1.1 设计 细胞学体外实验。
1.2 时间及地点 实验于2020年1-10月在中国科学院大学深圳医院中心实验室完成。
1.3 材料 人胚胎干细胞系(H9)购自上海埃泽思生物科技有限公司;植物源性bFGF(OsrbFGF)购自武汉禾元生物科技股份有限公司;常规使用的bFGF购自ThermoFisher公司
(4 μg/L-TF);基础培养基DMEM/F12、DMEM、RPMI1640以及替代血清、左旋谷氨酰氨、β-巯基乙醇、非必需氨基酸这些维持人胚胎干细胞生长的因子均购自GIBCO公司;重要的诱导分化因子Activin A、Wnt3a等购自R&D公司。
1.4 实验方法
1.4.1 干细胞培养和分组 人胚胎干细胞解冻后先在含4 μg/L常规bFGF的条件下培养1代,然后在含不同质量浓度bFGF的条件下传代培养,见图1A(0 μg/L代表不添加bFGF,0.4,0.8,4 μg/L代表添加不同质量浓度的植物源性bFGF,4 μg/L-TF代表添加4 μg/L常规bFGF),持续培养10-20代。人胚胎干细胞在CF-1小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上培养扩增,每周传代1次,人胚胎干细胞的基础培养基为DMEM/F12,按照比例添加如下因子:15%血清替代物、0.1 mmol/L β-巯基乙醇、2 mmol/L谷氨酰胺、1%非必需氨基酸、4 μg/L bFGF。在长期传代过程中观察细胞的生长情况以及评估细胞的多能性维持和分化能力。
1.4.2 三胚层分化和胰腺分化 人胚胎干细胞在体外培养10代后用于三胚层分化实验。第10代人胚胎干细胞在饲养层细胞上生长到第6天,使用1 mL注射器进行机械切割,维持切割方块大小在50-200 μm范围之间,接着使用200 μL的Tip头将方块轻轻吹起并置于细菌培养皿中悬浮培养形成拟胚体,在体外分化两三周后通过免疫荧光染色检测三胚层标记AFP、SMA、β-tubulin的表达。
人胚胎干细胞在体外培养10代后用于胰腺分化实验,开始诱导实验前,首先用Matrigel铺皿,然后将饲养层上人胚胎干细胞通过切割传代的方法转到铺有Matrigel的培养皿中贴壁培养,使用mTESR培养基培养3-5 d后细胞汇合度至80%左右水平,更换诱导培养基进行诱导分化实验。胰腺分化经历了限定性内胚层、胰腺前体细胞和胰岛素分泌细胞等多阶段的分化过程。①参考KROON等[5]的方法诱导分化得到限定性内胚层,第1天使用RPMI1640为基础培养基,ActivinA(100 μg/L)和Wnt3a(25 μg/L)共同作用1 d;第2天使用RPMI1640为基础培养基,ActivinA(100 μg/L)+胎牛血清(体积分数为0.2%)作用1 d;第3天使用RPMI1640为基础培养基,ActivinA(100 μg/L)+胎牛血清(体积分数为2%)作用1 d;②参考KUNISADA等[6]方法使用SB431542(10 μmol/L)、Dorsomorphin(1 μmol/L)、Retinoicacid(2 μmol/L)共同作用7 d
获得胰腺前体细胞,使用Modified IMEM为基础培养基;③在胰腺分化成熟阶段使用烟碱(10 mmol/L)、Alk5inhibitor
(5 μmol/L)、Forskolin(10 μmol/L)和Dexamethasone(10 μmol/L)共同作用11 d获得胰腺终末细胞,使用Modified IMEM为基础培养基。
1.4.3 免疫荧光染色 收集培养的第15代人胚胎干细胞和分化后的细胞,第一步细胞固定:细胞用PBS快速清洗3遍,添加40 g/L多聚甲醛室温固定15 min,PBS清洗3遍,每遍5 min;第二步进行封闭/透膜:使用封闭透膜液(1×PBS、体积分数为10%驴血清、0.2%TritonX-100)室温处理30 min;第三步一抗孵育过夜:吸走封闭液后,直接加入按比例稀释好的一抗(OCT4、TRA-1-60、TRA-1-81、AFP、SMA、β-tubulin、insulin、c-peptide),4 ℃冰箱孵育过夜;第四步孵育二抗:次日,取出细胞用PBS清洗3遍,每遍5 min,加入稀释好的二抗避光孵育1 h,吸走二抗,1×PBS洗3遍,每遍5 min;第五步进行DAPI染核:加入稀释好的DAPI,室温避光处理
5 min,去除DAPI,1×PBS洗3遍,放置在荧光显微镜下观察。
1.4.4 流式细胞检测 使用Accutase将第16代人胚胎干细胞消化成单细胞悬液,重悬到胎牛血清缓冲液(DPBS+体积分数为1%胎牛血清)中,统计所得的细胞数目。当进行细胞外抗原(SSEA4)染色时,每个人胚胎干细胞样本重悬到100 μL
胎牛血清缓冲液中,并添加5 μL SSEA4-PE抗体(BD,货号560128),在室温条件下孵育30 min,然后使用胎牛血清缓冲液清洗3遍,重悬上机检测。当进行细胞内核抗原(OCT4)染色时,使用BD公司提供的Cytofix/Cytoperm缓冲液将细胞固定15 min,然后使用清洗缓冲液清洗3遍,每个人胚胎干细胞样本重悬到100 μL清洗缓冲液中,并添加5 μL
OCT4-488抗体(BD,货号560253),在室温条件下孵育
30 min,然后使用BD公司提供的清洗缓冲液清洗3遍,重悬上机检测。
1.4.5 碱性磷酸酶染色 第15代人胚胎干细胞去除培养基后进行固定,然后使用碱性磷酸酶检测试剂盒(Merck,SCR004)进行染色和镜下观察。
1.4.6 聚合酶链式反应(RT-PCR) 收集诱导终末的细胞使用TRIzol试剂(Invitrogen)抽提总RNA,并用Roche公司的反转录试剂盒(货号:04896966001)合成cDNA模版。PCR扩增的引物序列和对应基因片段大小见表1。
1.5 主要观察指标 植物源bFGF在不同质量浓度下维持干细胞特性的能力以及其向外、中、内三胚层分化和胰腺细胞分化的潜能。