构建具核梭杆菌诱导的实验性根尖周炎小鼠模型

doi:10.12307/2022.030

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (2): 176-181.doi: 10.12307/2022.030

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构建具核梭杆菌诱导的实验性根尖周炎小鼠模型

王佳佳，刘杰，王敏

口腔疾病研究国家重点实验室，国家口腔疾病临床医学研究中心，四川大学华西口腔医院修复科，四川省成都市 610041

收稿日期:2020-11-11 修回日期:2020-11-14 接受日期:2020-12-31 出版日期:2022-01-18 发布日期:2021-10-27
通讯作者: 王敏，博士，教授，口腔疾病研究国家重点实验室，国家口腔疾病临床医学研究中心，四川大学华西口腔医院修复科，四川省成都市 610041
作者简介:王佳佳，女，1994年生，湖北省十堰市人，汉族，四川大学在读博士，主要从事牙周疾病研究。
基金资助:
四川省重点研发项目(2020YFS0174 )，项目参与人：王佳佳；四川省重点研发项目(2019YFS0359)，项目参与人：刘杰；四川省区域创新合作项目(2020YFQ0008)，项目参与人：王敏

Establishing a murine model of experimental apical periodontitis induced by Fusobacterium nucleatum

Wang Jiajia, Liu Jie, Wang Min

The State Key Laboratory of Oral Diseases, National Clinical Research Center for Oral Diseases, Department of Prosthodontics, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China

Received:2020-11-11 Revised:2020-11-14 Accepted:2020-12-31 Online:2022-01-18 Published:2021-10-27
Contact: Wang Min, MD, Professor, The State Key Laboratory of Oral Diseases, National Clinical Research Center for Oral Diseases, Department of Prosthodontics, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China
About author:Wang Jiajia, MD candidate, The State Key Laboratory of Oral Diseases, National Clinical Research Center for Oral Diseases, Department of Prosthodontics, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China
Supported by:
Key Research & Developmental Project of Sichuan Province, No. 2020YFS0174 (to WJJ [project participant]) and 2019YFS0359 (to LJ [project participant]); Regional Innovation Cooperation Project of Sichuan Province, No. 2020YFQ0008 (to WM [project participant])

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
根尖周炎：是一种常见的口腔炎症性疾病，主要由微生物感染引起。病原菌感染牙髓造成牙髓炎症甚至坏死后，细菌或其毒力因子循根管系统扩散到根尖区域，引起多种炎症细胞的浸润，炎症细胞释放的大量促炎因子进一步激活破骨细胞，最终造成包括牙槽骨吸收在内的局部组织破坏。
具核梭杆菌：是一种革兰阴性专性厌氧菌，主要定植于人类口腔，其被认为是一种机会致病菌，与口腔内外的多种感染性疾病相关。具核梭杆菌是口腔根尖周感染的优势菌之一，与结直肠癌、不良妊娠结局等全身疾病的发生发展也有着密切联系。
背景：根尖周炎是常见的口腔炎症性疾病，针对该疾病的动物模型研究已经广泛开展，但模型建立方法尚不统一。
目的：建立具核梭杆菌诱导的小鼠实验性根尖周炎模型。
方法：25只BALB/c小鼠分为对照组和1，3，5，7 d实验组，每组5只，对照组小鼠不进行处理，实验组小鼠双侧下颌第一磨牙开髓后在根管内导入具核梭杆菌菌液，暂封膏封闭牙冠部，分别在术后1，3，5，7 d时收取下颌骨样本，对照组在0 d时收集下颌骨样本。Micro-CT检测根尖牙槽骨吸收情况，苏木精-伊红染色观察根尖区组织变化，抗酒石酸酸性磷酸酶染色观察根尖区破骨细胞的表达。
结果与结论：①Micro-CT扫描结果显示，术后3 d小鼠下颌第一磨牙根尖牙周膜间隙开始增宽，7 d时出现明显的牙槽骨吸收；根尖区三维重建结果显示，与对照组比较，术后7 d根尖区骨体积分数降低，骨小梁分离度增加(P < 0.05)；②苏木精-伊红染色结果显示，术后3 d根尖区观察到明显的炎细胞浸润，之后浸润范围逐渐扩大；③抗酒石酸酸性磷酸酶染色结果显示，术后3，5，7 d根尖区破骨细胞数量持续增加；④结果表明，在根管内导入具核梭杆菌的方法成功建立了小鼠实验性根尖周炎模型，可用于进一步探究根尖周炎的病因病理及治疗手段。
https://orcid.org/0000-0002-4878-3513 (王佳佳)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 根尖周炎, 具核梭杆菌, Micro-CT, 苏木精-伊红染色, 破骨细胞, 动物模型, 小鼠

