2.1   Keap1/Nrf2/ARE信号通路的组成及活化
2.1.1   Keap1   是Nrf2的特异性受体，主要存在于细胞质中。由5个结构域组成，分别为NTR、BTB、IVR、DGR和CTR区域，其中NTR、CTR为2个氨基酸末端，BTB、IVR、DGR是主要的功能区域[4]，见图2。BTB区域是一个蛋白质与蛋白质相互作用的结构域，通常和其他Keap1的BTB区形成二聚体，与Nrf2以1∶1比例相结合，参与Nrf2的泛素化降解；IVR区域是氧化应激敏感区，与Nrf2的稳定性相关，在非氧化应激状态下参与Nrf2的泛素化降解；DGR区域有6个Kelch重复序列，可以识别Nrf2的ETGE和DLG两个基因序列，对Nrf2的活性具有负调控作用[5-6]。




2.1.2   Nrf2   属于碱性亮氨酸拉链转录因子的Cap’n’Collar (CNC)亚家族，由核红系2组成，包括3个核红系2相关因子(NRF1、NRF2和NRF3)以及2个BTB和CNC同源蛋白(BACH1和BACH2)[5，7-8]，分子质量为95-110 kDa[9]。Nrf2包含605个氨基酸和7个结构域，称为Nrf2-ECH homology(Neh)域1-7。Neh1域包含CNC/碱性亮氨酸拉链域，该域介导Nrf2与小分子肌腱纤维瘤蛋白二聚化，促进Nrf2与ARE结合[10]。Neh2域位于基因序列的最N端，促进Nrf2与Keap1结合。Neh3域位于Nrf2的最C端，通过与CHD6相互作用来辅助Nrf2反式激活，与转录活性密切相关[11]。Neh4和Neh5域通过共激活因子和共抑制因子介导转录活化或转录抑制[12-13]。Neh6域包含DSGIS和DSAPGS基因序列，提供与β-TrCP的结合位点，介导不依赖于Keap1的Nrf2降解途径[14-15]。Neh7结构域充当视黄醇受体α的结合位点，抑制依赖Nrf2/ARE的基因表达[7，16]，见图3。　
2.1.3   ARE   也称亲电反应元件，是一种能编码启动子区许多解毒酶和细胞保护蛋白基因的顺式反应元件。不同ARE的碱基序列是不一样的，但多项研究表明，其中都含有一个16核苷酸序列5’-TA/CAnnA/GTGAC/GnnnGCA/G-3’(n代表任一核苷酸)，具有典型的功能活性。在氧化应激状态下，解离的Nrf2进入胞核内，与小分子肌腱纤维瘤蛋白形成异二聚体，进而与ARE进行特异性结合，启动下游的靶基因。Bach1是ARE的转录抑制因子，在正常的生理条件下，Bach1与肌腱纤维瘤蛋白结合形成异二聚体，从而防止Nrf2与之结合[17]。
2.1.4   Keap1/Nrf2/ARE信号通路的激活及调控机制   正常生理状态下，Keap1的DGR区域与Nrf2的Neh2域相结合，以Keap1-Nrf2复合体的形式被锚定在胞浆内肌动蛋白细胞骨架上，使Nrf2稳定在细胞质内，无法进入细胞核，从而抑制其转录。Keap1-Nrf2复合体作为Cul3/Rbx1 E3泛素连接酶的适配底物，介导Nrf2的泛素化降解，从而维持Nrf2在细胞内低表达、非活化的状态[18-19]。但在压力、氧化应激等状态下，氧化剂或亲电子化合物与Keap1的半胱氨酸残基相互作用，使其结构发生变化，从而使之与Nrf2分离[20]。Nrf2被激活后，转位进入细胞核内，通过其高度保守的碱性亮氨酸拉链结构与小分子肌腱纤维瘤蛋白形成异二聚体并且识别ARE[21]，启动下游一系列保护性基因的表达，如多种抗氧化酶、Ⅱ相解毒酶，增强细胞的解毒及抗氧化能力，进而发挥保护作用[22]。
