2.1   实验动物数量分析   18只SD大鼠骨髓炎造模全部成功，观察过程中无动物死亡及丢失，所有结果进入数据分析。
2.2   大鼠体温变化   检测造模前1 d至造模后1周的体温，取平均值统计分析后显示术前检测大鼠体温在37 ℃以下，造模后第2天体温开始升高，至造模后第4，5天升至最高达到38.8 ℃，造模后第7，8天时温度逐渐恢复至造模前体温范围，见图3。



2.3   切口愈合及瘘管形成以及胫骨大体标本情况   造模后第2周所有大鼠出现不同程度的红肿流脓，切口可见脓性分泌物；切开皮肤皮下后可见到瘘管形成；将胫骨取下，去除软组织，可以见到钻孔部位有脓性分泌物，钻孔未愈合，内有新生骨形成，见图4。



2.4   造模部位X射线片检查结果   造模后第4周右侧胫骨X射线片可观测到克氏针所在位置腔隙增大，死骨形成，且有新生骨形成包绕克氏针，皮质变薄部分出现不连续，钻孔处骨质愈合不良，见图5。



2.5   骨组织苏木精-伊红病理检查结果   将大鼠右侧胫骨取下，去除软组织，用EDTA脱钙液脱钙4周左右，取出克氏针后进行切片苏木精-伊红染色，光镜下见大量炎性细胞浸润骨髓腔，钻孔部位骨皮质未能愈合，骨髓腔能可见新生骨形成，见图6。



2.6   细菌分泌物培养鉴定   消毒无菌切开右侧胫骨造模部位皮肤，分离软组织，无菌蘸取大鼠钻孔部位分泌物在血琼脂培养板上进行培养，培养24 h后可见到单个金黄色葡萄球菌菌落形成，并有溶血环，见图7。



2.7   细菌质谱鉴定   将细菌分泌物培养菌落送至遵义医科大学检验科行细菌质谱鉴定，经过鉴定大鼠分泌物培养后形成的细菌均为金黄色葡萄球菌，见图8。



2.8   血清炎性指标检测结果   造模前尾部采血法抽取大鼠血液，分离血清保存于-80 ℃冰箱中，术后第4周心脏采血法采血后分离血清并行Elisa检测，可见造模后大鼠降钙素原、肿瘤坏死因子α以及白细胞介素10等血清炎症因子增高明显(P < 0.05)，差异有显著性意义，见图9。

