外用红色诺卡氏菌细胞壁骨架提高脂肪间充质干细胞活性修复糖尿病创面

doi:10.12307/2022.141

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (7): 1038-1044.doi: 10.12307/2022.141

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外用红色诺卡氏菌细胞壁骨架提高脂肪间充质干细胞活性修复糖尿病创面

闻丹丹1，李强2，沈才齐2，纪哲1，金培生2

1徐州医科大学研究生院，江苏省徐州市 221000；2徐州医科大学附属医院整形外科，江苏省徐州市 221002

收稿日期:2020-09-27 修回日期:2020-09-28 接受日期:2021-05-21 出版日期:2022-03-08 发布日期:2021-10-29
通讯作者: 金培生，博士，主任医师，徐州医科大学附属医院整形外科，江苏省徐州市 221002
作者简介:闻丹丹，女，1986年生，江苏省徐州市人，汉族，2021年徐州医科大学毕业，硕士，主要从事创面愈合的基础研究及临床应用研究。

Nocardia rubra cell wall skeleton for extemal use improves the viability of adipogenic mesenchymal stem cells and promotes diabetes wound repair

Wen Dandan1, Li Qiang2, Shen Caiqi2, Ji Zhe1, Jin Peisheng2

1Graduate School of Xuzhou Medical University, Xuzhou 221000, Jiangsu Province, China; 2Department of Plastic Surgery, Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University, Xuzhou 221002, Jiangsu Province, China

Received:2020-09-27 Revised:2020-09-28 Accepted:2021-05-21 Online:2022-03-08 Published:2021-10-29
Contact: Jin Peisheng, PhD, Chief physician, Department of Plastic Surgery, Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University, Xuzhou 221002, Jiangsu Province, China
About author:Wen Dandan, Master, Graduate School of Xuzhou Medical University, Xuzhou 221000, Jiangsu Province, China

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
外用红色诺卡氏菌细胞壁骨架：是一种从红色诺卡菌中提取的细胞壁骨架成分，由红色诺卡菌经发酵、细胞破碎、酶处理、溶媒提取等制备而成，主要成分为诺卡菌酸、阿拉伯半乳聚糖和黏肽，常规用于宫颈糜烂、黏膜溃疡及各种人乳头瘤病毒感染疾病的治疗。
活细胞染色剂CM-Dil：是通过与细胞膜结构的脂质分子结合而标记细胞，有着强而稳定的红色荧光(激发峰553 nm/发射峰570 nm)。CM-DiI 对细胞无毒，且稳定长效，能很好地长期示踪细胞。研究证实，CM-DiI标记后荧光在胞内表达稳定，阳性标记率达98%以上，标记细胞形态良好，能有效观察细胞在体外的诱导分化情况；或将标记的细胞注入体内，可以有效显示移植细胞在活体组织中的迁移及分化。
背景：根据目前临床上外用红色诺卡氏菌细胞壁骨架对宫颈糜烂的治疗应用及其免疫作用，考虑到其对慢性创面治疗的可能性。
目的：探讨外用红色诺卡氏菌细胞壁骨架对脂肪间充质干细胞体外增殖、凋亡的影响，以及对脂肪间充质干细胞体内移植存活率和皮肤愈合的影响。
方法：以质量浓度为10 mg/L外用红色诺卡氏菌细胞壁骨架作用于脂肪间充质干细胞，采用CCK-8法检测细胞活力，EDU试剂盒检测细胞增殖能力；在脂肪间充质干细胞中加入50%蔗糖诱导细胞凋亡，给予外用红色诺卡氏菌细胞壁骨架干预后采用FITC-PI流式细胞凋亡试剂盒、TUNEL凋亡试剂盒检测细胞凋亡情况。第3代脂肪间充质干细胞中加入10 mg/L外用红色诺卡氏菌细胞壁骨架5 mL，共培养48 h，用荧光染料CM-Dil标记后以皮内注射方式注入糖尿病小鼠创缘皮肤，LB983活体成像系统检测细胞存活率，苏木精-伊红染色、Masson染色和免疫荧光染色验证慢性创面第14天愈合情况。
结果与结论：外用红色诺卡氏菌细胞壁骨架可提高脂肪间充质干细胞的活力及增殖能力，并抑制其凋亡；在体内条件下外用红色诺卡氏菌细胞壁骨架可以增加脂肪间充质干细胞的存活率，糖尿病小鼠创面愈合速度更快。

https://orcid.org/0000-0002-2239-0156(金培生)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 红色诺卡氏菌细胞壁骨架, 脂肪间充质干细胞, 细胞活性, 凋亡, 慢性创面, 糖尿病创面

