髓芯减压联合牙髓干细胞治疗兔早期激素性股骨头坏死

doi:10.12307/2022.147

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (7): 1074-1079.doi: 10.12307/2022.147

• 牙髓及牙周膜干细胞 Dental pulp and periodontal ligament stem cells • 上一篇下一篇

髓芯减压联合牙髓干细胞治疗兔早期激素性股骨头坏死

王新民，刘飞，许杰，白玉玺，吕剑

秦皇岛市第一医院骨科二病区，河北省秦皇岛市 066000

收稿日期:2021-03-16 修回日期:2021-03-17 接受日期:2021-06-01 出版日期:2022-03-08 发布日期:2021-10-29
通讯作者: 刘飞，教授，硕士生导师，秦皇岛市第一医院骨科二病区，河北省秦皇岛市 066000
作者简介:王新民，男，1981年生，汉族，2018年河北医科大学毕业，博士，副主任医师，主要从事关节外科研究。
基金资助:
2019年度中央引导地方科技发展专项资金项目(20190214175848679)，项目负责人：刘飞

Core decompression combined with dental pulp stem cells in the treatment of steroid-associated femoral head necrosis in rabbits

Wang Xinmin, Liu Fei, Xu Jie, Bai Yuxi, Lü Jian

Ward Two, Department of Orthopedics, First Hospital of Qinhuangdao, Qinhuangdao 066000, Hebei Province, China

Received:2021-03-16 Revised:2021-03-17 Accepted:2021-06-01 Online:2022-03-08 Published:2021-10-29
Contact: Liu Fei, Professor, Master’s supervisor, Ward Two, Department of Orthopedics, First Hospital of Qinhuangdao, Qinhuangdao 066000, Hebei Province, China
About author:Wang Xinmin, MD, Associate chief physician, Ward Two, Department of Orthopedics, First Hospital of Qinhuangdao, Qinhuangdao 066000, Hebei Province, China
Supported by:
Special Fund Project of Central Government Guiding Local Science and Technology Development in 2019, No. 20190214175848679 (to LF)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
牙髓干细胞：起源于神经峭来源的间充质细胞，是成体干细胞家族的重要成员之一。牙髓干细胞高表达间充质干细胞表面标志，低表达造血干细胞表面标志，具有与骨髓间充质干细胞相似的免疫学特性：低免疫原性、负性免疫调节功能，同时具有较骨髓间充质干细胞更高的分化程度，以及取材简单、创伤小、来源广泛、较强的分化潜能和自我更新能力，被认为是组织工程缺损修复的理想种子细胞来源。
股骨头坏死：是一种多数累及双侧髋关节的进行性难治性疾病。该病主要发病年龄在30-40岁，其中男性患者发病率为女性的3倍，是由多种病因造成股骨头内骨质疏松及骨细胞血液供应缺乏而坏死，进而导致股骨头关节软骨下骨变性、坏死、塌陷，最终造成骨关节炎。
背景：牙髓干细胞具有强大的增殖能力和多向分化潜能，在骨和软骨组织工程中的应用取得了明显进展，因此研究牙髓干细胞对股骨头坏死的治疗作用，将为股骨头坏死患者带来新的治疗策略和希望。
目的：观察髓芯减压联合牙髓干细胞对兔早期激素型股骨头坏死的治疗作用。
方法：成年健康新西兰大白兔52只，随机分为正常对照组、模型组、溶媒组、牙髓干细胞组，除正常对照组外，其余3组采用激素型股骨头坏死造模方法。造模成功后(第4周)，溶媒组和牙髓干细胞组右侧行髓芯减压术，牙髓干细胞组于股骨头减压孔注射牙髓干细胞，溶媒组同时注射同体积生理盐水，第4，5，6周共注射3次。第12周检测骨密度、骨形态学参数、空骨陷窝率、骨小梁面积比等指标。
结果与结论：①影像学检查提示溶媒组和牙髓干细胞组治疗效果均较模型组有显著改善；与溶媒组比较，牙髓干细胞组骨体积分数、骨小梁数量、骨密度改善更明显，差异有显著性意义(P < 0.05)；②牙髓干细胞组空骨陷窝率和骨小梁面积比与正常对照组更为接近，溶媒组空骨陷窝率高于正常对照组(P < 0.05)，骨小梁面积比低于正常对照组(P < 0.05)；溶媒组和牙髓干细胞组空骨陷窝率明显低于模型组(P < 0.05)，骨小梁面积比明显高于模型组(P < 0.05)；③结果表明，牙髓干细胞联合髓芯减压治疗早期股骨头坏死优于单纯髓芯减压。