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骨髓炎是骨的感染和破坏，可由需氧或厌氧菌、分枝杆菌及真菌等引起，其中最常见病原菌为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S. aureus)[1]。慢性骨髓炎好发于长骨，成人常见于创伤骨折术后感染、糖尿病患者血运较差的足部或由于创伤或手术引起的穿透性骨损伤部位，儿童最常见于血源性骨髓炎，常见部位为血供良好的长骨，如胫骨或股骨的干骺端[2-3]。临床上骨髓炎常反复发作，经久不愈，严重影响患者的身心健康，加重了家庭的经济负担，并且部分严重患者导致劳动力丧失[4]。骨髓炎急性发作时可有高热、局部疼痛，转为慢性骨髓炎时会有溃破、流脓、有死骨或空洞形成，重症患者可危及生命，有时不得不进行截肢，致患者残疾[5]。目前针对骨髓炎最常用的治疗方法是病灶彻底清除、带抗生素植骨[6]，治疗效果往往不理想，常需要多次手术和长期使用抗生素，且复发率很高[7-8]，因此骨髓炎的治疗依然是骨科医生的一大难题。
S. aureus成为骨髓炎感染的主要病原菌，在骨髓炎感染中75%为葡萄球菌，其中S. aureus占主要地位，S. aureus已成为一种威胁人类的主要病原体，导致各种疾病，从化脓性感染到威胁生命的感染如脓毒血症等[9]。生物膜是         S. aureus感染的主要途径和难治的原因之一，S. aureus生物膜协助其在骨组织定植感染，是一种对恶劣环境的适应性反应，增加了对抗生素的抗药性，削弱了宿主的免疫力，生物膜还加强了S. aureus对营养缺乏的耐受性[10]。防止生物膜形成和破坏生物膜可能成为治疗S. aureus感染的必要手段，有研究发现，通过槲皮素抑制细菌生物膜防止感染取得了一定成效，其在抑制生物膜的同时还降低了细菌的耐药性，促进了药物对细菌的杀灭作用[11]。
要探究骨髓炎的治疗方法，有效复制临床的骨髓炎模型是研究的基础和关键，在临床中以细菌生物膜导致骨髓炎的情况最多见，因此模拟细菌生物膜导致的骨髓炎模型对未来骨髓炎治疗的研究至关重要。以往均为直接滴加细菌进入钻孔内制作骨髓炎模型，与临床发病因素有明显区别，且滴入细菌悬液量不易控制，易导致模型动物死亡，此次研究建立新型S. aureus生物膜克氏针置入大鼠胫骨导致骨髓炎的模型，与临床内固定生物膜感染更加接近。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1   设计   自身前后对照，动物体内实验。
1.2   时间及地点   实验于2019年9月至2020年6月在遵义医科大学基础1号实验楼3楼生物化学实验室完成。
1.3   材料   SPF级雌性SD大鼠18只购自长沙市天勤生物科技有限公司，8周龄，体质量250 g左右，每笼饲养3只。给动物提供标准食物和水，实验前进行1周适应；所有动物的处理均遵照伦理规定进行，并通过遵义医科大学附属医院伦理审查委员会审查批准，批准号：KLLY-2019-074。
1.4   方法
1.4.1   细菌菌株与带菌克氏针制作   将金黄色葡萄球菌ATCC25923(遵义医科大附属医院检验科提供)标准株接种于血琼脂平板上，37 ℃恒温培养箱中孵育24 h后取出，接种环无菌挑取单个菌落至15 mL的氯化钠肉汤(青岛海博生物，中国)培养液中，并置于37 ℃的恒温摇菌箱中孵育18 h，调整细菌浓度到1×107 CFU/mL，取直径为1 mm、长度为5 mm无菌克氏针放置于细菌悬液中，继续于恒温摇菌箱中孵育18 h，用结晶紫(索莱宝，中国)染色克氏针证实有细菌生物膜形成[12]，见图1。

1.4.2   骨髓炎模型制作   腹腔注射3%戊巴比妥钠(遵义医科大学附属医院提供)30 mg/kg以麻醉大鼠。麻醉生效后固定大鼠四肢，右下肢备皮，碘伏消毒术区，铺一次性无菌治疗巾，在膝关节下沿胫骨前嵴内侧切开长约1 cm切口，在胫骨前肌内侧进入达骨膜，显露胫骨上端的前外侧面胫骨嵴，小心刮开骨膜，用直径1.5 mm钻头的手钻在此处钻骨洞，用小刮匙探查去除松质骨，将制备的带细菌生物膜克氏针头插入胫骨髓腔后用骨蜡将骨窗封闭，生理盐水反复冲洗后逐层缝合伤口，予单笼饲养，造模后观察4周，见图2。