Abstract: BACKGROUND: Apical periodontitis is a common oral inflammatory disease. Research on animal models for this disease has been extensively carried out, but there is yet no unified method for establishing such models.
OBJECTIVE: To establish a murine model of experimental apical periodontitis model induced by Fusobacterium nucleatum.
METHODS: Twenty-five BALB/c mice were divided into normal control group (n=5) and experimental group (n=20). Mice in the normal control group were sacrificed at 0 day to collect the lower jaws. In the experimental group, the root canal of the lower first molar was exposed followed by injection of Fusobacterium nucleatum suspension, and then the tooth crown was sealed with temporary restorative material. In the experimental group, five mice were selected at each observational time points (1, 3, 5, 7 days postoperatively), and samples of the mandible were collected accordingly. Micro-CT was performed to analyze alveolar bone resorption. The periapical tissue changes were observed by hematoxylin-eosin staining. Tartrate resistant acid phosphatase staining was applied to detect the expression of osteoclasts.
RESULTS AND CONCLUSION: Micro-CT scan showed that the apical periodontal space of the lower first molars began to widen at 3 days postoperatively and significant alveolar bone resorption was developed at 7 days. Three-dimensional reconstruction of the apical region showed decreased bone volume fraction and increased trabecular separation in the apical region at 7 days postoperatively (P < 0.05). Hematoxylin-eosin staining showed that inflammatory cell infiltration was obviously visible in the apical region at 3 days postoperatively, and then the infiltration gradually expanded. Tartrate resistant acid phosphatase staining showed a sustained increase in the number of osteoclasts in the apical region at 3, 5, and 7 days postoperatively. To conclude, the murine model of experimental apical periodontitis can be successfully established by inoculating Fusobacterium nucleatum into the root canals, based on which, we can further explore the etiology, pathology and treatment of apical periodontitis.

Key words: apical periodontitis, Fusobacterium nucleatum, Micro-CT, hematoxylin-eosin staining, osteoclast, animal model, mouse

中图分类号:

王佳佳, 刘杰, 王敏. 构建具核梭杆菌诱导的实验性根尖周炎小鼠模型[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(2): 176-181.

Wang Jiajia, Liu Jie, Wang Min. Establishing a murine model of experimental apical periodontitis induced by Fusobacterium nucleatum[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(2): 176-181.

图/表（结果） 5

2.1 实验动物数量分析实验选用BALB/c小鼠25只，随机分为对照组(不作处理)以及1，3，5，7 d实验组，每组5只，实验过程中无脱失，全部进入结果分析。
2.2 Micro-CT扫描重建结果 Micro-CT扫描结果显示对照组下颌第一磨牙根尖区牙槽骨结构完整，骨质连续，未见明显低密度区；实验组1 d时根尖区和对照组没有明显差异，第3天和第5天可见根尖区牙周膜间隙增宽，到第7天时根尖区出现明显的牙槽骨吸收，见图1。

为了定量分析各组小鼠根尖区域骨量和骨质情况，选择小鼠下颌第一磨牙根尖周围的牙槽骨作为兴趣区域，通过三维重建计算该区域内的骨体积分数，统计分析结果显示，实验组1，3，5 d时小鼠根尖区骨体积分数与对照组相比没有明显差异，7 d时骨体积分数较对照组显著降低，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图2，表1。进一步对根尖区牙槽骨空间微结构分析也得到了相似的结果，实验组1，3，5 d时根尖区牙槽骨骨小梁分离度与对照组相比没有明显差异，7 d时骨小梁分离度较对照组显著增加，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图2，表1。

2.3 苏木精-伊红染色结果对照组小鼠根尖区牙槽骨完好，牙周膜间隙均匀未见增宽，没有明显的炎细胞浸润。实验组1 d时根尖组织没有明显变化，3 d时可见根尖区血管增多，出现炎细胞浸润，主要以中性粒细胞为主，5 d时根尖区炎性浸润范围扩大，牙周膜间隙显著增宽，7 d时炎症进一步加重，可见牙槽骨破坏，见图3。