Abstract: BACKGROUND: According to the current clinical application of Nocardia rubra cell wall skeleton to the treatment of cervical erosion and its immune effect, considering the possibility of its treatment of chronic wounds.
OBJECTIVE: To study the effect of Nocardia rubra cell wall skeleton for extemal use on the proliferation and apoptosis of adipogenic mesenchymal stem cells in vitro, and the impact on the survival rate and skin healing of adipogenic mesenchymal stem cells transplantation in vivo.
METHODS: Adipogenic mesenchymal stem cells were treated with 10 mg/L Nocardia rubra cell wall skeleton for extemal use. CCK-8 and EDU kits were used to detect the viability and proliferation of adipogenic mesenchymal stem cells. Adipogenic mesenchymal stem cells were treated with 50% sucrose to induce apoptosis, and then with Nocardia rubra cell wall skeleton for extemal use. Afterwards, flow cytometry and TUNEL assay were used to detect the apoptosis. Nocardia rubra cell wall skeleton for extemal use (10 mg/L, 5 mL) was added to passage 3 adipogenic mesenchymal stem cells for 48 hours of culture. The pretreated cells labeled with the fluorescent dye CM-Dil were injected intracutaneously into the wound skin of diabetic mice. The cell survival rate was detected by the LB983 in vivo imaging system. Hematoxylin-eosin staining, Masson staining, and immunofluorescence were used to verify the healing of chronic wounds on day 14.
RESULTS AND CONCLUSION: Nocardia rubra cell wall skeleton for extemal use could promote the viability and proliferation of adipogenic mesenchymal stem cells, and inhibit their apoptosis. Nocardia rubra cell wall skeleton for extemal use increased the survival rate of adipogenic mesenchymal stem cells under in vivo conditions. The wound healing rate is faster in diabetic mice.

Key words: Nocardia rubra cell wall skeleton, adipogenic mesenchymal stem cells, cell viability, apoptosis, chronic wound, diabetic wounds

中图分类号:

闻丹丹, 李强, 沈才齐, 纪哲, 金培生. 外用红色诺卡氏菌细胞壁骨架提高脂肪间充质干细胞活性修复糖尿病创面[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1038-1044.

Wen Dandan, Li Qiang, Shen Caiqi, Ji Zhe, Jin Peisheng. Nocardia rubra cell wall skeleton for extemal use improves the viability of adipogenic mesenchymal stem cells and promotes diabetes wound repair[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(7): 1038-1044.

图/表（结果） 8

2.1 人Ad-MSCs的形态学、表面标记和诱导分化能力鉴定采用胶原酶消化法，从脂肪组织抽取液中提取得到的原代Ad-MSCs种植于细胞培养皿中，细胞生长融合至80%传代，传代后的细胞增殖速度明显增快，细胞形态均匀一致，呈长梭形，见图1A。第3代生长良好的Ad-MSCs分别进行成脂诱导分化和成骨诱导分化，2周后，油红O染液染色显示细胞内存在明显的大小不一的红色脂滴，见图1B，茜红素S染液染色可见明显的红色钙结节沉积，见图1C，这表明分离提取到的细胞具有干细胞分化潜能的特性。采用流式细胞仪检测6种不同的细胞表面标记物，结果显示：CD105(95.6%)，CD90(96.9%)和 CD44(78.6%)呈阳性，CD31(4.68%)，CD34(2.13%)和CD106(9.58%)呈阴性，见图1D，符合Ad-MSCs免疫表型特征，可用于后续的实验研究。