1.4.3   骨髓炎检测指标 
体温检测：造模前检测大鼠体温情况，造模后1周连续检测大鼠体温变化，采用肛测法测量大鼠体温，将体温计探头置入大鼠肛门内距肛门口1.5-2.0 cm深度，约20 s后读数，对比术前术后大鼠体温变化情况。
切口愈合情况：造模后观察切口部位愈合情况及有无流脓。
影像学检查：造模后第4周后所有大鼠行X射线(遵义医科大学附属医院影像科)检测造模部位，采用正、侧位摄片，观察骨组织愈合情况。
大体标本情况：造模后第4周过量麻醉处死大鼠，将大鼠造模胫骨取下去除软组织，观察骨洞愈合情况，有无隧道形成及流脓。
骨病理苏木精-伊红染色：将骨胫骨放入EDTA脱钙液(索莱宝，中国)脱钙，每天更换脱钙液，用细针试探脱钙程度，待可轻松刺入骨皮质时为宜，将标本送至遵义医科大学附属医院病理科行石蜡包埋病理切片并行苏木精-伊红染色。
细菌培养及鉴定：将大鼠处死后无菌取钻孔部位分泌物涂到血琼脂平板进行画线培养，观察有无细菌菌落生长，将培养出的细菌利用质谱仪(全自动快速微生物质谱检测系统，Automated microbial identification system，法国)进行质谱鉴定，鉴定是否为克氏针上所接种细菌导致感染。
炎症因子检测：造模前后检测炎症因子，造模前采取大鼠尾部采血法，造模第4周戊巴比妥麻醉大鼠后，心脏采血法抽取血液，用无菌管收集，室温血液自然凝固10-20 min，2-8 ℃条件离心20 min左右(2 000-3 000 r/min)，仔细收集上清，用大鼠降钙素原、肿瘤坏死因子α以及白细胞介素10的Elisa盒子(Elabscience，中国)进行检测，使用多功能酶标仪(SpectraMax M2e，美国)检测吸光度并计算浓度，对比造模前后大鼠炎症因子变化情况。
1.5   主要观察指标   大鼠体温变化、切口愈合及流脓情况、影像学检查、大体骨标本钻孔愈合情况、细菌培养、骨组织苏木精-伊红染色病理学及炎症因子检测。
1.6   统计学分析   采用SPSS 23.0统计软件及作图软件GraphPad Prism 8.0进行分析，术前术后对比采用单因素方差分析，以P < 0.05为差异有显著性意义。