2.4 抗酒石酸酸性磷酸酶染色结果对照组和实验组1 d时小鼠根尖区几乎不可见破骨细胞，实验组3 d时根尖区牙槽骨表面可见少量破骨细胞，之后破骨细胞数目逐渐增加，至7 d时根尖区牙槽骨吸收区域出现大量的多核破骨细胞，可见圆形或椭圆形的骨吸收陷窝，见图4。

参考文献

[1] NAIR PN. Apical periodontitis: a dynamic encounter between root canal infection and host response. Periodontol 2000. 1997;13:121-148.
[2] COLIĆ M, GAZIVODA D, VUCEVIĆ D, et al. Proinflammatory and immunoregulatory mechanisms in periapical lesions. Mol Immunol. 2009;47(1):101-113.
[3] MÁRTON IJ, KISS C. Overlapping protective and destructive regulatory pathways in apical periodontitis. J Endod. 2014;40(2):155-163.
[4] SHAH A, LEE D, SONG M, et al. Clastic cells are absent around the root surface in pulp-exposed periapical periodontitis lesions in mice. Oral Dis. 2018;24(1-2):57-62.
[5] 梅陵宣,刘正,张濒.实验性鼠根尖周炎组织学动态观察[J].实用口腔医学杂志,2002,18(6):500-503.
[6] DE ROSSI A, ROCHA LB, ROSSI MA. Interferon-gamma, interleukin-10, Intercellular adhesion molecule-1, and chemokine receptor 5, but not interleukin-4, attenuate the development of periapical lesions. J Endod. 2008;34(1):31-38.
[7] 陈兴兴,谷苗,吕海鹏,等.不同方法建立实验性狗根尖周炎模型的比较[J].口腔医学研究,2009,25(4):416-419.
[8] SILVA L, NELSON-FILHO P, LEONARDO MR, et al. Effect of calcium hydroxide on bacterial endotoxin in vivo. J Endod. 2002;28(2):94-98.
[9] 王青山,高艳,荣丽,等.内毒素诱导大鼠根尖周炎的X线片及组织病理学改变[J].上海口腔医学,2008,17(4):416-419.
[10] BRENNAN CA, GARRETT WS. Fusobacterium nucleatum - symbiont, opportunist and oncobacterium. Nat Rev Microbiol. 2019;17(3):156-166.
[11] 谢晓婷,王以玲,肖水清.具核梭杆菌的致病性与其可引起的口腔疾病[J].中国医学创新,2017,14(10):145-148.
[12] BOUILLAGUET S, MANOIL D, GIRARD M, et al. Root Microbiota in Primary and Secondary Apical Periodontitis. Front Microbiol. 2018;9: 2374.
[13] ZANDI H, KRISTOFFERSEN AK, ØRSTAVIK D, et al. Microbial Analysis of Endodontic Infections in Root-filled Teeth with Apical Periodontitis before and after Irrigation Using Pyrosequencing. J Endod. 2018;44(3): 372-378.
[14] 郭惠杰,王嘉德.慢性根尖周炎患牙根尖外表面的细菌生物膜[J].北京大学学报(医学版),2009,41(5):571-574.
[15] BULLMAN S, PEDAMALLU CS, SICINSKA E, et al. Analysis of Fusobacterium persistence and antibiotic response in colorectal cancer. Science. 2017;358(6369):1443-1448.
[16] 罗玉龙,葛全兴,聂玉强,等.具核梭杆菌感染与结直肠癌的关系[J].广东医学,2015,36(14):2161-2164.
[17] HAN YW, REDLINE RW, LI M, et al. Fusobacterium nucleatum induces premature and term stillbirths in pregnant mice: implication of oral bacteria in preterm birth. Infect Immun. 2004;72(4):2272-2279.
[18] SWIDSINSKI A, DÖRFFEL Y, LOENING-BAUCKE V, et al. Acute appendicitis is characterised by local invasion with Fusobacterium nucleatum/necrophorum. Gut. 2011;60(1):34-40.
[19] PETERSEN J, GLAßL EM, NASSERI P, et al. The association of chronic apical periodontitis and endodontic therapy with atherosclerosis. Clin Oral Investig. 2014;18(7):1813-1823.
[20] PAULA-SILVA FWG, RIBEIRO-SANTOS FR, PETEAN IBF, et al. Root canal contamination or exposure to lipopolysaccharide differentially modulate prostaglandin E 2 and leukotriene B 4 signaling in apical periodontitis. J Appl Oral Sci. 2020;28:e20190699.
[21] 凌均棨,韦曦,刘红艳.难治性根尖周炎的病因及防治策略[J].中华口腔医学杂志,2010,45(1):52-57.