2.2 N-CWS对Ad-MSCs活性及增殖的影响以质量浓度为10 mg/L、体积50 μL的N-CWS作用于Ad-MSCs，在72 h和96 h时Ad-MSCs活力有较明显的增强，见图2A，B。为了验证N-CWS对Ad-MSCs增殖的影响，以10 mg/L、50 μL N-CWS作用于Ad-MSCs，分别在72，96 h后用EDU试剂盒进行EdU掺入分析，通过荧光显微镜观察阳性细胞，结果表明N-CWS可提高Ad-MSCs的增殖率，见图2C，D。

2.3 N-CWS抑制高糖诱导的Ad-MSCs凋亡在Ad-MSCs中加入高糖诱导细胞凋亡，不同剂量N-CWS分别处理48，72 h后用FITC-PI流式细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡情况。结果表明，N-CWS可抑制高糖诱导的干细胞凋亡，见图3。为了验证结果选用TUNEL法检测细胞凋亡，定量分析TUNEL荧光图，与流式法结果一致，见图4。

2.4 Western blot检测凋亡标志物蛋白表达水平 Western blot实验检测c-Caspase-3及Bax两种凋亡标志物的蛋白表达水平，β-actin作为内参，结果显示N-CWS处理后c-Caspase-3及Bax蛋白表达水平降低，见图5。

2.5 N-CWS在裸鼠体内提高Ad-MSCs存活率、加快创面愈合 18只小鼠全部进入结果分析，中途无脱落。为了进一步探究N-CWS对Ad-MSCs修复糖尿病创面愈合的影响，在糖尿病裸鼠身上建立了模拟人体皮肤创面修复机制的创面模型。将CM-Dil标记的预处理细胞以皮内注射方式注入小鼠创缘皮肤，用LB983活体成像系统检测细胞存活率，结果显示N-CWS处理的Ad-MSCs比单独使用Ad-MSCs有更高的存活率，见图6A，B。与空白对照组相比，经Ad-MSCs处理的小鼠创面愈合状况良好，N-CWS+Ad-MSCs组愈合情况更好，加快了创面的愈合，见图6C，D，创面愈合率增加，见表1。

术后14 d将各组创面皮肤标本进行苏木精-伊红染色和Masson染色，见图7A，结果显示Ad-MSCs组和N-CWS+Ad-MSCs组均能促进糖尿病创面再生，但N-CWS+Ad-MSCs组胶原纤维生长更整齐，条纹更加清晰。此外行组织免疫荧光CD31及肿瘤坏死因子α染色检测皮肤微血管再生及炎症因子表达，见图7B，结果显示N-CWS+Ad-MSCs组比Ad-MSCs组能够更好地促进糖尿病创面的皮肤再生和血运重建。
2.6 生物相容性将人体Ad-MSCs植入裸鼠背部后并无免疫排斥反应，对裸鼠无毒害作用。

