补肾活血胶囊介导Hedgehog信号通路调控大鼠骨髓间充质干细胞成骨成脂分化

doi:10.12307/2022.138

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (7): 1020-1026.doi: 10.12307/2022.138

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补肾活血胶囊介导Hedgehog信号通路调控大鼠骨髓间充质干细胞成骨成脂分化

梁学振1，杨曦2，李嘉程1，骆帝3，许波1，李刚1，3

1山东中医药大学第一临床医学院，山东省济南市 250355；2新疆军区总医院检验科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830000；3山东中医药大学附属医院，山东省济南市 250014

收稿日期:2020-09-28 修回日期:2020-09-30 接受日期:2020-10-30 出版日期:2022-03-08 发布日期:2021-10-29
通讯作者: 李刚，博士，教授，博士生导师，山东中医药大学第一临床医学院，山东省济南市 250355；山东中医药大学附属医院，山东省济南市 250014
作者简介:梁学振，男，1990年生，博士，讲师，主要从事骨与关节疾病研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81774333)，项目负责人：李刚

Bushen Huoxue capsule regulates osteogenic and adipogenic differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells via Hedgehog signaling pathway

Liang Xuezhen1, Yang Xi2, Li Jiacheng1, Luo Di3, Xu Bo1, Li Gang1, 3

1First Clinical Medical College of Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, Shandong Province, China; 2Laboratory Department of Xinjiang Military Region General Hospital, Urumqi 830000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; 3Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250014, Shandong Province, China

Received:2020-09-28 Revised:2020-09-30 Accepted:2020-10-30 Online:2022-03-08 Published:2021-10-29
Contact: Li Gang, MD, Professor, Doctoral supervisor, First Clinical Medical College of Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, Shandong Province, China; Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250014, Shandong Province, China
About author:Liang Xuezhen, MD, Lecturer, First Clinical Medical College of Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, Shandong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81774333 (to LG)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

骨髓间充质干细胞：是骨髓基质中发现的一种具有分化形成骨、软骨、脂肪、神经及成肌细胞的多种分化潜能的细胞亚群，在骨骼生长发育过程中扮演着重要的角色。
Hedgehog信号通路：是由Hedgehog相应配体(Ihh、Shh、Dhh)、受体(Patched/Ptc、Smoothened/Smo)及细胞内信号分子(Cos2/Kif7、Fu、Ci/Gli)等组成，在调节细胞增殖、分化过程中亦具有十分重要作用。
背景：激素性股骨头坏死是骨科常见的进行性难治性疾病，严重影响患者的正常生活和工作。骨髓间充质干细胞成骨成脂分化异常被证实参与了激素性股骨头坏死的发生发展及防治，但其作用机制尚不清楚。
目的：观察补肾活血胶囊对糖皮质激素处理的骨髓间充质干细胞成骨-成脂分化及Hedgehog信号通路相关因子的影响。
方法：分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞，运用不同剂量的补肾活血胶囊含药血清及糖皮质激素干预，CCK-8法检测细胞增殖活性，茜素红染色和油红O染色观察骨髓间充质干细胞成骨和成脂分化情况，Western blot检测细胞中成骨、成脂及Hedgehog信号通路相关因子的蛋白表达变化。

结果与结论：①补肾活血胶囊含药血清不仅能促进正常大鼠骨髓间充质干细胞的增殖，而且能明显改善糖皮质激素对骨髓间充质干细胞增殖的抑制效应；②成骨诱导3周后，补肾活血胶囊含药血清组与空白对照组相比成骨诱导能力增强，尤其是补肾活血胶囊中剂量组表现出更高的成骨活性；③成脂诱导2周后，油红O染色显示补肾活血胶囊含药血清组与空白对照组相比阳性染色面积均明显减少，其中补肾活血胶囊中剂量组抑制程度最为明显；④各组干预3 d后，Western blot检测显示补肾活血胶囊含药血清均能增强骨髓间充质干细胞中成骨因子Runx2、Col1a1和Hedgehog信号通路相关因子Shh、Gli1的蛋白表达，减弱成脂因子PPARγ、C/EBPα的蛋白表达；⑤结果表明，补肾活血胶囊含药血清能介导Hedgehog信号通路促进骨髓间充质干细胞成骨分化、抑制其成脂分化。

https://orcid.org/0000-0001-5649-4212(梁学振)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 骨髓间充质干细胞, 激素性股骨头坏死, 补肾活血胶囊, Hedgehog信号通路, 成骨分化, 成脂分化