[22] SIQUEIRA JF JR, RÔÇAS IN. Exploiting molecular methods to explore endodontic infections: Part 1--current molecular technologies for microbiological diagnosis. J Endod. 2005;31(6):411-423.
[23] XIONG H, WEI L, PENG B. The Presence and involvement of interleukin-17 in apical periodontitis. Int Endod J. 2019;52(8): 1128-1137.
[24] NAIR PN. On the causes of persistent apical periodontitis: a review. Int Endod J. 2006;39(4):249-281.
[25] SEGATA N, HAAKE SK, MANNON P, et al. Composition of the adult digestive tract bacterial microbiome based on seven mouth surfaces, tonsils, throat and stool samples. Genome Biol. 2012;13(6):R42.
[26] RICKARD AH, GILBERT P, HIGH NJ, et al. Bacterial coaggregation: an integral process in the development of multi-species biofilms. Trends Microbiol. 2003;11(2):94-100.
[27] BRADSHAW DJ, MARSH PD, WATSON GK, et al. Role of Fusobacterium nucleatum and coaggregation in anaerobe survival in planktonic and biofilm oral microbial communities during aeration. Infect Immun. 1998;66(10):4729-4732.
[28] 郭杨,张玉杰,肖水清.具核梭杆菌生物学特性及检测手段的研究进展[J].国际口腔医学杂志,2012,39(6):770-774.
[29] BACHRACH G, IANCULOVICI C, NAOR R, et al. Fluorescence based measurements of Fusobacterium nucleatum coaggregation and of fusobacterial attachment to mammalian cells. FEMS Microbiol Lett. 2005;248(2):235-240.
[30] 张竹砚.慢性根尖周炎动物模型的研究进展[J].口腔材料器械杂志, 2020,29(2):47-51.
[31] LUNGOVÁ V, RADLANSKI RJ, TUCKER AS, et al. Tooth-bone morphogenesis during postnatal stages of mouse first molar development. J Anat. 2011;218(6):699-716.
[32] KAKEHASHI S, STANLEY HR, FITZGERALD RJ. The effects of surgical exposures of dental pulps in germ-free and conventional laboratory rats. Oral Surg Oral Med Oral Pathol. 1965;20:340-349.
[33] 周维君,车英林,杨瑞琨,等.根尖周炎模型小鼠DKK1,SFRP1及骨形成相关分子Runx2,Osteocalcin的表达变化[J].临床口腔医学杂志, 2017,33(12):715-719.
[34] ANDRADA AC, AZUMA MM, FURUSHO H, et al. Immunomodulation Mediated by Azithromycin in Experimental Periapical Inflammation. J Endod. 2020 Aug 5:S0099-2399(20)30574-4. doi: 10.1016/j.joen.2020.07.028.
[35] 王艳青.Cyclophilin A在根尖周炎中的表达及作用研究[D].武汉:武汉大学,2019.
[36] 张琛,侯本祥.根尖周炎动物模型中CD14、TLR4的表达[J].中华口腔医学杂志,2007,42(3):148-149.
[37] PAULA-SILVA FWG, ARNEZ MFM, PETEAN IBF, et al. Effects of 5-lipoxygenase gene disruption on inflammation, osteoclastogenesis and bone resorption in polymicrobial apical periodontitis. Arch Oral Biol. 2020;112:104670.
[38] WANG L, ZHANG H, DONG M, et al. Role of the Btk-PLCγ2 Signaling Pathway in the Bone Destruction of Apical Periodontitis. Mediators Inflamm. 2019;2019:8767529.
[39] TAMMA R, ZALLONE A. Osteoblast and osteoclast crosstalks: from OAF to Ephrin. Inflamm Allergy Drug Targets. 2012;11(3):196-200.
[40] 李福军,彭彬.大鼠实验性根尖周病的酶组织化学研究[J].口腔医学研究,2003,19(2):109-111.
[41] ZUBERY Y, DUNSTAN CR, STORY BM, et al. Bone resorption caused by three periodontal pathogens in vivo in mice is mediated in part by prostaglandin. Infect Immun. 1998;66(9):4158-4162.
[42] JOHNSON L, ALMEIDA-DA-SILVA CLC, TAKIYA CM, et al. Oral infection of mice with Fusobacterium nucleatum results in macrophage recruitment to the dental pulp and bone resorption. Biomed J. 2018;41(3):184-193.

