糖尿病骨质疏松症模型小鼠脂肪干细胞的成骨能力

doi:10.12307/2022.135

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (7): 999-1004.doi: 10.12307/2022.135

• 脂肪干细胞 adipose-derived stem cells • 上一篇下一篇

糖尿病骨质疏松症模型小鼠脂肪干细胞的成骨能力

高俞锦1，彭双麟 1，马治超1，陆诗1，曹花月1，王浪 1，肖金刚1，2，3

1西南医科大学口腔医学院，四川省泸州市 646000；2西南医科大学附属医院口腔颌面外科，四川省泸州市 646000；3西南医科大学口颌面修复重建和再生实验室，四川省泸州市 646000

收稿日期:2021-03-18 修回日期:2021-03-20 接受日期:2021-04-23 出版日期:2022-03-08 发布日期:2021-10-29
通讯作者: 肖金刚，博士，教授，西南医科大学口腔医学院，四川省泸州市 646000；西南医科大学附属医院口腔颌面外科，四川省泸州市 646000；西南医科大学口颌面修复重建和再生实验室，四川省泸州市 646000
作者简介:高俞锦，女，1995年生，浙江省绍兴市人，西南医科大学在读硕士，主要从事口腔种植的临床与基础研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81870746)，项目负责人：肖金刚；泸州市人民政府-西南医科大学科技战略合作项目(2020LZXNYDZ09)，项目负责人：肖金刚

Osteogenic ability of adipose stem cells in diabetic osteoporosis mice

Gao Yujin1, Peng Shuanglin1, Ma Zhichao1, Lu Shi1, Cao Huayue1, Wang Lang1, Xiao Jingang1, 2, 3

1School of Stomatology of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; 2Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; 3Orofacial Reconstruction and Regeneration Laboratory of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China

Received:2021-03-18 Revised:2021-03-20 Accepted:2021-04-23 Online:2022-03-08 Published:2021-10-29
Contact: Xiao Jingang, MD, Professor, School of Stomatology of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; Orofacial Reconstruction and Regeneration Laboratory of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China
About author:Gao Yujin, Master candidate, School of Stomatology of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81870746 (to XJG); the Science and Technology Strategic Cooperation Project of Luzhou Municipal People’s Government-Southwest Medical University, No. 2020LZXNYDZ09 (to XJG)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
长链非编码RNA-DANCR：长链非编码RNA是一类不编码蛋白且长度超过200个核苷酸的RNA，通过多种方式调控基因表达。分化拮抗非蛋白编码RNA-DANCR作为长链非编码RNA因其抑制祖细胞分化而被关注，其在细胞分化过程中下调。DANCR在多种疾病模型中显示能够影响细胞的增殖分化。
糖尿病性骨质疏松：是糖尿病常见的并发症，常伴发骨量的丧失和骨结构的破坏，增加骨折风险。
背景：长链非编码RNA(long noncoding RNA，LncRNA)-DANCR可调节包括骨代谢的多个生物学过程。课题组基因芯片结果显示糖尿病骨质疏松小鼠脂肪组织中LncRNA-DANCR显著高表达。
目的：探究LncRNA-DANCR通过Wnt/β-catenin信号通路对糖尿病骨质疏松小鼠脂肪干细胞成骨能力的影响。
方法：分离培养糖尿病骨质疏松小鼠和正常对照小鼠脂肪干细胞，成骨诱导3 d后，采用qRT-PCR、Western blot检测LncRNA-DANCR、Wnt信号分子β-catenin以及成骨转录因子(RUNX2、OPN)的表达。设计LncRNA-DANCR特异性siRNA转染糖尿病骨质疏松小鼠脂肪干细胞，成骨诱导3 d后，采用qRT-PCR、Western blot和碱性磷酸酶染色检测Wnt信号分子β-catenin、成骨转录因子(RUNX2、OPN)的表达以及成骨能力改变。
结果与结论：①成骨诱导3 d后，糖尿病骨质疏松小鼠脂肪干细胞的LncRNA-DANCR表达水平显著高于正常对照小鼠脂肪干细胞，Wnt信号分子β-catenin和成骨转录因子RUNX2、OPN的表达显著低于正常对照小鼠脂肪干细胞；②siRNA转染糖尿病骨质疏松小鼠脂肪干细胞成骨诱导3 d后，β-catenin以及RUNX2、OPN显著高表达，成骨能力增强；③结果表明，LncRNA-DANCR通过抑制Wnt/β-catenin信号通路降低糖尿病骨质疏松小鼠脂肪干细胞的成骨能力，沉默LncRNA-DANCR可恢复其成骨能力。

https://orcid.org/0000-0003-1300-7191(肖金刚)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 长链非编码RNA, Wnt信号通路, 糖尿病, 骨质疏松, 骨向分化, 骨修复