Abstract: BACKGROUND: Steroid-induced osteonecrosis of femoral head, a common, progressive and refractory orthopedics disease, seriously affected the normal life and work of the patients. The imbalance of osteogenic and adipogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells was confirmed to involve in the pathogenesis, prevention, and treatment of steroid-induced osteonecrosis of femoral head. However, the mechanism is unclear.
OBJECTIVE: To observe the effect of Bushen Huoxue capsule containing serum on osteogenic and adipogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells treated with glucocorticoids and Hedgehog signal pathway related factors.
METHODS: Bone marrow mesenchymal stem cells were isolated from SD rats and cultured, and intervened with different doses of Bushen Huoxue capsule containing serum and glucocorticoids. CCK-8 assay was used to observe the proliferation of cells. The osteogenic and adipogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells in different groups were detected by alizarin red staining and oil red “O” staining. The changes of protein expression of osteogenic factors and adipogenic factors and Hedgehog signal pathway related factors of bone marrow mesenchymal stem cells in different groups were analyzed by western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The Bushen Huoxue capsule containing serum not only could promote the proliferation of normal rat bone marrow mesenchymal stem cells, but also could obviously increase the proliferation activity of bone marrow mesenchymal stem cells treated by the glucocorticoids. (2) After 3 weeks of bone induction, osteogenic induction abilities in the low dose group, middle dose group and high dose group of Bushen Huoxue capsule containing serum were significantly higher than that of the blank control group, especially the middle dose group. (3) After 2 weeks of lipid induction, the positive staining areas revealed by oil red “O” staining in the low dose group, middle dose group and high dose group of Bushen Huoxue capsule containing serum were lower than that of the blank control group, especially the middle dose group. (4) After 3 days of intervention in each group, western blot assay showed that Bushen Huoxue capsule could enhance the protein expression of osteogenic factors (Runx2, Col1a1) and Hedgehog signal pathway related factors (Shh, Gli1) in bone marrow mesenchymal stem cells, and weaken the protein expression of adipogenic factors (PPARγ, C/EBPα) in bone marrow mesenchymal stem cells. (5) The results indicate that the Bushen Huoxue capsule containing serum could promote the osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells and inhibit the adipocyte differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells through the Hedgehog signaling pathway.

Key words: stem cells, bone marrow mesenchymal stem cells, steroid-induced osteonecrosis of the femoral head, Bushen Huoxue capsule, Hedgehog signal pathway, osteogenic differentiation, adipogenic differentiation

中图分类号:

梁学振, 杨曦, 李嘉程, 骆帝, 许波, 李刚. 补肾活血胶囊介导Hedgehog信号通路调控大鼠骨髓间充质干细胞成骨成脂分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1020-1026.

Liang Xuezhen, Yang Xi, Li Jiacheng, Luo Di, Xu Bo, Li Gang. Bushen Huoxue capsule regulates osteogenic and adipogenic differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells via Hedgehog signaling pathway[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(7): 1020-1026.

图/表（结果） 8

2.1 大鼠补肾活血胶囊含药血清的制备情况中剂量组和高剂量组大鼠在药物灌胃过程中各死亡1只，尸体解剖均发现大量胃肠胀气现象，考虑与灌胃浓度较高、灌胃次数频繁和操作手法不当有关，成功获取38只大鼠的含药血清，各组大鼠取血过程中均未出现明显溶血现象，组内各大鼠血清混合后，颜色均表现为透明清亮，无明显沉淀，见图 1。

2.2 大鼠BMSCs的鉴定结果大鼠BMSCs没有单一的特异性标记物，为了更全面地表征大鼠BMSCs，该研究采用倒置相差显微镜形态观察、流式细胞仪表型测定和三系分化等方法相结合对大鼠BMSCs的纯度和活性进行验证分析。
2.2.1 细胞形态学从大鼠骨髓腔抽吸分离出的单个核细胞接种于培养瓶中，倒置显微镜下观察可见：原代细胞呈圆形、大小不一、胞体透亮、折光性好、悬浮于培养液中，见图2A，E；48 h大部分细胞开始贴壁，3 d后换液，细胞形态变化明显、增殖迅速，细胞伸出突起、呈梭形、纺锤形或多角形，突起之间相互联系，7-10 d细胞能铺满培养瓶70%以上，呈梭形，见图2B，F。传代细胞形态大多为圆形，接种数小时后即可贴壁，多数24 h后可完成贴壁，细胞状态重新恢复为梭形，5-7 d
细胞可再次铺满培养瓶70%以上，见图 2C，G。第3代细胞呈梭形，明显同向性改变，透光率好，生长均匀，见图2D，H。