引言

根尖周炎是常见的口腔炎症性疾病，其典型病理特征包括根尖周软组织的破坏和牙槽骨的吸收。临床上，根尖周炎的急性发作可能引起剧烈疼痛，若处理不及时，炎症可能迁延不愈，严重影响患者的生活质量。口腔微生物致牙髓组织感染是根尖周炎的主要病因，病原微生物从根管侵入到根尖周区域，引发宿主的免疫反应，造成根尖周软硬组织的破坏[1-3]。由于口腔局部环境和根尖周病原微生物的复杂性，根尖周炎的病理机制目前仍在探索之中。
构建动物模型是研究根尖周炎不可或缺的实验手段，目前根尖周炎动物造模没有统一的标准，研究者们采用的方法有髓腔暴露法[4-5]、混合菌导入法[6-7]、脂多糖导入法等[8-9]，这些方法各有优劣。髓腔暴露法操作简便，目前应用最多，但无法研究特定致病因素的作用。将混合菌或脂多糖导入根管内可以用于建立特殊类型的根尖周炎模型或研究特异因素在根尖周病中的作用，但难以模拟口腔内自然感染的过程，理想的动物模型仍在探索之中。
具核梭杆菌是近年来广受关注的细菌，主要定植于人类口腔，研究表明其与口腔内外多种疾病的发生发展有着密切关系[10]。在口腔疾病中，具核梭杆菌是根尖周感染的优势菌[11]，在各种根尖周病变中均具有较高的检出率[12-14]。在全身疾病中，已有明确证据证明具核梭杆菌可以促进大肠癌以及不良妊娠结局的发生[15-17]。此外，研究还发现具核梭杆菌与阑尾炎[18]、动脉粥样硬化的发生也有关联[19]。
该研究选择小鼠作为实验对象，通过在下颌第一磨牙根管内导入具核梭杆菌的方法建立实验性根尖周炎模型，采用影像学、组织学和酶组织化学方法评价造模效果，为进一步探究根尖周炎的病因和治疗方法、根尖周炎与全身疾病的关系以及牙软硬组织再生的研究提供实验依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。
1.2 时间及地点 2019年1至10月在口腔疾病研究国家重点实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 25只六七周龄BALB/c小鼠，体质量18-22 g，由四川大学江安校区实验动物中心提供，许可证号：SCXY(川)2018-185，由口腔疾病研究国家重点实验室饲养。
1.3.2 实验主要试剂具核梭杆菌菌株(ATCC 25586)由口腔疾病研究国家重点实验室菌种库提供；CAVITON暂封材料(GC，日本)；苏木精、伊红染液(Servicebio，武汉)；抗酒石酸酸性磷酸酶染色试剂盒(Wako，日本)。
1.3.3 实验主要仪器电动牙钻机(SAESHIN，韩国)；体视显微镜(KOPPACE，深圳)；恒温厌氧培养箱(Gene Science，美国)；低温高速离心机(Thermo，美国)；Micro-CT扫描仪(Scanco Medical，瑞士)；样品脱水处理机、石蜡包埋机、石蜡切片机、恒温烤片机(Leica，德国)；光学显微镜(Olympus，日本)。
1.4 实验方法
1.4.1 细菌培养从-80 ℃冰箱中取出具核梭杆菌菌株，在羊血平板上使用一次性接种环按多级接种法进行接种，将接种的平板置于37 ℃恒温厌氧培养箱中孵育三四天，挑取单克隆菌落转入脱氧的BHI液体培养基中进行扩增培养，先在5 mL培养基中培养三四天，然后转移至50 mL培养基中继续培养三四天，低温高速离心(4 ℃ 7 000 r/min离心30 min)，1×PBS重悬，制成含2%羟甲基纤维素钠的具核梭杆菌悬液，调整细菌浓度为1012 L-1-1013 L-1。