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引言

脂肪间充质干细胞(adipogenic mesenchymal stem cells，Ad-MSCs)是衍生自脂肪组织基质的成年干细胞，具有相当大的自我更新能力，可以分化为各种类型的功能性细胞。已有证据表明，Ad-MSCs在基于干细胞的慢性伤口治疗中具有巨大潜力[1-2]。但是，在任何潜在的细胞疗法中成功使用Ad-MSCs的一个重大障碍是植入皮肤慢性伤口模型后的细胞存活率[3]。将细胞移植到受损皮肤组织中，它们会经历包括缺氧、炎症、氧化应激或其他不利条件，这不可避免地导致植入种子细胞的不良存活，干扰了Ad-MSCs的治疗作用[4]。因此，需要简单有效的干预措施来增强细胞对凋亡的抵抗力并提高Ad-MSCs的治疗效果。
外用红色诺卡氏菌细胞壁骨架(nocardiarubracell wall skeleton for extemaluse，N-CWS)是一种从红色诺卡菌中提取的细胞壁骨架成分，由红色诺卡菌经发酵、细胞破碎、酶处理、溶媒提取等制备而成，主要成分为诺卡菌酸、阿拉伯半乳聚糖和黏肽[5-6]，常规用于宫颈糜烂、黏膜溃疡及各种人乳头瘤病毒感染疾病的治疗。一些研究表明，N-CWS 具有抗肿瘤和免疫刺激特性，并可能增强细胞因子的产生[7]。N-CWS已用于浸润性膀胱癌[8]、人乳头瘤病毒[9]、恶性胸腔积液等的局部治疗[10]。但是，N-CWS 的详细免疫调节功能仍不清楚。
根据目前临床上N-CWS对宫颈糜烂的治疗应用以及N-CWS的免疫作用，考虑到其对慢性创面的治疗可能性。该研究探讨N-CWS在体外对Ad-MSCs活性、凋亡的影响，以及N-CWS处理的Ad-MSCs在糖尿病裸鼠慢性伤口的存活率及其治疗效果。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学实验+动物实验，各组数据比较采用独立样本t检验和单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2020年1-9月在徐州医科大学肿瘤实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 4周龄BALB/c无胸腺雌性裸鼠18只，SPF级，体质量18-22 g，购于江苏集萃药康生物科技有限公司。动物购进后在徐州医科大学动物实验中心适应性饲养1周以上。饲养条件：温度20-25 ℃，相对湿度40%-70%，喂养裸鼠专用饲料及纯净水。
1.3.2 实验药品、试剂和仪器 N-CWS(辽宁瑞仕特生物制药有限公司)；DMEM培养基、胎牛血清(澳洲Gibco公司)；FITC/PI凋亡试剂盒(南京凯基生物科技公司)；TUNEL凋亡试剂盒(瑞士罗氏公司)；兔抗人Caspase-3单克隆抗体、兔抗人Bax单克隆抗体(美国CST公司)；柠檬酸/柠檬酸钠(美国Sigma公司)；免疫组化试剂盒(北京中杉金桥)；流式细胞仪(美国Becton Dicknson公司)；LB983活体成像系统(德国伯托)。
1.4 方法
1.4.1 人Ad-MSCs的分离培养和传代从患者的吸脂抽吸物获得脂肪组织样品并分离培养Ad-MSCs。脂肪组织来自徐州医科大学附属医院整形外科手术患者，年龄25-45岁，排除乙肝、艾滋、梅毒等传染性疾病，经徐州医科大学附属医院伦理委员会批准及患者知情同意。将获得的新鲜脂肪组织抽取液经0.25%胰酶-EDTA消化、过滤、离心保留细胞沉淀层，加入含体积分数为10%胎牛血清及1%青/链霉素的DMEM培养基，将细胞培养皿置于37 ℃、体积分数为5%CO2培养箱培养，此后每两三天PBS洗涤后换液1次，待细胞生长至80%传代。