Abstract: BACKGROUND: Long noncoding RNA (LncRNA)-DANCR can regulate multiple biological processes, including bone metabolism. Our gene microarray results showed that LncRNA-DANCR was significantly overexpressed in diabetic osteoporosis mice.
OBJECTIVE: To investigate the effect of LncRNA-DANCR on the osteogenic ability of adipose stem cells in diabetic osteoporosis through Wnt/β-catenin signaling pathway.
METHODS: Diabetic osteoporosis adipose-derived stem cells and control adipose-derived stem cells were isolated and cultured. After 3 days of osteogenic induction, real-time fluorescence quantitative PCR and western blot assay were used to examine the expression of LncRNA-DANCR, Wnt signaling molecules β-catenin and osteogenic transcription factors (RUNX2 and OPN). Diabetic osteoporosis adipose-derived stem cells transfected with lncRNA-DANCR-specific siRNA were designed. After 3 days of osteogenic induction, real-time fluorescence quantitative PCR, western blot assay and alkaline phosphatase staining were used to examine the expression of Wnt signaling molecules β-catenin, osteogenic transcription factors RUNX2 and OPN and osteogenic ability changes.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) After 3 days of osteogenic induction, the expression level of LncRNA-DANCR in diabetic osteoporosis adipose-derived stem cells group was significantly higher than that in control group. The expression levels of Wnt signaling molecule β-catenin and osteogenic transcription factors RUNX2 and OPN were significantly lower than those in control adipose-derived stem cells. (2) After 3 days of osteogenic induction, β-catenin and RUNX2 and OPN were highly expressed in the siRNA silent group, and the ability of bone formation was enhanced. (3) The results confirmed that LncRNA-DANCR decreased the osteogenic capacity of diabetic osteoporosis adipose-derived stem cells by inhibiting the Wnt/β-catenin signaling pathway. Silencing of LncRNA-DANCR can restore the reduced osteogenic capacity.

Key words: long noncoding RNA, Wnt signaling pathway, diabetes, osteoporosis, osteogenic differentiation, bone repair

中图分类号:

高俞锦, 彭双麟, 马治超, 陆诗, 曹花月, 王浪, 肖金刚. 糖尿病骨质疏松症模型小鼠脂肪干细胞的成骨能力[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 999-1004.

Gao Yujin, Peng Shuanglin, Ma Zhichao, Lu Shi, Cao Huayue, Wang Lang, Xiao Jingang. Osteogenic ability of adipose stem cells in diabetic osteoporosis mice[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(7): 999-1004.

图/表（结果） 9

2.1 两组小鼠ASCs的形态及流式鉴定结果原代细胞从组织块边上爬出，贴壁，呈长梭形；第1代细胞界限清晰，呈长梭形，大小均匀，融合至70%-80%时呈漩涡状或者放射状排列，见图1。流式细胞仪检测CD29、CD44、CD90呈阳性表达，CD34和CD35呈阴性表达，见图2。

2.2 两组小鼠ASCs LncRNA-DANCR基因芯片检测结果在糖尿病性骨质疏松症组小鼠ASCs中LncRNA-DANCR的表达高于对照组小鼠ASCs(P < 0.05)，见图3。

2.3 两组小鼠ASCs LncRNA-DANCR、Wnt信号分子β-catenin和成骨转录因子Runx2、Opn的表达差异成骨诱导3 d，与对照组小鼠ASCs相比，糖尿病性骨质疏松症小鼠ASCs中LncRNA-DANCR水平升高，Wnt信号分子β-catenin以及成骨转录因子Runx2和Opn的mRNA、蛋白表达均显著降低(P < 0.05)，见图4，5。

2.4 siRNA沉默糖尿病性骨质疏松症小鼠ASCs后qRT-PCR检测结果与空白对照组和阴性对照组相比，siRNA沉默组LncRNA-DANCR表达显著降低，Wnt信号通路分子β-catenin以及成骨转录因子Runx2和Opn表达均升高(P < 0.05)，见图6。
2.5 siRNA沉默糖尿病性骨质疏松症小鼠ASCs后Western blot分析结果与空白对照组和阴性对照组相比，siRNA沉默组Wnt信号通路分子β-Catenin以及成骨分化相关蛋白RUNX2和OPN表达均显著增加(P < 0.05)，见图7。