1.4.2 动物分组及造模待小鼠适应环境1周后，随机分为5组：对照组(不作处理)以及1，3，5，7 d实验组，每组5只。在口内植菌前，实验组小鼠用卡那霉素(0.5 g/L)处理 3 d，然后再进行3 d的洗脱期，第7天时给予4%水合氯醛麻醉实验组小鼠，然后将小鼠仰卧位固定以便能够直视下颌第一磨牙，对术野消毒后在体视显微镜下用1/4不锈钢球钻从牙冠部打开双侧下颌第一磨牙髓腔，用#6K挫探查并疏通根管，暴露根管口后使用微量注射器导入10 μL具核梭杆菌菌液，CAVITON暂封膏严密封闭开髓口，术中注意及时吸去小鼠唾液及多余菌液，全程保持无菌操作，术后禁食禁水2 h。

1.4.3 样本收集分别在正常对照组(0 d)，实验组造模后1，3，5，7 d进行样本收集。麻醉后处死小鼠，分离并收集双侧下颌骨，40 g/L多聚甲醛固定过夜后流水连续冲洗8 h，随后将样本转移至体积分数为70%乙醇中4 ℃保存。
1.4.4 Micro-CT扫描分析使用vivaCT80进行样本扫描，扫描分辨率为12 μm，完成扫描后应用Scanco Evaluation和Mimics Research 20.0进行三维重建，分析下颌第一磨牙根尖区域骨体积分数和骨小梁分离度。
1.4.5 苏木精-伊红染色和抗酒石酸酸性磷酸酶染色将完成Micro-CT扫描的样本置于10%EDTA脱钙液中，室温摇床上脱钙三四周，脱钙完成后梯度脱水，石蜡包埋，制成厚度为5 μm的切片，以备后续染色。
苏木精-伊红染色：石蜡切片脱蜡至水，入苏木精染色3-5 min，自来水洗，盐酸乙醇分化约3 s，自来水洗，氨水返蓝约3 s，自来水洗；入伊红染液30 s，无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，干燥后于光学显微镜下观察、采图。
抗酒石酸酸性磷酸酶染色：按照Wako试剂盒的标准步骤配置染色液，石蜡切片脱蜡至水，滴加抗酒石酸酸性磷酸酶染液于37 ℃恒温箱内孵育30 min，蒸馏水终止反应 3 min，核染色液染核四五秒，蒸馏水终止反应，切片脱水、透明，中性树胶封固，干燥后于光学显微镜下观察、采图。
1.5 主要观察指标 ①Micro-CT扫描重建分析小鼠下颌第一磨牙根尖区域骨体积分数、骨小梁分离度和根尖牙槽骨吸收面积；②苏木精-伊红染色观察小鼠下颌第一磨牙根尖区域炎症浸润情况；③抗酒石酸酸性磷酸酶染色观察小鼠下颌第一磨牙根尖区域牙槽骨中破骨细胞数量。
1.6 统计学分析采用SPSS 20.0软件行单因素方差分析进行各时间点间比较，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