https://orcid.org/0000-0002-7867-2224(王新民)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 牙髓干细胞, 髓芯减压, 激素型股骨头坏死, 兔, 病理, 动物模型

Abstract: BACKGROUND: The dental pulp stem cells have strong proliferation ability and multi differentiation potential ability, which plays an important role in bone and cartilage tissue engineering. Therefore, to study the therapeutic effect of dental pulp stem cells on femoral head necrosis will bring new treatment strategies and hope for patients with femoral head necrosis.
OBJECTIVE: To observe the therapeutic effect of core decompression combined with dental pulp stem cells on early steroid-associated femoral head necrosis in rabbits.
METHODS: Fifty-two adult healthy New Zealand white rabbits were randomly divided into four groups: normal control group, model group, solvent group, and dental pulp stem cell group. Except the normal control group, the model of steroid induced osteonecrosis of femoral head was established in the other three groups. After successful modeling (the 4th week), core decompression was performed on the right side in the solvent group and dental pulp stem cell group. The dental pulp stem cell group was injected with dental pulp stem cells in the decompression hole of the femoral head, and the solvent group was injected with the same volume of sodium chloride injection at the same time. There were three injections in the 4th, 5th and 6th weeks. At the 12th week, indicators such as bone density, bone morphology parameters, empty bone lacuna rate, and bone trabecular area ratio were measured.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Imaging examination showed that the treatment effects of solvent group and dental pulp stem cell group were significantly improved compared with the model group. Bone volume fraction, trabecular number, and bone mineral density of femoral head in the dental pulp stem cell group were better than those in the solvent group, and the difference was statistically significant (P < 0.05). (2) Compared with the normal control group, the empty bone lacuna rate and trabecular area ratio of the dental pulp stem cell group were closer; the empty bone lacuna rate of the solvent group was higher than that of the normal control group (P < 0.05); and the trabecular area ratio was lower than that of the normal control group (P < 0.05). The empty bone lacuna rate of the solvent group and dental pulp stem cell group was significantly lower than that of the model group (P < 0.05), and the bone trabecular area ratio was significantly higher than that of the model group (P < 0.05). (3) The results indicate that the treatment of early femoral head necrosis by using core decompression combined with dental pulp mesenchymal stem cells is better than that of simple core decompression.

Key words: stem cells, dental pulp stem cells, core decompression, steroid-associated femoral head necrosis, rabbit, pathology, animal model

中图分类号:

王新民, 刘飞, 许杰, 白玉玺, 吕剑. 髓芯减压联合牙髓干细胞治疗兔早期激素性股骨头坏死[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1074-1079.

Wang Xinmin, Liu Fei, Xu Jie, Bai Yuxi, Lü Jian. Core decompression combined with dental pulp stem cells in the treatment of steroid-associated femoral head necrosis in rabbits[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(7): 1074-1079.