2.2.2 表面抗原特性鉴定取生长状态良好的第3代大鼠BMSCs进行细胞表面标记物检测，结果显示CD29、CD90、CD105阳性率分别为98.2%，97.5%，96.9%，阳性率均大于90%，为高表达；而造血细胞标记CD34、CD45阳性率分别为0.4%，1.9%，阳性率均小于5%，为低表达，见图3。

2.2.3 三系分化鉴定取生长状态良好的第3代大鼠BMSCs，采用成骨诱导液诱导21 d后，细胞呈不规则形，出现细胞聚集现象，可见大量矿化结节，茜素红染色呈阳性，见图 4A；采用成脂诱导液诱导14 d后，细胞呈多角形、圆形空泡样改变，似脂肪细胞，透光性强，油红O染色呈阳性，见图 4B；采用成软骨诱导液诱导28 d后，细胞聚集成团，将软骨球石蜡包埋切片，阿利辛蓝染色呈阳性，见图 4C。

2.3 糖皮质激素和补肾活血胶囊含药血清对BMSCs增殖的影响 CCK-8检测结果显示，补肾活血胶囊含药血清能明显促进大鼠BMSCs的增殖活性，差异有显著性意义，呈时间正相关关系，见图5A；一定剂量的糖皮质激素持续干预能明显降低大鼠BMSCs的增殖能力，而补肾活血胶囊含药血清干预后可显著提高大鼠BMSCs的增殖能力，培养至第7天后，补肾活血胶囊中剂量为最佳有效浓度，增殖能力与对照组类似，明显高于模型组，差异有显著性意义，见图5B。

2.4 补肾活血胶囊含药血清诱导BMSCs成骨分化成骨诱导3周后，不同剂量补肾活血胶囊含药血清组与空白对照组BMSCs进行茜素红染色分析，见图6。在一定时间内，补肾活血胶囊含药血清组与空白对照组相比成骨诱导能力强，细胞外矿化结节的形成与沉积较多，阳性染色面积较大，尤其是补肾活血胶囊中剂量含药血清组表现出更高的成骨活性。

2.5 补肾活血胶囊含药血清诱导BMSCs成脂分化成脂诱导2周后，空白对照组BMSCs形态变圆，部分细胞胞浆内小脂滴形成与累积，补肾活血胶囊含药血清干预后，阳性染色面积均明显减少，其中补肾活血胶囊中剂量组抑制程度最为明显，见图7。

2.6 糖皮质激素和补肾活血胶囊含药血清诱导BMSCs分化后成骨、成脂及通路蛋白表达糖皮质激素和补肾活血胶囊含药血清诱导3 d后，采用Western blot检测成骨相关因子(Runx2、Col1a1)、成脂相关因子(C/EBPα、PPARγ)及Hedgehog信号通路相关因子(SHH、Gli1、Gli2)的蛋白表达，见图8。
补肾活血胶囊含药血清干预后成骨因子Runx2蛋白表达较空白对照组明显上升，而单纯糖皮质激素干预后，成脂因子PPARγ和C/EBPα蛋白表达明显上升，补肾活血胶囊含药血清诱导后，成脂因子表达有所下降；与单纯糖皮质激素组比较，糖皮质激素和补肾活血胶囊含药血清共同干预组Hedgehog信号通路相关因子Shh和Gli1蛋白表达呈上升趋势，尤其是补肾活血胶囊含药血清中剂量组。
2.7 生物相容性如图5A所示，补肾活血胶囊含药血清能提高大鼠BMSCs的增殖活性，无细胞毒性，具有良好的生物相容性。