治疗根尖周炎的关键是根管内感染的控制，在临床上通常采用根管治疗来清除感染，促进组织愈合，但仍存在部分患牙经过完善的根管治疗后根尖周病变依旧迁延不愈，甚至出现牙槽骨的继续破坏，最终不得不通过外科手术或者拔除患牙的方式控制炎症[21]。为了改善根尖周炎的治疗预后，需要探明根尖周炎的病因和发病机制。尽管根尖周炎的病理机制目前仍未明确，但是微生物感染在该疾病发生发展中的关键作用得到了广泛认同[22]。龋坏、创伤、机械因素等造成的牙釉质和牙本质丧失使得牙髓暴露，病原微生物可由这些途径感染牙髓，造成牙髓炎症甚至坏死，随着疾病发展，病原微生物可以循根管系统扩散到根尖区域，引起中性粒细胞、巨噬细胞等炎症细胞的浸润，这些细胞在清除病原微生物的同时释放大量的细胞因子，促炎因子进一步激活破骨细胞，最终引起慢性的根尖周病损，造成包括牙槽骨吸收在内的局部组织破坏[23-24]。
根尖周炎病变区域的微生物学研究显示具核梭杆菌是根尖周感染中最常见的细菌之一[12-14]，表明该菌可能在根尖周炎发生发展过程中起到重要的作用。具核梭杆菌是一种革兰阴性专性厌氧菌，主要定植于口腔，作为一种黏附性细菌，其可以和口腔中多种微生物共聚，在牙菌斑生物膜的形成中发挥关键作用[25-26]。具核梭杆菌是菌斑生物膜中的桥梁微生物，其可以将早期定植菌和晚期定植菌衔接起来，从而促使以革兰阳性菌群为优势菌的生物膜转变为革兰阴性菌群主导[27]。除了和其他细菌共聚，具核梭杆菌还可以黏附于多种细胞，包括上皮细胞、内皮细胞、单核细胞、红细胞以及成纤维细胞等，这些特性使得具核梭杆菌具有较强的致病性[28-29]。探究具核梭杆菌在根尖周炎发病过程中的作用有助于完善根尖周炎的病因病理机制，从而为临床上根尖周病的治疗提供新的策略。
根尖周炎的发生发展是病原微生物和免疫系统相互作用的病理过程，因而体外研究不足以阐释其复杂的机制，另一方面，由于人的个体差异以及伦理的限制，获取临床样本用于根尖周炎的研究也相对困难，因此动物模型是研究根尖周炎病理机制和治疗方法的主要途径。啮齿类或者其他常见类型的实验动物均可用于根尖周炎造模，其中小鼠是使用最广泛的动物模型。实验小鼠成本低廉，饲养条件简单，口腔菌群与人类口腔菌群相似，并且基因敲除等技术路线已经成熟[30]。对于小鼠第一磨牙牙-骨发育过程的研究表明其牙根在6-8周时已经发育完成[31]，因而实验选择七八周龄小鼠作为造模对象，为后续更深入的研究奠定基础。
自从1965年KAKEHASHI等[32]发现外科手段暴露髓腔会引起大鼠牙髓坏死和根尖区域的炎症表现开始，髓腔暴露法成为了诱导动物实验性根尖周炎的主要方法。以往研究表明，采用髓腔暴露法制备小鼠根尖周炎模型，造模后7-10 d即出现根尖牙槽骨缺损[33-35]。此方法虽然应用广泛，表型稳定，但是由于口腔内微生物种类众多，将髓腔直接暴露于口腔无法排除各种混杂因素的干扰，并且个体差异较大，因而不能用于研究某些特定因素在疾病发展中的作用。在根管内导入混合菌液也是建立根尖周炎模型的常用方法，可以采用多种根管优势厌氧菌或者厌氧菌和需氧菌混合菌液进行造模诱导，但不同研究中出现根尖周病损的时间长短不一[6-7]。也有研究者将脂多糖导入根管内制备根尖周炎模型，王青山等[9]在大鼠磨牙内置入细菌内毒素，发现在术后7 d时根尖周即出现明显阴影。在根管内导入脂多糖可以探究其在根尖周炎中的作用及信号转导途径[36]，但难以模拟口腔自然感染的发病过程。
该实验采用在小鼠下颌第一磨牙根管内导入具核梭杆菌的方法诱导实验性根尖周炎，对于研究具核梭杆菌在根尖周炎发生发展中的作用具有特殊意义，也可以用于探究根尖周病与具核梭杆菌相关全身疾病的联系。实验结果表明，小鼠下颌第一磨牙根管内导入具核梭杆菌3 d后根尖区牙周膜间隙开始增宽，至7 d时根尖区出现明显的牙槽骨破坏和吸收。定量分析结果显示，实验组7 d后小鼠根尖区骨体积分数显著降低，骨小梁分离度增加，说明具核梭杆菌感染可以造成小鼠根尖周牙槽骨病损的形成。
根尖区牙周膜由成束的胶原纤维和其间的疏松结缔组织构成，生理状态下牙周膜纤维排列有序，无炎细胞浸润，牙槽骨完整连续。该研究中实验组小鼠3 d后开始出现根尖区炎细胞浸润，3-7 d炎症浸润不断进展，说明具核梭杆菌激活了小鼠局部组织的免疫应答，这与之前的研究者在小鼠第一磨牙髓腔开放后观察到的结果近似[37-38]。
破骨细胞和成骨细胞的动态平衡是维持正常骨代谢和功能的基础，在炎症状态下这个平衡被打破，破骨细胞被激活、分化，导致骨吸收大于骨形成，从而造成病灶区骨质的破坏[39-40]。有研究发现在小鼠颅顶区皮下组织注射具核梭杆菌可以激活破骨细胞，造成颅顶骨的吸收[41]。JOHNSON等[42]用具核梭杆菌感染小鼠口腔后，发现牙周组织中促炎细胞因子肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β的表达上调，巨噬细胞浸润增加。该实验结果显示，实验组3 d后小鼠下颌第一磨牙根尖区破骨细胞数量开始增加，至7 d时出现明显的骨质破坏，结合前述结果，说明具核梭杆菌可能通过引发根尖区炎症反应进而激活破骨细胞，造成牙槽骨的破坏。
该实验证明感染具核梭杆菌能够诱发小鼠根尖免疫反应，激活破骨细胞，造成根尖牙槽骨的破坏，但是根尖周炎的长期进展和变化情况有待进一步实验观察，具核梭杆菌在根尖周炎病程中的具体作用机制也有待更深入研究。
综上所述，采用下颌第一磨牙根管内导入具核梭杆菌的方法可以成功建立小鼠实验性根尖周炎模型，为进一步探究根尖周炎的病因病理和临床治疗策略提供了实验依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