图/表（结果） 9

2.1 一般情况模型组注射醋酸泼尼松龙三四周时能明显观察到右侧股骨变细，摄食量减小，反应迟钝，体态偏瘦；髓芯减压术后1周内，溶媒组和干细胞组实验动物活动及摄食量减少，动物精神萎靡，术后2周活动量及摄食量增加，3周时活动增多，摄食量及活动逐渐恢复正常。所有52只实验动物生存状态良好，无死亡，模型组有5只、溶媒组有3只、干细胞组有1只实验动物轻度跛行。
2.2 X射线片观察结果各组标本在钻孔缺损区以外变化大致相似，其中正常对照组股骨头外形正常，椭圆形，密度无明显变化，骨小梁结构正常，见图1；模型组股骨头骨小梁走形及结构出现不规则紊乱，密度较正常对照组明显增高，软骨塌陷明显，出现软骨下囊性病变；模型组、溶媒组股骨头软骨比牙髓干细胞组塌陷更明显，溶媒组、牙髓干细胞组钻孔缺损内有着不同的变化，牙髓干细胞组钻孔缺损区可见类似骨小梁结构，钻孔缺损区中心密度低于溶媒组，两组钻孔区外边缘密度有所增高，未见明显差别，见图1。

2.3 大体观察股骨头形态正常对照组股骨整体结实粗壮，软骨面光滑无明显缺损，自然光线下表面呈粉白色；模型组所有标本大转子根部有磨损痕迹，除2个股骨头标本负重区轻度塌陷外，其余8个标本外形轮廓大致正常，软骨面部分剥落，自然光线下表面呈暗红色，负重区关节软骨出现1 cm2左右轻度剥脱，软骨下骨暴露；溶媒组、牙髓干细胞组所有标本股骨头外形大致正常，关节软骨自然光下呈苍白色，溶媒组有5个标本出现软骨下骨外露，牙髓干细胞组有2个标本出现软骨轻度剥脱，软骨面光滑程度明显优于模型组、溶媒组，见图2。

2.4 Micro-CT检测结果牙髓干细胞组隧道内及出口处出现均匀的高密度信号，骨隧道周围出现不规则的骨小梁，尤其在骨隧道远端，软骨下骨区域；溶媒组、牙髓干细胞组隧道内均可见新生骨质长入，隧道与周围界限不清，呈逐渐融合状态，其中牙髓干细胞组更明显；模型组股骨头内骨小梁稀松排列，明显不规则，骨小梁轻度不均并斑点状稀疏区，4组股骨头外形大致正常，均未见到明显塌陷，见图3。采用Micro-CT对兔股骨头进行扫描并三维重建，使用CT-AN软件进行三维分析，并进行感兴趣区域骨密度测定，结果显示：溶媒组和牙髓干细胞组均较模型组有显著改善，差异有显著性意义(P < 0.05)；与溶媒组比较，牙髓干细胞组股骨头骨体积分数、骨小梁数量、骨密度改善更明显，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表1。

2.5 病理学检测结果
2.5.1 苏木精-伊红染色结果正常对照组股骨头内骨小梁形态完整，成骨细胞丰富，空骨陷窝少见，脂肪细胞较少；模型组成骨细胞数较正常对照组明显减少，脂肪细胞、纤维组织及空骨陷窝明显增加，骨小梁不规则且明显稀疏，间距比较大，骨小梁内成骨明显破坏；溶媒组骨小梁较模型组丰富，隧道内有新生骨组织长入，可见部分新生毛细血管，骨小梁连续性优于模型组，未见骨小梁中断现象；牙髓干细胞组可见较多新生成骨细胞，新生骨小梁形态规则，隧道内可见少量新生骨痂，成骨明显，空骨陷窝明显减少，提示牙髓干细胞能够促进股骨头坏死区新生骨形成，见图4和图5。

2.5.2 Masson染色结果模型组可见大多数骨组织呈绿色，骨小梁混乱且不规则，骨小梁中骨细胞空骨陷窝明显多于溶媒组和牙髓干细胞组；溶媒组骨组织中呈现红绿相间分布，红染区域较模型组明显增多，隧道内出现片状或条状被红染的成熟骨组织；牙髓干细胞组红色成熟骨组织多于模型组和溶媒组，其中红染区域比例高于模型组和溶媒组，骨髓内脂肪细胞较模型组和溶媒组减少，但绿染区域较正常对照组明显增多。
2.6 空骨陷窝率及骨小梁面积比牙髓干细胞组空骨陷窝率和骨小梁面积比与正常对照组更为接近，两组间比较差异无显著性意义，溶媒组空骨陷窝率高于正常对照组，骨小梁面积比低于正常对照组，两组间比较差异有显著性意义，见图6和图7；溶媒组、牙髓干细胞组空骨陷窝率明显低于模型组，骨小梁面积比明显高于模型组；与溶媒组相比，牙髓干细胞组空骨陷窝率及骨小梁面积比更接近于正常对照组，差异有显著性意义，见表2。