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引言

股骨头坏死是骨科常见的难治性疾病之一，发病率不断增高，又因其致残率高、治疗困难，越来越引起医学界的重视[1]。股骨头坏死是一种在特定条件下发生于股骨头内以细胞成分如内皮细胞、骨细胞和造血细胞的缺血性死亡、骨髓水肿及股骨头塌陷为特征的骨骼疾病[2]，其特点是髋关节疼痛、功能障碍甚至跛行。股骨头坏死主要分为创伤性股骨头坏死和非创伤性股骨头坏死两大类，其中非创伤性股骨头坏死主要与激素的使用、酗酒、感染、高压氧、骨髓浸润性疾病、凝血缺陷和某些自身免疫性疾病等有关[3-6]，而糖皮质激素被认为是非创伤性股骨头坏死的主要因素之一，可导致10%-30%非创伤性股骨头坏死的发生[7]，即激素性股骨头坏死。糖皮质激素是一种廉价、有效的药物，广泛应用于多种急性和慢性疾病，包括系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、多发性骨髓瘤、急性淋巴细胞白血病、器官移植和严重急性呼吸综合征等。根据中国2012年的一项多中心调查，非创伤性股骨头坏死中约26.35%的男性患者和55.75%的女性患者是由糖皮质激素引起的[8]。
骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)的活性降低及成骨-成脂分化平衡失调可导致骨再生减少，是激素性股骨头坏死的重要病理基础之
一[9]。 Hedgehog信号通路对BMSCs多向分化调控具有关键作用[10-11]。Hedgehog 信号通路可促进BMSCs 向成骨细胞分化、抑制其向脂肪细胞分化[10]；一定浓度的糖皮质激素可引起BMSCs成骨和成脂分化的平衡失调[12]。课题组前期研究表明，补肾活血胶囊能够调节激素性股骨头坏死患者及大鼠的脂质代谢，促进骨组织修复[13-15]，推测补肾活血胶囊激活Hedgehog信号通路缓解上述病理过程发挥治疗作用。为证实以上推测，该研究拟在细胞分子水平探讨补肾活血胶囊含药血清调控BMSCs成骨与成脂分化以治疗激素性股骨头坏死的作用与关键机制。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学体外分化实验。
1.2 时间及地点实验于2018年4月至2019年6月在中国人民解放军总医院骨科研究所细胞实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物选取健康SPF级雄性4周龄SD大鼠8只，体质量150-200 g；8周龄SD大鼠40只，体质量300-320 g，购于斯贝福(北京)生物技术有限公司，饲养于中国人民解放军总医院实验动物中心，实验动物许可证号：SCXK (京)2016-0002。实验前在特定的无菌实验室条件下适应性饲养1周，正式实验中分笼标准饲料喂养，每笼3只，室温21-25 ℃，相对湿度45%-60%，每日正常光照，空气流通，自由摄食、饮水。所有实验和动物护理程序均经中国人民解放军总医院动物研究伦理委员会批准，并按照国家卫生研究院“实验动物保护和使用指南”和“动物在研究中：在活体实验中的报告”指南的规定执行[16-17]。
1.3.2 相关试剂的配制
地塞米松磷酸钠储存液：取0.515 mL地塞米松磷酸钠注射液加入49.485 mL低糖DMEM培养基中，混匀，配制成10-4 mol/L的地塞米松磷酸钠储存液，0.22 μm微孔滤器过滤除菌。
细胞干预培养液：①体积分数为10%大鼠含药血清的低糖DMEM培养液配制：取不同组别大鼠含药血清5 mL加入45 mL低糖DMEM培养基中，混匀，0.22 μm微孔滤器过滤除菌；②体积分数为10%大鼠含药血清+激素的低糖DMEM培养液配制：取不同组别大鼠含药血清5 mL和0.5 mL