其他信号传导通路也可以影响Nrf2的转录，通过激活或抑制Cul3/Rbx1-Keap1复合物、SCF/β-TrCP复合物或HRD1来调节Nrf2蛋白水平。半胱氨酸的氧化修饰、含ETGE蛋白的竞争性结结合、蛋白质-蛋白质相互作用的抑制物、p62/SQSTM1、mTOR抑制剂和Cul3/Rbx1 E3连接酶抑制剂(MLN4924)水平的增加均可破坏Keap1与Nrf2间相互作   用[23-25]。另外，Keap1启动子的过甲基化可增加Nrf2的表达，胰岛素/生长因子或GSK3-β、CRL、PI3K-AKT-PKC、mTOR、ERK/p38-MAPK和WNT抑制剂等均能够调节SCF/β-TrCP-Nrf2间的相互作用[26-27]，HRD1抑制剂(LS-102)也可用于预防内质网应激相关的Nrf2降解[28]。 
2.2   Keap1/Nrf2/ARE信号通路在破骨细胞中的作用
2.2.1   破骨细胞   破骨细胞是源自造血干细胞的高度分化的多核巨噬细胞，主要功能是参与骨组织的吸收。在破骨细胞分化成熟的过程中，RANKL/RANK是调控破骨细胞分化成熟的关键信号通路[29]。RANK是RANKL的受体，是一种表达在破骨细胞前体或者成熟破骨细胞膜上的Ⅰ型跨膜糖蛋白，RANK和RANKL结合可以使破骨细胞前体分化为成熟的破骨细胞，激活核因子κB、抗酒石酸酸性磷酸酶、组织蛋白酶K和活化T细胞核因子蛋白1等与破骨细胞有关标志基因的表达[30-32]。
2.2.2   破骨细胞与Keap1/Nrf2/ARE信号通路   Keap1/Nrf2/ARE信号通路参与破骨细胞形成和活性的调节。Nrf2可以通过启动抗氧化酶的表达降低细胞内部的活性氧自由基水平[33]，进而抑制MAPK通路和PI3K/Akt通路，抑制破骨细胞的分化和吸收[34]，也可通过抑制核因子κB、c-Fos和NFATc1抑制破骨细胞的分化[35-36]。
在RANKL诱导的破骨细胞分化过程中，RANKL通过上调Keap1降低Nrf2/Keap1的比率，降低细胞内保护酶的表达水平，提高细胞内活性氧自由基水平，从而促进破骨细胞的分化和功能。在体外和体内模型中，Nrf2的过表达通过上调细胞保护酶血红素加氧酶1、醌氧化还原酶1和谷氨酰半胱氨酸合成酶的表达，降低细胞内的活性氧自由基水平[37]，减少抗酒石酸酸性磷酸酶阳性多核细胞的数量，减少破骨细胞分化标记基因(ATP6v0d2、组织蛋白酶K、树突状细胞-特异性跨膜蛋白、基质金属蛋白酶9、破骨细胞相关受体和抗酒石酸酸性磷酸酶)的表达，并减弱骨破坏。此外，体内局部Nrf2过表达减弱了体内脂多糖介导的RANKL依赖性颅骨破坏[38]。应用Nrf2激活剂萝卜硫素和姜黄素抑制了野生型小鼠细胞中的破骨细胞分化并增加了Nrf2靶基因的表达，抑制了Nrf2缺陷型小鼠骨髓单核巨噬细胞中破骨细胞的形成[39]。说明Keap1/Nrf2信号通路通过细胞保护酶调节细胞内的活性氧自由基水平从而在破骨细胞形成中起作用。
在Nrf2缺陷型小鼠细胞中，包含3个以上核的抗酒石酸酸性磷酸酶阳性多核细胞的形成显著增强，肌动蛋白环形成能力增强，表明Nrf2可能负调控RANKL诱导的破骨细胞分化并且抑制肌动蛋白环的形成和骨吸收。敲除RAW264.7细胞中的Nrf2发现，抑制Nrf2可以增强RAW264.7细胞中的破骨细胞分化[40]。当有辐射或砷等外界刺激时，破骨细胞分化增多，功能增强。Nrf2的缺失会导致氧化应激增加，并增加对辐射或砷引起的骨丢失的敏感性[41]。
然而Nrf2在骨吸收中的作用一直集中在受活性氧自由基和RANKL影响的破骨细胞分化上，破骨细胞祖细胞和破骨细胞中Nrf2活性尚未得到很好的研究。