2.6 碱性磷酸酶染色分析结果成骨诱导第3，5天，与空白对照组和阴性对照组相比，siRNA沉默组碱性磷酸酶染色更深，活性显著升高，见图8，9。

参考文献

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引言

糖尿病性骨质疏松症是由慢性高血糖、晚期糖化终末产物刺激和氧化应激引起的，是一种糖尿病常见并发症，糖尿病微环境往往破坏骨微结构，增加骨质疏松症的发生率和骨折风险，严重影响患者生活质量[1-3]。糖尿病骨质疏松以及伴骨折或骨缺损的治疗是目前难以解决的医学难题。
长链非编码RNA (long noncoding RNAs，LncRNA)是一类长于200个核苷酸的非编码RNA[4]，通过多种方式对遗传、转录及转录后水平进行调控，可介导多种疾病的发生发展，其中包括骨质疏松症[5-6]。
脂肪干细胞(adipose-derived stem cells，ASCs)因其具有自我更新能力、高增殖能力和成骨分化潜能，在组织工程和再生医学领域有着广阔的应用前景[7]。课题组前期基因芯片分析结果表明糖尿病性骨质疏松症小鼠ASCs和对照组小鼠ASCs中LncRNA-DANCR表达存在统计学差异，糖尿病性骨质疏松症小鼠ASCs中LncRNA-DANCR显著高表达[8]。同时，有研究表明LncRNA-DANCR可通过Wnt/β-catenin信号通路调节细胞成骨能力，激活该通路将导致骨量和骨强度增加，抑制该通路则导致骨量和骨强度降低[9-10]。然而在糖尿病高糖环境下，LncRNA-DANCR对糖尿病性骨质疏松症小鼠ASCs成骨能力的作用机制尚不清楚。
此次研究设计针对LncRNA-DANCR的siRNA转染糖尿病性骨质疏松症小鼠ASCs，检测LncRNA-DANCR、Wnt信号分子β-catenin以及成骨转录分子(RUNX2、OPN)的表达，并进行碱性磷酸酶染色检测糖尿病性骨质疏松症小鼠ASCs的成骨能力改变，探讨LncRNA-DANCR通过Wnt/β-catenin信号通路对糖尿病性骨质疏松症小鼠ASCs成骨能力的影响，以期为糖尿病骨质疏松症伴骨缺损的治疗提供新思路。

材料方法

1.1 设计细胞学实验，组间比较采用单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2020年5月至2021年2月在西南医科大学实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物雌性C57小鼠20只，3周龄，体质量约16 g，购于西南医科大学基础医学部实验动物中心。
1.3.2 实验仪器与试剂荧光倒置显微镜(OLYMPUS，日本)；石蜡切片机 (Leica，德国)；实时荧光定量PCR仪(Thermo，美国)；PAGE电泳仪和转膜仪(Bio-Rad，美国)；SELLECK自动转染仪(Bimake，美国)；α-MEM培养基(Hyclone，美国)；细胞RNA快速提取试剂盒(天根，中国)；反转录试剂盒(Thermo，美国)；荧光定量PCR试剂盒(Qiagen，德国)；SDS-PAGE凝胶试剂盒(碧云天，中国)；C57小鼠脂肪间充质干细胞成骨诱导分化培养基(赛业，中国)；JM-siRNA干扰套装(吉玛基因，中国)；riboFECT CP转染试剂盒(Ribobio，中国)；BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒(Beyotime，中国)。
1.4 实验方法
1.4.1 建立糖尿病骨质疏松小鼠模型 20只C57小鼠随机分为对照组和糖尿病骨质疏松模型组，每组10只，糖尿病骨质疏松模型组小鼠给予高脂高糖饲料喂养4周，一次性腹腔注射链脲佐菌素(120 mg/kg)，注射链脲佐菌素前禁食(不禁水)12 h
以上，注射后继续高脂高糖饲料喂养，当隔夜空腹血糖达到11.2-16.7 mmol/L为造模成功。对照组小鼠普通饲料喂养4周，注射等量柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，注射后继续普通饲料喂养。
1.4.2 ASCs分离、培养及鉴定断颈法处死糖尿病骨质疏松小鼠和对照组小鼠，体积分数为75%乙醇消毒皮肤，沿腹股沟剪开皮肤，暴露皮下组织，仔细剥离腹股沟皮下脂肪组织，洗涤后的脂肪组织盛于洁净的培养皿中，用手术剪剪碎，之后将组织块分散铺于T25细胞培养瓶中，静置5 min
左右，加入适量α-MEM培养基(含体积分数为10%胎牛血清，1%青链霉素)，置于37 ℃，体积分数为5%CO2恒温培养箱中培养，定期更换培养基，待细胞融合达90%后加入胰酶消化，按1∶1比例传代。
将第3代ASCs常规消化离心，去上清，预冷的PBS重悬，分装于6个1.5 mL EP管中，1 000 r/min离心5 min，
弃上清，每管加入300 μL PBS重悬，其中5个管分别加入流式抗体CD29、CD44、CD90.2、CD34和CD45，预留1个管为空白对照，抗体孵育20 min后上流式细胞仪检测。