骨髓炎是指以细菌为主的病原微生物感染骨组织引起的炎症反应，骨髓炎根据病程可以分为急性、亚急性和慢性，当急性骨髓炎未能治愈时，反复发作就会进展为慢性骨髓炎。急性、亚急性骨髓炎一般可以通过全身抗生素治疗使症状得到控制[13]，但是其复发率很高，骨髓炎常见于严重的开放性骨折，多为高能量损伤所致，其骨断端暴露，易被细菌侵袭，导致骨组织感染或局部细菌病灶残留[14]。此类高能量损伤对骨断端周围皮肤软组织、血管造成的创伤严重，血供破坏大，极易形成死骨，进而成为细菌生长、细菌生物膜黏附的“温床”[15]，最终形成慢性骨髓炎，在骨科内固定置入中也可常见置入支架生物膜的感染，骨髓炎病程长、治疗难度大，截肢率、致残率高。临床上针对骨髓炎的治疗为在充分清创与病灶引流的基础上给予局部及全身敏感抗生素治疗，但由于骨髓炎病灶局部血供差，且多伴有死骨形成，全身应用的敏感抗生素很难在病灶局部形成有效杀菌浓度，治疗效果差、不良反应大[16]，目前仍然是骨科医生的一大难题，没有较好的治疗方案[17]。而随着交通事故的增加、创伤骨折患者的增多，骨髓炎的发病率也随之逐年增加。流行病学调查显示，在发展中国家成人骨髓炎发病率达到24.4/10万，且作为主要劳动力的男性发病率高于女性[18]，年轻患者多见，治疗后反复发作，严重影响患者劳动力并增加了家庭的经济负担[19]，在这些骨髓炎患者中，金黄色葡萄球菌感染导致的骨髓炎占主要地位[20]。慢性骨髓炎反复发作的主要原因是细菌生物膜的形成，当骨感染细菌超过24 h时，细菌在局部就开始形成生物膜[21]，生物膜阻挡了药物和常规的手术清创治疗，在局部形成对细菌感染的保护灶，增加了感染治疗难度[15，22]。
骨髓炎模型在研究骨髓炎的治疗方法面提供了基础，在以往的动物模型中，通过将长骨骨折后加入细菌悬液制作   S. aureus感染骨髓炎模型，该方法成功感染率较高，但是常常在加入细菌悬液时有因为浓度过高增加动物死亡的风险，且骨折后的固定过程较为复杂，增加了模型制作难度[23]。在实验对象选择中，兔和猪的成本较高，在饲养方面的成本也相对提高，且大型动物的操作较为复杂，常需多人协同才能完成实验[24-25]。在大鼠实验模型中通过注射硬化剂硬化血管来减少局部血运，并植入内固定并滴加细菌悬液模拟临床骨髓炎[26]，但细菌浓度过高容易导致动物死亡，而且临床中直接接触大量细菌悬液导致骨感染的病例比较罕见，通常为外伤清创后残留的细菌形成细菌生物膜，或者手术内固定支架上残留的细菌生物膜导致骨的感染而形成骨髓炎[27]。因此，此次实验选择大鼠胫骨植入带S. aureus细菌生物膜的克氏针制作骨髓炎模型，与临床发病因素更为相近，模型制作操作更灵活，动物价格经济适中，管理方便，为骨髓炎模型贴近临床提供更佳的模型制作方案。
此次研究重点为模拟临床中细菌生物膜形成导致的骨髓炎，通过制作带生物膜的克氏针作为细菌载体，其对比直接将细菌悬液滴入动物骨髓腔安全性较高，不易因细菌过量导致动物死亡[28]。临床中患者常常不会直接接触到高浓度细菌，通常为创伤性骨折清创不彻底，导致细菌残留形成细菌生物膜，在内固定置入术中，置入的支架是生物膜形成的最佳场所，因其无血管供应因此对其免疫减弱[29]，在植入材料和坏死骨上形成的生物膜中S. aureus生物膜是最常见的一种。   S. aureus骨髓炎持续存在骨科感染中，生物膜被认为是导致不治之症和慢性感染的主要原因[10]。生物膜的形成始于浮游细菌细胞最初附着在底物上，其具有与多种细胞外基质蛋白结合的能力，浮游生物细胞的附着会引发胞外聚合物的合成，包括多糖、蛋白质和核酸。生物膜表型对抗生素的耐药性提高，部分原因是药物从生物膜外扩散到深埋在生物膜内的细菌；此外，由于生物膜中细菌代谢表型的改变，抗生素在生物膜中成功扩散的有效性降低，使它们对药物治疗更具有耐受性[30]。用带S. aureus生物膜的克氏针模拟临床发病因素，通过对以上实验结果的评估，证实成功制作骨髓炎大鼠模型。虽然目前对骨髓炎的治疗已经取得了很大的进步，但是骨髓炎仍然得不到根治，因此，制作稳定且接近临床的动物模型是非常必要的，可靠的骨髓炎动物模型为骨髓炎治疗方法研究提供了实验基础。
此次研究的局限性：以大鼠为骨髓炎模型对象，其植入物装置与人类仍有区别，通常人类克氏针是通过钻孔直接转入骨皮质及骨松质，但是带S. aureus生物膜的克氏针直接钻孔进入大鼠胫骨体内将会导致表层细菌生物膜的破坏，可能无法成功制作骨髓炎模型，且在大鼠胫骨无法使用与人类相当的骨固定装置，因此在研究骨髓炎病理性骨折受力情况时或者需要较大的与人类相仿的如钢板等装置时需要选择较大体型的动物作为研究对象，以便于手术操作，并达到与人类临床相仿的应用模型。
此次研究的不足：在大鼠影像学检测方面，利用MicroCT进行影像学分析对骨髓炎疾病的诊断更加精确，但是由于经费以及该实验平台无此设备，故利用X射线片作为影像学检查，X射线片相对MicroCT清晰度较低，MicroCT可以更清晰显示骨质受到骨髓炎模型的破坏情况。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：
骨髓炎：为一种骨的感染和破坏，可由需氧或厌氧菌、分枝杆菌及真菌引起，骨髓炎好发于长骨、糖尿病患者的足部或由于创伤或手术引起的穿透性骨损伤部位。
生物膜：也称为生物被膜，是指附着于有生命或无生命物体表面被细菌胞外大分子包裹的有组织的细菌群体，生物膜细菌对抗生素和宿主免疫防御机制的抗性很强。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文章亮点：

1建立新型更为接近临床实际发病因素的金黄色葡萄球菌生物膜克氏针置入大鼠胫骨骨髓炎模型，以往均为直接滴加细菌进入钻孔内制作骨髓炎模型，与临床发病因素有明显区别，且滴入细菌悬液量不易控制，易导致模型动物死亡。

2 本次实验采用大鼠作为实验模型对象，制作骨髓炎模型方便且经济易管理，对模型观察及标本提取方便易得。

3 采用Elisa检测大鼠血清TNF-a、PTC、IL-10炎症因子，对大鼠炎症反应检测更敏感准确。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程#br#

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