1.4.2 细胞活性测定取对数生长期第3代Ad-MSCs，以 4×103/孔接种于96孔板，加入含体积分数为10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素的DMEM培养基培养；用PBS将N-CWS溶解稀释至10 mg/L。实验分为对照组、25 μL N-CWS组、
50 μL N-CWS组、75 μL N-CWS组，待Ad-MSCs贴壁后，加入不同剂量N-CWS，分别在24，48，72，96 h后每孔加CCK-8试剂10 μL，继续孵育2 h，使用酶联免疫检测仪在450 nm 波长下测定各孔的吸光度值。以培养时间为横轴，吸光度值为纵轴，描绘细胞生长曲线。
1.4.3 EdU掺入实验使用 Cell-Light EdU 567体外成像试剂盒进行EdU掺入分析。取对数生长期第3代Ad-MSCs，以 4×103/孔接种于 96孔板，加入50 μL N-CWS(10 mg/L)，作用72，96 h后每孔加入EDU培养基100 μL，孵育2 h，PBS清洗一两次，每孔加入40 g/L多聚甲醛固定液，室温孵育
30 min，然后添加 2 g/L甘氨酸溶液，脱色摇床5 min，PBS洗涤，加入渗透剂，脱色摇床10 min，PBS清洗，加入Apollo染色反应液，室温避光温育30 min，弃染色反应溶液，加入渗透剂(含0.5%TritonX-100 的 PBS)脱色摇两三次，每次10 min，弃渗透剂，再次用PBS 洗涤，加入 1×Hoechst 33342反应液，室温下避光孵育30 min，弃反应液，PBS洗涤1-3次，通过荧光显微镜观察阳性细胞。
1.4.4 细胞凋亡检测
(1)流式分析法：第3代Ad-MSCs生长融合至80%时，以1×104/孔密度接种于6孔板。将实验分为4组：对照组、高糖处理组、100 μL N-CWS组、250 μL N-CWS组，细胞贴壁后，各实验组加入50%蔗糖100 μL诱导Ad-MSCs凋亡，其中两个N-CWS组再分别加入N-CWS(10 mg/L)100，250 μL；48，72 h后收集各组细胞上清于流式管中，贴壁细胞用不含EDTA的胰酶消化收集到同组流式管中，2 000 r/min离心5 min；PBS洗涤2次，振荡混匀；每管依次加入Binding buffer试剂(Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒)500 μL、FITC 5 μL、PI
5 μL，振荡均匀，4 ℃避光孵育5-15 min；流式细胞仪检测分析。
(2)TUNEL法(罗氏凋亡测定法)：使用体积分数为75%乙醇浸泡消毒18 mm×18 mm盖玻片数片，使用时取盖玻片置于6孔板内，PBS反复冲洗数遍至乙醇残液完全去除；将第3代Ad-MSCs以1×104/孔密度接种于6孔板，实验分组及干预同流式细胞法；PBS洗涤细胞3次，40 g/L多聚甲醛室温下固定30 min；PBS洗涤细胞3次，0.1%TritionX-100穿透液2-8 ℃条件下孵育10 min；PBS洗涤细胞3次，配制500 μL TUNEL反应液，将Enzyme Solution试剂50 μL和Lable Solution 试剂450 μL混合为试剂A；阴性对照组加入50 μL试剂A，置于37 ℃培养箱避光孵育60 min；阳性对照组加入DnaseⅠ重组子，室温孵育10 min；PBS洗涤细胞3次，加入TUNEL反应混合液50 μL/孔，37 ℃培养箱中避光孵育60 min；PBS洗涤细胞3次，加入DAPI染液50 μL/孔，室温下孵育3 min；样本置于荧光显微镜下拍照分析，检测光波长范围570-620 nm(最大波长580 nm，红色)。
1.4.5 Western blot检测Caspase-3、Bax蛋白表达将第3代Ad-MSCs接种于培养皿中，实验分组及干预同流式细胞法，每皿加入300 μL细胞裂解混合液(冰上溶解PIPA细胞裂解液，以100∶1比例加入PMSF)，然后置于冰上充分裂解后收集蛋白，用BCA法测量蛋白浓度；SDS-PAGE凝胶电泳，然后将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，并与以下抗体一起孵育；兔抗人Caspase-3单克隆抗体(1∶400)，兔抗人Bax单克隆抗体(1∶400)，置于水平摇床上，4 ℃孵育过夜或者在常温下孵育2 h；一抗孵育结束后，加入Washing buffer洗涤5 min×