1.4.3 基因芯片检测LncRNA水平使用Arraystar RNA Flag Labeling Kit对第3代ASCs进行标记，使用Agilent SureHyb进行杂交实验，与芯片杂交后，经Agilent DNA Microarray canner扫描得到荧光信号，Agilent GeneSpring GX v12.1软件进行芯片标准化分析。
1.4.4 两组ASCs的成骨诱导分化将第2代对照组小鼠ASCs和糖尿病性骨质疏松症小鼠ASCs以5×104个细胞密度接种于6孔板中，加入成骨诱导分化培养基培养3 d，提取RNA和蛋白，进行qRT-PCR和Western blot检测。
1.4.5 qRT-PCR检测LncRNA-DANCR、Wnt信号分子β-catenin和成骨转录因子RUNX2、OPN的mRNA表达成骨诱导3 d，应用RNA提取试剂盒从细胞中分离纯化总RNA，RT试剂盒反转录成cDNA，qRT-PCR 进行cDNA扩增。引物序列见表1。

1.4.6 Western blot检测Wnt信号分子及成骨转录因子的表达成骨诱导3 d，采用全蛋白提取试剂盒提取细胞全蛋白，配制10% SDS-PAGE胶，根据目的蛋白切取相应的凝胶，准备合适大小的PVC膜，采用湿转法转膜；用TBST配制5%脱脂奶封闭PVC膜1 h，TBST漂洗3次，10 min/次；加入对应的已稀释的一抗β-Catenin(1∶1 000，abcam ，ab32572)，RUNX2(1∶1 000，abcam，ab92336)，OPN(1∶1 000，
abcam，ab8448)，GAPDH(1∶1 000，CST，5174)，4 ℃冰箱摇床过夜，回收一抗后TBST漂洗3次，10 min/次，室温孵育二抗1 h，TBST漂洗2次，5 min/次。采用ECL发光液进行目的蛋白显影，分析各条带灰度值。
1.4.7 细胞转染将第2代糖尿病性骨质疏松症小鼠ASCs以5×104个细胞密度接种于6孔板，分为空白对照组、阴性对照组、siRNA沉默组，种板48 h后参照说明书，应用SELLECK
自动转染仪进行siRNA转染沉默LncRNA-DANCR，转染24 h后更换培养基为成骨诱导液，成骨诱导3 d后提取RNA和蛋白，通过qRT-PCR和Western blot检测LncRNA-DANCR、Wnt信号分子β-catenin和成骨转录因子RUNX2、OPN的表达。
1.4.8 碱性磷酸酶活性检测取第2代糖尿病性骨质疏松症小鼠ASCs以5×104个细胞密度接种于12孔板，分为空白对照组、阴性对照组、siRNA沉默组，种板48 h后应用riboFECT CP转染试剂盒，按照说明书步骤对细胞进行转染，转染48 h后换培养基为成骨诱导液，成骨诱导3 d和5 d，弃孔板中的培养基，PBS洗涤1次后每孔加入1 mL 40 g/L多聚甲醛固定30 min，丢弃多聚甲醛溶液，PBS洗涤1次，将水完全吸干净，每孔缓慢加入500 μL碱性磷酸酶染液，室温避光孵育30 min左右，显色至预期深浅后去除染色工作液，PBS洗涤一两次后应用照相机拍摄以及荧光倒置显微镜下观察。
1.5 主要观察指标 ①LncRNA-DANCR的表达；②Wnt信号通路分子β-catenin的表达；③成骨分化相关因子RUNX2、OPN mRNA和蛋白水平表达；④碱性磷酸酶活性。
1.6 统计学分析数据用SPSS 17.0统计软件行单因素方差分析，结果以x±s形式进行资料描述。双侧α=0.05，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