2.3   Keap1/Nrf2/ARE信号通路在成骨细胞中的作用
2.3.1   成骨细胞   成骨细胞起源于间充质干细胞，主要功能是参与骨组织的形成，维持骨稳态，在骨骼的生长发育以及保持骨量方面发挥关键作用，由具有多向分化潜能的间充质干细胞分化而来。骨形态发生蛋白-Smads、Wnt/β-catenin、Notch、Hedgehog、成纤维细胞生长因子等信号在调控成骨细胞分化及骨生成方面有重要作用[42]。Ⅰ型胶原蛋白、Runx2、骨钙蛋白、骨粘连蛋白、骨桥蛋白、骨唾液蛋白和碱性磷酸酶是成骨细胞的标志物[43]。
2.3.2   成骨细胞与Keap1/Nrf2/ARE信号通路   Nrf2在成骨细胞分化和活动中的作用仍然存在争议，可能与年龄、性别、遗传背景以及生理与病理状况等因素相关。
一些研究发现Nrf2对骨形成具有负面影响，KOOK       等[44]研究发现，辐射以剂量依赖性方式减少矿化作用，同时降低MC3T3-E1细胞中骨特异性基因骨粘连蛋白、骨桥蛋白、骨唾液蛋白和骨钙蛋白的表达。而siRNA介导的Nrf2沉默能够明显逆转辐射对细胞成骨细胞分化的负面影响，导致血红素加氧酶1减少和Runx2水平增加。类似地，PARK等[35]培养了敲除Nrf2的MC3T3-E1细胞以及颅骨来源的成骨细胞。这些体外研究发现，成骨细胞分化和钙化增强，在敲除Nrf2的成骨细胞中，碱性磷酸酶、Runx2，骨钙素的mRNA表达显著升高，Runx2蛋白的表达增加。HINOI等[45]通过在MC3T3-E1成骨细胞中过表达Nrf2，发现其会抑制成骨细胞分化的关键转录因子Runx2的表达，从而阻止成骨细胞分化。这些结果表明Nrf2负调控成骨细胞的分化和矿化。
PARK等[35]的动物实验研究表明，9周龄的野生型小鼠和敲除Nrf2的小鼠相比，Nrf2 敲除小鼠的股骨骨小梁量显著增加，结果表明Nrf2对骨量具有负面影响。为了进一步探讨Nrf2 敲除小鼠的骨量增加是由于骨形成增加还是骨吸收减少，对股骨的组织切片进行了组织形态计量学分析，结果显示，与野生型小鼠相比，Nrf2 敲除小鼠的骨形成增加，单位骨周成骨细胞数和单位骨表面成骨细胞数显著增加，而单位骨周的破骨细胞数量没有差异，单位骨表面的腐蚀表面、骨吸收活性标志物也没有差异，Nrf2 敲除小鼠的血清骨形成标记(破骨细胞)水平显著升高。这些结果表明，Nrf2 敲除小鼠的骨量增加可能是由于成骨细胞生成和骨形成增加引起的，而不是骨吸收减少所致，表明Nrf2作为骨吸收的调节剂，起到抗成骨的作用。然而PARK等[35]的研究中并未说明实验小鼠的性别，仅对9周龄的野生型小鼠和Nrf2 敲除小鼠进行对比研究，需要进一步研究来确定年龄和性别对骨骼中Nrf2调节作用的影响。
Keap1作为Nrf2的负调节剂，Keap1基因敲除小鼠可以作为Nrf2过表达的动物模型，然而Keap1-/-小鼠由于食管和前胃畸形严重过度角化而在出生后3周内死亡。为了解决这一问题，YOSHIDA等[46]通过在系统性Keap1缺乏的情况下，构建鳞状上皮特异性Nrf2缺乏(NEKO)小鼠，来纠正食管的过度角化和随后的致死性，从而建立Nrf2过表达的动物模型，发现除食管和皮肤外，在大多数组织中可观察到Nrf2的过度活化。YOSHIDA等[46]发现NEKO小鼠股骨长度、骨量和对照组小鼠相比显著减少，这些结果表明，Nrf2的过度活化导致小鼠严重骨发育不良。为了进一步分析骨发育不良的原因，将小鼠的新生颅骨进行了体外成骨细胞分化实验，观察到NEKO小鼠成骨细胞分化严重受损。因此表明Nrf2过度活化抑制了成骨细胞的分化，NEKO小鼠的骨量减少是由于成骨细胞分化减少导致的骨稳态受损。