地塞米松磷酸钠储存液加入44.5 mL 低糖DMEM培养基中，混匀，0.22 μm微孔滤器过滤除菌。
1.3.3 补肾活血胶囊药液的制备所有中药均由山东中医药大学附属医院药剂中心统一采购并一次性加工成冻干粉，4 ℃保存备用。参照前期研究[14]，将补肾活血胶囊临床剂量等效换算成大鼠的量设定为中剂量，其草药制备浓度应为0.066 15 g/mL，低剂量为中剂量的1/2，高剂量为中剂量的2倍。
1.4 实验方法
1.4.1 补肾活血胶囊含药血清的制备
动物分组及干预方法：适应性喂养1周后称质量，按照随机区组设计将全部40只大鼠随机分为4组：空白对照组、补肾活血胶囊低剂量组、补肾活血胶囊中剂量组及补肾活血胶囊高剂量组，给予10 mL/kg 补肾活血胶囊不同剂量药液或生理盐水灌胃，2次/d，早晚各半量，连续7 d。
SD大鼠补肾活血胶囊含药血清的制备：第7天上午和中午各半量灌胃1次，末次灌胃1 h后，用3%戊巴比妥钠45 g/kg麻醉，腹主动脉取血，4 ℃冰箱内静置2 h，3 000 r/min离心20 min，用5 mL一次性移液管吸取上层血清，同组含药血清合并，56 ℃水浴30 min灭活，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，-20 ℃保存备用。
1.4.2 BMSCs原代培养、传代及鉴定取SPF级4周龄SD大鼠，脱颈处死后，双下肢及腹部备皮，置于体积分数为75%乙醇中浸泡15 min，将大鼠仰卧在超净台的干净培养皿上，外科剪暴露股骨远端肌肉，清理去除股骨远端表面附着的软组织，斜嘴钳剪断股骨远端骨骺，显露骨髓腔，用5 mL注射器吸取2.0-3.0 mL含体积分数为10%胎牛血清的低糖DMEM培养液，直接插入股骨骨髓腔内冲出股骨近端及股骨干内的骨髓，转移骨髓悬液至15 mL离心管中，800 r/min室温离心5 min，弃上清，用6 mL含体积分数为10%胎牛血清的低糖DMEM培养液重悬，轻轻吹打数次后制成单细胞悬液，接种于细胞培养瓶中，将细胞培养瓶置于37 ℃、体积分数为5% CO2饱和湿度培养箱中培养；静置36-48 h后，倒置显微镜下观察细胞形态与生长情况，进行半量换液，去除漂浮的血细胞；以后每两三天全量换液，直至细胞融合。
待细胞融合至70%-90%时开始传代，吸去培养液，以3 mL预热的PBS轻轻冲洗细胞两三次后，吸去PBS，加入1 mL胰蛋白酶消化两三分钟，镜下观察至细胞回缩变圆，终止消化，轻柔反复吹打培养瓶底壁，将细胞悬液转移至15 mL离心管中，800 r/min离心5 min，弃去上清，加入3 mL含体积分数为10%胎牛血清的低糖DMEM培养基重悬细胞，轻轻吹打摇匀，制成单细胞悬液，置于37 ℃、体积分数为5% CO2饱和湿度培养箱中培养，倒置相差显微镜观察细胞形态与生长情况。
待细胞传代至第3代时，PBS洗涤2遍，1 mL胰蛋白酶消化，待细胞回缩变圆时终止消化，800 r/min离心5 min，PBS洗涤2遍，再次加入PBS制成浓度1×109 L-1细胞悬液。每个样本取出2份，各100 μL，分别加入抗CD29-FITC、抗CD34-FITC、抗CD45-FITC、抗CD90-FITC和抗CD105-FITC抗体，室温下孵育15 min，采用流式细胞仪检测大鼠BMSCs表面标记抗原CD29、CD34、CD45、CD90、CD105表达鉴定其表型。取第3代BMSCs，按照OriCellTMSD大鼠BMSCs成骨诱导分化培养基试剂盒、OriCellTMSD大鼠BMSCs成脂诱导分化培养基试剂盒与OriCellTMSD大鼠BMSCs成软骨诱导分化培养基试剂盒进行培养，每隔3 d 换液1 次，分别诱导21，14，28 d 后进行茜素红染色、油红O 染色及阿利辛蓝染色，并进行拍照。

