCR法检测干细胞中miR-206和EVI1 mRNA表达，Western blot法检测p-Akt和p-JNK蛋白表达，MTT法检测细胞增殖活性，流式细胞术检测细胞周期中分裂细胞和凋亡细胞的百分比。
1.4.6 RT-PCR法检测miR-206和EVI1 mRNA表达水平使用Primer Express 2.0软件设计PCR引物和Taqman探针，提交中山大学达晖生物技术有限公司合成。采用外标法制作标准曲线，标准品选用含有目的基因序列RNA，一步法PCR反应体系，实验操作按试剂盒说明书进行，以2-ΔΔCt表示靶基因的相对表达量。采用美国ABI公司PRISM 7900型荧光定量PCR仪完成，具体步骤可参照文献[18]。miR-206基因序列：上游5'-ATT GGC CTG TGA CTT A-3'，下游5'-TGG CCA AGG TAA CCC A-3'；EVI1基因序列：上游5'-TTG GCC CCA AAA GGG TCG C-3'，下游5'-ATT CCC GGT GTA ACC GCG C-3'。
1.4.7 Western blot法检测p-Akt和p-JNK蛋白表达采用BCA蛋白定量试剂盒对离心提纯后的蛋白样品浓度进行测量，根据内参蛋白β-actin抗体进行剂量标准化。选取30 μg样品蛋白和等量内参蛋白，分别进行冰浴变性，再进行8%SDS-PAGE电泳分离，将分离区带电转移至PVDF膜，滴加大鼠抗人p-Akt和p-JNK蛋白一抗(1∶2 000)静置过夜，PBS洗涤后滴加兔抗大鼠二抗(1∶500)室温孵育4 h，PBS洗涤，ECL显色，结果以样品蛋白与内参蛋白的电泳条带灰度值的比值进行表示，具体步骤可参照文献[19]。
1.4.8 MTT法检测细胞的增殖活性将各组细胞加入96孔细胞培养板中，细胞浓度为1×108 L-1，每组设3个复孔，培养24 h后加入MTT 20 μL(5 g/L)，培养4 h后以2 000×g离心
10 min，弃上清，每孔加入二甲基亚砜200 μL，充分振荡使结晶完全溶解，用酶标仪测量490 nm波长处的吸光度值，具体步骤可参照文献[20]。
1.4.9 流式细胞术检测细胞周期各组细胞加入冷体积分数为70%乙醇3 mL固定，边滴边用力振荡，使细胞分散开，24 h后用PBS洗3遍，在细胞沉淀中加入碘化丙啶染液0.5 mL，
于4 ℃避光放置30 min，快速置于流式细胞仪上检测细胞周期中分裂相与凋亡相细胞的百分比，具体步骤可参照文献[21]。
1.5 主要观察指标各组细胞miR-206和EVI1 mRNA表达水平，p-Akt和p-JNK蛋白表达，细胞增殖活性，细胞周期中分裂细胞和凋亡细胞的百分比。
1.6 统计学分析采用SPSS 20.0统计软件进行统计学处理，计量资料以x±s表示，3组间比较采用单因素ANOVA分析，然后两两组间比较再采用LSD-t检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

小细胞肺癌是肺癌的特殊类型，尽管总体发病率较非小细胞肺癌要低很多，但是临床恶性程度更高，生存预后更差，目前无论是基础研究还是临床试验均较少涉及小细胞肺癌，为此类患者的临床治疗增加了难度。前期研究证实，小细胞肺癌组织中干细胞的存在是促进细胞恶性增殖、凋亡抑制、早期转移的潜在因素，因此，针对小细胞肺癌干细胞的生物学特性进行深入分析，有助于寻找针对性干预靶点。
EVI1基因定位于人染色体3q26上，能够与多种重要基因的启动子DNA序列进行有效结合，进而调控基因的转录。EVI1位点可产生剪切变异，与其他基因产生融合[22]。EVI1在正常人骨髓和外周血细胞中均不表达，但在部分恶性肿瘤，如胃癌、白血病中可高表达[23]。研究指出，胃癌患者外周血中EVI1基因和蛋白表达水平明显上调[24]，与肿瘤临床分期、恶性程度有直接关系。目前，EVI1基因在髓系白血病中的研究较为深入，在肺癌尤其是小细胞肺癌中的具体作用机制还有待深入分析。miRNAs是一类分布广泛、含量丰富的内源性非编码小分子RNA，能够通过碱基配对与靶基因mRNA 3' UTR互补序列结合，进而负性调控转录后基因的表达，降解靶基因，抑制蛋白翻译，从而广泛参与细胞的生长、分化、凋亡等，在个体发育和肿瘤发生等过程中发挥重要作用[25]。
miR-206异常表达与肺癌细胞的增殖、分化、临床表现和预后密切相关，在靶向分子治疗和预后评价方面有良好的应用前景[26-27]。经分子结构分析发现，EVI1转录上游位点可与miR-206结合，影响EVI1基因和蛋白的功能表达。该研究通过类似物转染和慢病毒转染2种方法证实，miR-206可靶向调控EVI1基因和蛋白的功能。PI3K/Akt通路在参与细胞生长和分化、损伤修复、炎症和应激反应等生命活动中发挥重要作用，在恶性肿瘤的发生和发展中扮演重要角色。PI3K/Akt通路过度激活促进了小细胞肺癌干细胞恶性增殖和定向分化。经miR-206慢病毒载体转染后，pLB-miR-206组小细胞肺癌干细胞p-Akt和p-JNK蛋白表达下降，细胞增殖率减少，分裂周期比例下降，提示miR-206表达上调可能影响Evi1基因功能，介导Akt/JNK信号通路激活，进而调控细胞增殖和分裂周期。
关于miR-206调控EVI1基因功能的具体机制认为，启动子甲基化、杂合子缺失或基因扩增可能是miRNA调控的主要参与机制[28-29]。DNA甲基化是研究最深入的一种基因表观修饰方式，正常细胞中抑癌基因启动子区域CpG岛通常处于低水平或未甲基化状态，当DNA发生异常甲基化时，CpG岛中CpG呈高度甲基化状态，导致染色体螺旋程度增加，抑癌基因表达关闭，细胞由静止期转入分裂期[30-31]，同时凋亡活性受到抑制，DNA修复缺陷，血管生成活性增强，细胞黏附抑制功能障碍等，最终导致细胞恶性增殖，形成肿瘤[32-35]。AKT也叫蛋白激酶B，其活性受PI3K调控，JNK是PI3K/AKT通路的重要下游分子，AKT/JNK在多种肿瘤细胞中处于较为活跃的状态，参与肿瘤的恶性增殖、侵袭、耐药以及免疫逃逸等机制[36-40]。
综上所述，miR-206可能通过靶向调控小细胞肺癌干细胞中EVI1转录基因的表达和Akt/JNK信号通路的激活，对细胞增殖和分裂周期产生影响，有望为小细胞肺癌的基因靶向治疗提供重要选择位点。

miR-206调控小细胞肺癌干细胞EVI1基因表达及细胞生物学行为

miR-206 regulates EVI1 gene expression and cell biological behavior in stem cells of small cell lung cancer

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