相反，SUN等[47]研究发现，与野生型对照组小鼠相比，Nrf2-/-小鼠的骨量降低，骨骼强度降低，负载诱导的骨形成减弱。KIM等[48]发现Nrf2对于正常小鼠出生后的骨骼发育至关重要，缺乏Nrf2的小鼠表现出明显的骨骼发育受损和骨量减少。通过观察3，6，8，12和24周龄Nrf2+/+和Nrf2-/-小鼠的长骨μCT发现，对照组Nrf2+/+小鼠在8周龄时达到了峰值骨量，相比之下，Nrf2-/-小鼠在3周龄时表现出严重的骨量减少，并持续到12周龄。3，6和8周龄的Nrf2-/-小鼠和对照组相比，骨体积分数、骨小梁数量和厚度减少，而骨小梁分离增加，但是到12周龄时，Nrf2+/+和Nrf2-/-小鼠之间的所有参数都相似，结果表明Nrf2的损失会损害出生后早期的骨骼形成。进一步进行体外研究发现，早期的骨量低并不是由于成骨细胞本身存在任何缺陷。与对照组成骨细胞相比，来自Nrf2缺乏小鼠的原发颅骨成骨细胞可以正常增殖和分化。这些结果表明Nrf2-/-小鼠出生后骨骼发育受损可能是由于骨祖细胞群的增殖或存活能力衰竭所致，这导致在Nrf2-/-小鼠早期观察到的成骨细胞数量较低。KIM等[48]认为可能有其他机制可以激活独立于Nrf2信号传导的抗氧化途径，例如FoxO，从而弥补Nrf2的损失，并保证青春期生长过程中观察到的成骨细胞数量的恢复。IBANEZ等[49]有相同的观点，通过将6-9月龄的雌性Nrf2-/-小鼠和野生型小鼠随机分为卵巢切除术组和假手术组，发现Nrf2缺乏显著降低了骨小梁的体积、骨矿物质密度、骨体积分数和骨表面密度；椎骨组织形态计量学分析显示，皮质面积/总面积之比显著降低，骨小梁面积/总面积之比趋于降低。这些结果表明Nrf2是维持骨骼质量所必需的。
这与PARK等[35]的结论截然相反，KIM等[48]所用的实验动物为雌性小鼠，而PARK等[35]未说明其研究中所用动物的性别;此外，PARK等[35]仅检查了9周龄这一时间点，骨表型表现出性二态性，年龄和遗传背景等可能是造成实验结果差异的原因。
YIN等[50]通过适度激活Nrf2来研究不同性别小鼠中Nrf2对小鼠骨量的影响，将Keap1+/-小鼠即Keap1杂合小鼠(Keap1 Ht)作为Nrf2适度激活小鼠模型，Keap1-/-(KO)作为Nrf2过度激活小鼠模型，Keap1野生型(WT)作为对照组。结果表明，成年雄性Keap1 Ht小鼠的骨量更高，破骨细胞的细胞数减少，血清骨吸收标志物降低，说明Nrf2适度激活负调控破骨细胞生成和骨吸收，骨的形成率更高；使用颅骨骨细胞进行的细胞培养研究进一步表明，Keap1 Ht成骨细胞中的碱性磷酸酶和Wnt5a mRNA高于野生型成骨细胞，提示Nrf2适度激活会刺激成骨细胞分化；通过破坏Keap1激活Nrf2还在Keap1 Ht小鼠的骨表型中表现出性二态性，在雄性Keap1 Ht小鼠中骨质更高，但在雌性Keap1 Ht小鼠中却没有。这些数据表明Keap1/Nrf2信号通路在成骨细胞的分化和活性中起着重要作用，适度激活Nrf2可以增加骨量，降低骨吸收，但是Nrf2激活和性类固醇受体下游信号之间的串扰需要进一步研究。

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[10]	郭 嘉, 丁琼桦, 刘 泽, 吕思懿, 周泉程, 高玉花, 白春雨. 间充质干细胞来源外泌体的生物学特性及免疫调控作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1093-1101.