1.4.3 细胞分组取第3代大鼠BMSCs进行传代，以5×107 L-1接种，待细胞完全贴壁后，约接种12 h分为8组：空白对照组、补肾活血胶囊低剂量组、补肾活血胶囊中剂量组、补肾活血胶囊高剂量组、激素组、补肾活血胶囊低剂量+激素组、补肾活血胶囊中剂量+激素组及补肾活血胶囊高剂量+激素组。
1.4.4 CCK-8法检测细胞增殖情况取第3代SD大鼠BMSCs制成单细胞悬液，稀释细胞浓度至2×106 L-1，接种于96孔板中，每组6孔，每孔100 μL，待细胞长满瓶底80%以上时，按照实验分组，每孔加入空白血清、低、中、高剂量补肾活血胶囊含药血清和激素处理，设置1，3，5，7 d时间点，每个时间点3个重复。在对应时间内向相应孔内加入10 μL的CCK-8溶液，在培养箱内孵育3 h，用酶标仪在450 nm处测定吸光度值。
1.4.5 茜素红染色取第3代大鼠BMSCs，加入胰蛋白酶消化重悬成单个细胞悬液，细胞计数后以2×104/cm2的细胞密度接种在标记好的6孔板中继续培养，待细胞融合度达到60%-70%时，更换培养基，分别加入2 mL含不同剂量补肾活血胶囊含药血清的成骨诱导分化完全培养基，根据赛业生物科技提供的说明配制诱导液进行诱导成骨分化，诱导两三周后，视细胞的形态变化及生长情况进行茜素红染色，显微镜下观察成骨染色效果。
1.4.6 油红O染色取第3代大鼠BMSCs，加入胰蛋白酶消化重悬成单个细胞悬液，细胞计数后以2×104/cm2的细胞密度接种在标记好的6孔板中继续培养，待细胞融合度达到100%或者过融合，更换培养基，分别加入2 mL含不同剂量补肾活血胶囊含药血清的成脂诱导分化培养基A液和B液，根据赛业生物科技提供的说明配制诱导液进行诱导成脂分化，诱导两三周后，视细胞的形态变化及生长情况进行油红O染色，显微镜下观察成脂染色效果。
1.4.7 Western blot分析取第3代大鼠BMSCs，加入胰蛋白酶消化重悬成单个细胞悬液，细胞计数后以1×105/cm2的细胞密度接种于标记好的25 cm2细胞培养瓶中继续培养，待细胞融合度达到60%-70%时，更换培养基，分别加入5 mL含不同药物血清的低糖DMEM培养基，诱导3 d后，采用Western blot检测成骨相关因子(Runx2、Col1a1)、成脂相关因子(C/EBPα、PPARγ)及Hedgehog信号通路相关因子(SHH、Gli1、Gli2)的蛋白表达水平，其中计算含30 μg蛋白的溶液体积定义为上样量。
1.5 主要观察指标 ①BMSCs的形态以及成骨、成脂、成软骨诱导分化能力鉴定；②流式细胞术对BMSCs表面抗原特性鉴定；③CCK-8法检测BMSCs的增殖能力；④Western blot 检测BMSCs成骨(Runx2、Col1a1)、成脂(C/EBPα、PPARγ)及Hedgehog信号通路相关因子(SHH、Gli1、Gli2)的蛋白表达水平。
1.6 统计学分析采用SPSS 19.0对所得数据进行统计分析，计数资料以率或构成比表示，计量资料以x±s表示，两组比较采用χ2检验或两样本Wilcoxon秩和检验，多组间比较采用单因素方差(ANOVA)分析，组内治疗前后比较采用t检验，各组间数据的比较应用t检验或重复测量设计方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