3次，然后加入稀释的二抗(1∶10 000)室温避光孵育2 h；弃二抗，Washing buffer洗涤5 min×3次，分别吸取ECL发光液A液和B液等量混匀，配制成ECL工作液，在膜片上均匀滴加ECL工作液，放入TANON凝胶成像仪中进行曝光显影，拍照，ImageJ软件分析蛋白灰度。
1.4.6 糖尿病创面动物模型的建立 18只BALB/c无胸腺裸鼠在SPF级动物房饲养，造模前小鼠禁食12 h，称体质量并记录，以150 mg/kg的剂量通过腹膜内注射2%链脲佐菌素诱导糖尿病模型，实验动物饲养1周后，禁食12 h尾静脉采血，用血糖仪测定小鼠血糖浓度并记录。从第7天开始小鼠血糖浓度大于16.7 mmol/L并且出现典型的糖尿病“多饮，多食，多尿和体质量减轻”症状，视为造模成功，进行下一步动物实验。将实验动物分为3组，每组6只，即模型组、Ad-MSCs组、N-CWS+Ad-MSCs组。糖尿病小鼠麻醉后在背部切取直径1.5 cm的创面，将Ad-MSCs、N-CWS+Ad-MSCs(第3代Ad-MSCs中加入10 mg/L的N-CWS 5 mL，共培养48 h)以多点皮内注射方式注入小鼠创缘皮肤，每个创缘取6点，每点注射细胞0.1 mL，每个创面注射约2×105个Ad-MSCs，表面敷无菌纱布，继续饲养观察，使用LB983活体成像系统观察创面细胞存活情况和小鼠皮肤愈合情况。
1.4.7 CM-Dil活细胞染色剂染色注射前Ad-MSCs和N-CWS+Ad-MSCs用 CM-Dil标记。染色方法：消化细胞后，离心弃上清，PBS洗涤1遍，加入CM-Dil活细胞染色剂，37 ℃
孵育 30 min，期间注意摇晃混匀，然后4 ℃孵育15 min，离心后弃上清，PBS洗涤3遍，最后加入适量PBS混匀，置于冰盒备用。
1.4.8 苏木精-伊红染色术后第14天，采用颈椎脱臼法处死各组小鼠，以距离皮肤创缘外侧3 mm为直径切取全层皮肤，深达肌层，将标本储存于甲醛固定液，48 h后进行脱水-透明-浸蜡-包埋-切片步骤处理。将切片脱蜡后，苏木精染色10 min，流水冲洗，使用1%盐酸分化数秒后冲洗，0.2%氨水反蓝后冲洗，然后使用伊红染色5 min，冲洗后再乙醇脱水，最后二甲苯透明，中性树胶封固，显微镜下观察各组创面新生组织厚度、胶原结缔组织排列和炎症细胞浸润状况，并拍照分析。
1.4.9 Masson染色将上述石蜡切片脱蜡至水，依次自来水和蒸馏水洗，用苏木精染液染核10 min，蒸馏水充分洗涤，然后盐酸乙醇分化，使用Masson丽春红酸性复红液染色5-
10 min，2%冰醋酸水溶液短暂浸泡洗涤，再使用1%磷钼酸水溶液分化3-5 min，然后直接用苯胺蓝或光绿液染5 min，以0.2%冰醋酸水溶液短暂浸泡洗涤；最后体积分数为95%乙醇、无水乙醇脱水，浸泡二甲苯充分透明，中性树胶封固晒干后显微镜下观察。
1.4.10 组织免疫荧光染色将上述石蜡切片脱蜡，体积分数为3%H2O2室温孵育5-10 min，以消除内源性过氧化物酶的活性，切片用蒸馏水冲洗，PBS浸泡2次，5 min/次，体积分数为10%正常山羊血清(PBS稀释)室温封闭10 min，弃去封闭液，勿洗，分别滴加CD31和肿瘤坏死因子α一抗(稀释比例1∶300)工作液，4 ℃过夜，PBS冲洗3次，5 min/次，滴加适量生物素标记荧光二抗工作液(稀释比例1∶400)，37 ℃避光孵育1 h，PBS冲洗3次，5 min/次，适量滴加DAPI染液，室温避光孵育3 min，PBS冲洗3次，5 min/次，最后滴加防荧光淬灭封固液，盖上盖玻片，指甲油固定，避光保存。
1.5 主要观察指标 ①N-CWS对Ad-MSCs活性及增殖的影响；②N-CWS对高糖诱导的Ad-MSCs凋亡的影响；③糖尿病小鼠创面Ad-MSCs存活率及创面愈合情况。
1.6 统计学分析采用SPSS 件(SPSS 16.0，Inc.，Chicago，IL，USA)进行统计分析，实验结果用x±s表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组均数比较采用单因素方差分析。α=0.05为显著性水准，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