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[12]	周洪琴, 吴丹丹, 杨 琨, 刘 琪. 传递特定miRNA的外泌体可调控成骨并促进成血管[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1107-1112.
[13]	张璟琳, 冷 敏, 朱博恒, 汪 虹. 干细胞源外泌体促进糖尿病创面愈合的机制及应用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1113-1118.
[14]	黄晨玮, 费彦亢, 朱梦梅, 李鹏昊, 于 兵. 谷胱甘肽在干细胞“干性”及调控中的重要作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1119-1124.
[15]	胡维帆, 郑 力, 李大地, 孙 阳, 赵凤朝. 过表达miR-25通过 NFATc1信号通路调控钛颗粒诱导的破骨细胞分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 682-687.

骨骼是人体中主要的结缔组织，并不断的进行更新和重塑。骨骼正常代谢对维持矿物质的稳态和骨骼结构的完整性有重要作用，其中由破骨细胞介导的骨吸收和成骨细胞介导的骨形成是维持骨稳态的两个核心过程。在衰老和某些疾病(如骨质疏松、牙周炎、根尖周炎)中，骨代谢的平衡状态被破坏，骨吸收量大于骨形成量，从而导致骨破坏[1]。越来越多的研究发现氧化应激与骨破坏密切相关，氧化应激是由过高的活性氧自由基产生的，可以通过相关分子和信号通路调节骨代谢。活性氧自由基可以诱导破骨细胞生成和分化，并且抑制成骨细胞生成和矿化，从而参与骨破坏相关疾病的发生发展。
Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein1，Keap1)/核因子E2相关因子2(Nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)/抗氧化反应元件(Antioxidant response element，ARE)信号通路是细胞内重要的内源性抗氧化防御机制之一，与氧化应激密切相关，被激活后可诱导血红素加氧酶1、谷胱甘肽S-转移酶、醌氧化还原酶1等保护性基因的转录[2]，进而维持细胞内氧化还原平衡，保护细胞和组织免受氧化应激带来的损伤。先前的研究集中在肝脏、肾脏等代谢和排毒器官以及在肺、消化道等中的作用[3]，近年的研究表明，Keap1/Nrf2/ARE信号通路与骨相关疾病的发生发展密切相关。Keap1/Nrf2/ARE信号通路通过启动抗氧化酶的表达，降低细胞内活性氧的自由基水平，从而抑制破骨细胞的分化和吸收，但其在成骨细胞中的作用仍存在争议。因此，文章就Keap1/Nrf2/ARE信号通路在骨稳态中的研究做一综述。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1   资料来源  
检索人及检索时间：第一作者在2020年10月进行检索。
检索文献时限：1999年1月至2020年10月。
检索数据库：PubMed数据库及万方医学数据库。
检索途径：主题词检索。
检索词：英文检索式为：(Nrf2) and (bone or Osteoclasts or Osteoblasts)，中文检索式为：主题：(Nrf2)*主题：(破骨+成骨+骨)。
检索文献类型：研究原著，综述。
1.2   入选标准   ①Keap1/Nrf2/ARE信号通路组成及活化的相关研究；②Keap1/Nrf2/ARE信号通路对破骨细胞影响的相关研究；③Keap1/Nrf2/ARE信号通路对成骨细胞影响的相关研究。