中药血清药理学方法是体外含药血清的药理学功效尽可能准确地反映体内药物的生物转化情况和机体一定时间的血药浓度，有效避免了中药粗制剂自身理化性质产生的诸多混杂干扰因素[18]。中药血清存在一定的时效关系和量效关系，不同的灌胃给药时间和采血时间会导致所获得的含药血清的血药浓度不同，不同的灌胃量也会引起含药血清的血药浓度差异[19]。若保持灌胃次数、给药时间和采血时间等条件基本一致的情况下，含药血清的药物浓度将直接取决于动物的给药剂量[20]。该研究参照前期预实验确定动物灌胃给药剂量，按人体与动物等效剂量倍数换算，以成人临床等效剂量为中剂量组，相当于草药生药剂量为2.826 g/(kg·d)。这种给药剂量计算方法在一定程度上避免了固定容量给药和单位体质量容量给药不能准确反映物种间血清和效量关系差异等弊端，更好地反映临床实际用量[21]。
BMSCs在一定条件下可分化为脂肪细胞、软骨细胞、骨细胞等[22]，在BMSCs分化过程中，骨髓中成脂与成骨呈负相关[23]。在生理状态下BMSCs的成骨-成脂分化应处于动态平衡状态，但当外源性糖皮质激素不合理应用时会导致这种平衡状态被打破[24]。体外研究表明，一定剂量糖皮质激素能诱导BMSCs分化为大量脂肪细胞，抑制其成骨分化[25]；体内研究表明，对于糖皮质激素相关的股骨头坏死，BMSCs在细胞和分子水平上均表现出高脂质分化和骨生成减少[26-27]；临床研究表明，激素性股骨头坏死患者的BMSCs功能明显下降，主要表现在其增殖活性明显降低，分化能力减弱[28-29]。
中医文献中并没有“激素性股骨头坏死”这一病名的记载，依据其病因病机及症候表现，可将其归属于“骨痹”“骨痿”“骨蚀”等范畴。补肾活血胶囊是课题组治疗激素性股骨头坏死的中药经验方，重在补肾健骨，兼以活血化瘀，临床疗效显著。课题组前期网络药理学研究结果显示，木犀草素、槲皮素、谷甾醇和山奈酚等活性成分与激素性股骨头坏死中的多个靶点相互作用[14]，进而调节细胞异常增殖、慢性炎症、脂质代谢紊乱和诱导血管生成等机制。该研究CCK-8结果显示，糖皮质激素能显著抑制大鼠BMSCs的增殖活性，而补肾活血胶囊含药血清能明显改善糖皮质激素对BMSCs增殖的抑制效应；茜素红染色显示，补肾活血胶囊含药血清能增加矿化结节的积聚，促进大鼠BMSCs的成骨分化能力；油红O染色显示，补肾活血胶囊含药血清能降低BMSCs的脂质沉积，抑制大鼠BMSCs的成脂分化能力。该研究结果与以前的研究基本保持一致，也进一步证实了BMSCs成骨-成脂分化失衡假说是糖皮质激素导致激素性股骨头坏死的重要微观机制[30-32]。
BMSCs的成脂-成骨分化状态依赖于多种信号通路和转录因子的共同调控[29-33]，脂肪发生与成骨之间存在着负相关关系，被认为是一种拉锯法，一种谱系的诱导是以牺牲另一种谱系为代价的[34]。Hedgehog信号通路是被公认的促进BMSCs成骨分化、抑制其成脂分化的信号通路之一[35-37]。
Shh是细胞分化的关键调节因子，在BMSCs中显示出成骨和抗脂肪生成的特性[38]。促进BMSCs成骨及成脂分化的信号级联主要集中在两个关键的转录因子：PPARγ和Runx2[39]。Runx2是一种BMSCs分化为成骨细胞系所必须且关键的转录因子[40]，若缺失Runx2基因则导致小鼠矿化功能减弱、骨基质内成骨细胞减少。PPARγ是类固醇/甲状腺激素受体基因超家族的成员，是调节脂肪细胞分化和形成过程中的关键因子，同时也能负性调控成骨相关因子Runx2抑制骨形成[41]。一般情况下，Runx2和PPARγ很大程度上共同介导多种信号因子调控BMSCs成骨-成脂分化的平衡与稳态，两者相互协调、相互制约[42]。此外，Col1a1是成骨细胞分泌的反映骨代谢情况的有效指标，与Runx2相互作用能有效评价骨形成和骨转换，对提高骨强度及保持骨架的完整性具有重要意义[43]；
C/EBPα 是在脂肪细胞分化过程中起重要作用的特异性标记物，能被PPARγ激活且与其协同发挥作用，而C/EBPα也能正反馈于PPARγ的表达[44]。
该研究Western blot结果显示，一定剂量的糖皮质激素能显著降低Col1a1和Runx2的蛋白表达，提高C/EBPα和PPARγ的蛋白表达，而补肾活血胶囊含药血清能明显提高Runx2、Col1a1的蛋白表达，降低C/EBPα和PPARγ蛋白表达至空白对照组水平；此外，补肾活血胶囊含药血清低、中、高剂量组较激素组的Shh和Gli1蛋白表达活性也明显升高。上述结果表明：补肾活血胶囊含药血清可能通过介导Shh和Gli1激活Hedgehog信号通路上调Runx2、Col1a1的蛋白表达促进BMSCs的成骨分化，下调PPARγ、C/EBPα的蛋白表达抑制BMSCs的成脂分化，进而调控大鼠BMSCs成骨-成脂分化的平衡与稳态。
综上所述，补肾活血胶囊含药血清不仅能改善糖皮质激素对大鼠BMSCs增殖的抑制作用，而且可能通过Hedgehog信号通路有效促进大鼠BMSCs的成骨分化和抑制其成脂分化，进一步阐释中医学“肾主骨生髓”的经典理论，为临床治疗提供新的靶点与途径，提高中药治疗骨代谢疾病的科学性和有效性，拓展其发展空间。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

补肾活血胶囊介导Hedgehog信号通路调控大鼠骨髓间充质干细胞成骨成脂分化

Bushen Huoxue capsule regulates osteogenic and adipogenic differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells via Hedgehog signaling pathway

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