糖尿病性骨质疏松症是糖尿病常见的并发症，其特征是糖尿病并发骨量丧失和骨结构退化。正常骨结构的丧失以及持续的糖尿病微环境可影响新生骨小梁和骨微结构的形成，进一步影响糖尿病性骨质疏松症骨折的愈合[11-13]。目前，糖尿病骨质疏松症患者骨折或骨缺损的治疗仍面临着巨大挑战。
以种子细胞、支架材料和生长因子为基础的骨组织工程为骨折、骨缺损、肿瘤等引起的骨量不足修复提供了一种有前途的方法[14-15]。ASCs作为多功能干细胞，具有多向分化潜能，同时可分泌生长因子，引起旁分泌和自分泌反应，可诱导骨再生。ASCs可大量获得，获取方式创伤小，较少有供体部位的发病或患者的不适[14，16]，由此被认为是用于骨组织工程的很有前景的种子细胞[17]。该实验获取C57小鼠腹股沟脂肪，采用组织块法分离培养ASCs，发现糖尿病性骨质疏松症小鼠ASCs成骨能力降低，通过基因修饰后再进行成骨诱导，为骨质疏松症伴骨缺损的骨再生和骨重建提供一种新的选择。
LncRNA作为表观遗传调节因子，可通过染色质修饰、转录和转录后水平调控基因表达，影响了包括骨代谢在内的多个生物学过程[18]，可参与调控成骨细胞相关的骨形成和破骨细胞相关的骨重塑[19]。LncRNA的异常水平往往与人类疾病的发生发展密切相关[4]。LncRNA-DANCR自从被发现可抑制祖细胞分化以来，其在骨代谢失衡疾病中的作用引起了广泛关注[20]。该实验中，基因芯片和体外验证结果均显示，与对照组小鼠ASCs相比，糖尿病性骨质疏松症小鼠ASCs中LncRNA-DANCR表达升高，同时成骨转录因子RUNX2和OPN在mRNA和蛋白水平表达均降低，表明高水平的 LncRNA-DANCR可能减弱糖尿病性骨质疏松症小鼠ASCs的成骨能力。
经典Wnt信号通路已被证明参与多种细胞过程，包括干细胞增殖分化以及骨代谢平衡等，通过调节转录共激活因子β-catenin的泛素化降解以及核转移控制关键的基因表达程序，包括下游成骨关键信号分子RUNX2和OPN的表达[21-23]。有研究表明LncRNA-DANCR通过抑制Wnt/β-catenin通路抑制人牙髓细胞成牙细胞样分化[24]。JIANG等[25]发现LncRNA-DANCR可通过影响成骨细胞Wnt/β-catenin信号通路从而影响其骨向分化。实验结果显示糖尿病性骨质疏松症小鼠ASCs中β-catenin表达降低，说明糖尿病性骨质疏松症小鼠ASCs中Wnt/β-catenin信号通路被抑制。随后，实验设计了LncRNA-DANCR特异性siRNA转染糖尿病性骨质疏松症小鼠ASCs，结果显示LncRNA-DANCR表达降低，Wnt信号分子β-catenin和成骨转录因子RUNX2和OPN在mRNA和蛋白水平表达均升高，碱性磷酸酶的分泌及矿化亦增加，说明沉默LncRNA-DANCR可激活Wnt/β-catenin信号通路，从而增强糖尿病性骨质疏松症小鼠ASCs的骨向分化和骨形成能力。然而，依据国内外研究结果，LncRNA可能通过ceRNA机制内源性竞争或者通过改变DNA甲基化程度调控相关mRNA的表达和转录[8-9]，LncRNA-DANCR在糖尿病性骨质疏松症小鼠ASCs中表达增高以及对β-catenin信号分子的具体作用机制还有待进一步研究。
综上所述，LncRNA-DANCR通过抑制Wnt/β-catenin信号通路降低了糖尿病性骨质疏松症小鼠ASCs成骨分化及骨形成能力，沉默LncRNA-DANCR可增强糖尿病性骨质疏松症小鼠ASCs的成骨能力，为LncRNA-DANCR作为靶点修饰糖尿病性骨质疏松症小鼠ASCs治疗糖尿病骨质疏松症伴骨缺损提供实验基础。

糖尿病骨质疏松症模型小鼠脂肪干细胞的成骨能力

Osteogenic ability of adipose stem cells in diabetic osteoporosis mice

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