1.3   质量评估及数据的提取   初检得到645篇文献，经资料收集者互相评估纳入文献的有效性和适用性，通过阅读文题和摘要进行初步筛选，排除中英文文献重复性研究，以及内容关系不密切的文献，对最终符合标准的50篇文献进行综述。文献筛选流程图见图1。

骨质疏松、骨关节炎、牙周炎、根尖周炎等疾病与骨破坏的发生发展密切相关，Keap1/Nrf2/ARE信号通路参与调节抗氧化信号因子在骨破坏中有重要作用。Nrf2的功能丧失减少了骨量和负荷驱动的合成代谢反应，敲除Nrf2可以降低细胞内保护酶的表达水平，提高细胞内的活性氧自由基水平，进而促进破骨细胞的分化和功能；过表达Nrf2可以抑制破骨细胞分化，降低骨吸收。Nrf2在成骨细胞分化和活动中的作用仍然存在争议，过度激活Nrf2的小鼠模型表现出低骨量表型，由于Keap1-/-小鼠出生后3周内死亡，因此YOSHIDA等[46]建立了转基因鼠来纠正由食管过度角化而导致的死亡，但这种复杂的小鼠模型表现出肾性尿崩症，无法排除其他内分泌腺体可能对骨代谢的间接影响。适度激活Nrf2的小鼠则表现出与对照组相比更高的骨量，但同样，由于小鼠模型采用的是Keap1+/-小鼠，难以排除其他组织和细胞以及Keap1调节的内分泌系统性因子对骨组织和细胞的影响。此外，性别差异导致的骨表型不同也提示性类固醇受体下游信号与Keap1/Nrf2/ARE信号通路存在相关性。为了研究Keap1/Nrf2/ARE信号通路与骨相关细胞中的特定作用，研究特异性Nrf2缺陷和过表达小鼠模型与破骨细胞、成骨细胞的关系，可以发现更多关于Keap1/Nrf2/ARE信号通路在骨稳态中的关键作用，进而为临床上骨破坏相关疾病的药物治疗提供新思路。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：#br# Keap1/Nrf2/ARE信号通路：Keap1/Nrf2/ARE信号通路是参与细胞防御和抵抗内源性和外源性应激的主要信号级联之一。在受到压力和氧化应激等条件下，该信号通路被激活并且启动下游相关细胞保护性基因的表达。而且在自噬、细胞凋亡、细胞周期进程和干细胞分化中有重要作用，与肿瘤、神经退行性疾病、炎症相关疾病的发生发展密切相关。近年的研究表明，Keap1/Nrf2/ARE信号通路参与骨质疏松、骨关节炎、牙周炎等病理性骨病，参与调节骨量与骨密度，与破骨细胞和成骨细胞的增殖、分化密切相关。#br# 骨稳态：破骨细胞去除涉及骨骼吸收的旧骨，成骨细胞形成新骨，二者协调是维持骨稳态的必要条件。当平衡被打破时，破骨细胞介导的骨吸收大于成骨细胞介导的骨形成，导致骨质被破坏。#br# 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

骨骼是人体中主要的结缔组织，并不断的进行更新和重塑。骨骼正常代谢对维持矿物质的稳态和骨骼结构的完整性有重要作用，其中由破骨细胞介导的骨吸收和成骨细胞介导的骨形成是维持骨稳态的两个核心过程。在衰老和某些疾病（如骨质疏松、牙周炎、根尖周炎）中，骨代谢的平衡状态被破坏，骨吸收量大于骨形成量，从而导致骨破坏。越来越多的研究发现氧化应激与骨破坏密切相关，氧化应激是由过高的活性氧自由基产生的，可以通过相关分子和信号通路调节骨代谢。活性氧自由基可以诱导破骨细胞生成和分化，并且抑制成骨细胞生成和矿化，从而参与骨破坏相关疾病的发生发展。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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