构建具核梭杆菌诱导的实验性根尖周炎小鼠模型

Establishing a murine model of experimental apical periodontitis induced by Fusobacterium nucleatum

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[1]	谭新访, 郭艳幸, 秦晓飞, 张斌清, 赵东亮, 潘琨琨, 李瑜卓, 陈皓宇. 顺轴疲劳运动对兔髌股关节软骨损伤的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(在线): 1-6.
[2]	王宝娟, 郑曙光, 张琪, 李田洋. 苗药熏蒸治疗膝骨关节炎模型兔可延缓细胞外基质的破坏[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1180-1186.
[3]	吕依妍, 李寒冰, 马晓庆, 张晗, 张宇航, 李根林. 采用复合因素建立内热消渴小鼠模型的特点分析[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1187-1193.
[4]	王景, 熊山, 曹金, 冯林伟, 王信. 白细胞介素3在骨代谢中的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1260-1265.
[5]	肖豪, 刘静, 周君. 脉冲电磁场治疗绝经后骨质疏松症的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1266-1271.
[6]	朱婵, 韩栩珂, 姚承佼, 张强, 刘静, 邵明. 针刺治疗帕金森病：动物实验显示的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1272-1277.
[7]	王新民, 刘飞, 许杰, 白玉玺, 吕剑. 髓芯减压联合牙髓干细胞治疗兔早期激素性股骨头坏死[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1074-1079.
[8]	胡维帆, 郑力, 李大地, 孙阳, 赵凤朝. 过表达miR-25通过 NFATc1信号通路调控钛颗粒诱导的破骨细胞分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 682-687.
[9]	林旭晨, 祝海年, 王增顺, 祁腾民, 刘立民, 索南昂秀. 黄腐酚对骨关节炎模型小鼠炎性因子及关节软骨的作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 676-681.
[10]	冯建波, 李陈诚, 刘金月, 王小敏, 彭笳宸. 金黄色葡萄球菌生物膜克氏针置入建立创伤性大鼠骨髓炎模型[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 700-705.
[11]	王世辉, 程杨, 朱赟洁, 程少丹, 毛剑莹. 弧刃针刀治疗冻结肩模型兔炎症因子及组织形态的反应[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 706-711.
[12]	何云影, 李玲婕, 张舒淇, 李雨舟, 杨生, 季平. 聚丙烯酸/琼脂糖三维培养构建细胞球的方法[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 553-559.
[13]	吴赛璇, 张咪, 董明, 陆颖, 牛卫东. 骨稳态过程中Keap1/Nrf2/ARE信号通路的调控作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(2): 271-275.
[14]	孙友强, 马超, 梁萌梦, 辛鹏飞, 张华, 向孝兵. 自噬在骨细胞中重要作用的最新研究进展：骨相关细胞活性和骨代谢[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(2): 276-282.
[15]	范丹阳, 付润泽, 米佳静, 刘春艳. 骨改建过程中大麻素受体的表达及作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(2): 283-288.