糖尿病难愈创面形成的原因有很多，例如正常创面愈合过程中所需的细胞和分子信号的缺失。此外，周围神经病变、外周循环损坏、蛋白酶平衡紊乱都是糖尿病创面难以愈合的重要因素[11]。另外一方面，高糖环境下血管微环境异常，可导致细胞生长环境异常，最终使创伤局部的血管重建受
损[12]。此外，糖尿病高糖状态下创伤组织中成纤维细胞数量减少、糖基化蛋白增多、异常生长因子表达、炎症过程延迟、糖基化终末产物堆积这些都影响骨髓源性细胞的迁徙和功能[13]。
众多研究表明，N-CWS能增强体内T细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞的活性，促进细胞因子产生，具有免疫活性强、不良反应小的特点，还可通过提高多种细胞因子的水平，促进对巨噬细胞、杀伤性T细胞、LAK细胞、NK细胞的杀伤活性[14]，发挥抗肿瘤、抗病毒、抗感染等作用，这也为其治疗慢性创面提供了药理基础。
Ad-MSCs是一种从脂肪组织提取得到的多向分化潜能干细胞，具有来源广泛、易提取扩增、低免疫原性等优点[15-17]。多项研究表明其可以提高创面愈合速度，但是其修复机制尚不清楚。研究发现Ad-MSCs可通过自身多向分化潜能迁徙至受损部位，分化为皮肤附属器表型，并用分化细胞重新修复受损皮肤，同时亦可分泌多种生长因子[18]，加快创面血管生成，促进创面愈合。有学者认为，Ad-MSCs 可以转化为表达细胞角蛋白 5、14、19 和整合蛋白α6 的上皮细胞进行创面修复[19]；还有学者发现，Ad-MSCs可分化为成纤维细胞，不仅表现出形态相似性，而且可表达成纤维细胞表面蛋白(包括波形蛋白和纤连蛋白)的能力[20]。同时，Ad-MSCs 还可以直接转化为成纤维细胞和角质形成细胞进行创面修复[21]。然而，之前研究发现多数Ad-MSCs注射到糖尿病小鼠创面中发生凋亡，导致创面愈合延迟。高糖环境下培养的Ad-MSCs发生凋亡，且具有时间依赖性[22-23]。
目前N-CWS在临床上主要用于宫颈糜烂的治疗，亦可发挥抗肿瘤的作用，具体机制尚不清楚，考虑与其增强多种免疫因子活性有关。该实验通过CCK-8、EDU检测了N-CWS对Ad-MSCs体外活性、增殖能力的影响，结果显示N-CWS可提高Ad-MSCs的活性及增殖能力，又通过流式细胞术和TUNEL法检测细胞凋亡情况，发现N-CWS还可以抑制高糖诱导的Ad-MSCs凋亡，并有时间和浓度依赖性。在动物体内检测了N-CWS对Ad-MSCs存活率的影响，结果显示使用N-CWS处理的Ad-MSCs比单纯应用Ad-MSCs存活率更高，创面愈合速度更快，效果更佳；组织免疫荧光结果显示反映血管生成的内皮细胞黏附因子CD31增多，反映炎症水平的肿瘤坏死因子α减少。这些数据表明，Ad-MSCs本身对糖尿病皮肤伤口的治疗有效，经N-CWS处理后的
Ad-MSCs对糖尿病伤口愈合显示出更好的治疗效果。但是这项研究仅探讨了N-CWS对Ad-MSCs的作用，对于为什么能够促进Ad-MSCs活性，以及如何抑制高糖诱导的Ad-MSCs凋亡尚不清楚，还需进一步研究及探讨。另外，伤口的愈合涉及多种细胞和因子，后续还可以在巨噬细胞活化、成纤维细胞迁移和活化、表皮干细胞、血管内皮细胞等方面进行深入的研究。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

外用红色诺卡氏菌细胞壁骨架提高脂肪间充质干细胞活性修复糖尿病创面

Nocardia rubra cell wall skeleton for extemal use improves the viability of adipogenic mesenchymal stem cells and promotes diabetes wound repair

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