2.7 生物相容性治疗12周后溶媒组、牙髓干细胞组髓芯减压隧道内组织相容性好，并未发现明显的细胞排斥反应及炎性细胞浸润。

参考文献

[1] LI B, YANG M, YU L. Vascular bundle transplantation combined with porous bone substituted scaffold for the treatment of early-stage avascular necrosis of femoral head. Med Hypotheses. 2019;132:109374.
[2] FU Q, TANG NN, ZHANG Q, et al. Preclinical Study of Cell Therapy for Osteonecrosis of the Femoral Head with Allogenic Peripheral Blood-Derived Mesenchymal Stem Cells. Yonsei Med J. 2016;57(4):1006-1015.
[3] YUAN HF, ZHANG J, GUO CA, et al. Clinical outcomes of osteonecrosis of the femoral head after autologous bone marrow stem cell implantation: a meta-analysis of seven case-control studies. Clinics (Sao Paulo). 2016;71(2):110-113.
[4] FANG SH, LI YF, JIANG JR, et al. Relationship of α2-Macroglobulin with Steroid-Induced Femoral Head Necrosis: A Chinese Population-Based Association Study in Southeast China. Orthop Surg. 2019;11(3):481-486.
[5] GÓMEZ-MONT LANDERRECHE JG, GIL-ORBEZO F, MORALES-DOMINGUEZ H, et al. Nontraumatic causes of bilateral avascular necrosis of the femoral head: link between hepatitis C and pegylated interferon. Acta Ortop Mex. 2015;29(3): 172-175.
[6] CHAO PC, CUI MY, LI XA, et al. Correlation between miR-1207-5p expression with steroid-induced necrosis of femoral head and VEGF expression. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2019;23(7):2710-2718.
[7] WANG Z, SUN QM, ZHANG FQ, et al. Core decompression combined with autologous bone marrow stem cells versus core decompression alone for patients with osteonecrosis of the femoral head: A meta-analysis. Int J Surg. 2019;69:23-31.
[8] ANDRONIC O, SHOMAN H, WEISS O, et al. What are the outcomes of core decompression in patients with avascular necrosis? Protocol for a systematic review. F1000Res. 2020;9:71.
[9] WANG SL, HU YB, CHEN H, et al. Efficacy of bone marrow stem cells combined with core decompression in the treatment of osteonecrosis of the femoral head: A PRISMA-compliant meta-analysis. Medicine (Baltimore). 2020;99(25):e20509.
[10] HERNIGOU P, DUBORY A, HOMMA Y, et al. Cell therapy versus simultaneous contralateral decompression in symptomatic corticosteroid osteonecrosis: a thirty year follow-up prospective randomized study of one hundred and twenty five adult patients. Int Orthop. 2018;42(7):1639-1649.
[11] ZHANG XL, SHI KQ, JIA PT, et al. Effects of platelet-rich plasma on angiogenesis and osteogenesis-associated factors in rabbits with avascular necrosis of the femoral head. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2018;22(7):2143-2152.
[12] 骆瑜,李若涵,彭友俭.牙髓干细胞来源外泌体修复兔颞下颌关节软骨损伤后软骨组织修复的实验研究[J]. 临床口腔医学杂志,2020,36(4):202-205.
[13] ARAÚJO AB, FURLAN JM, SALTON GD, et al. Isolation of human mesenchymal stem cells from amnion, chorion, placental decidua and umbilical cord: comparison of four enzymatic protocols. Biotechnol Lett. 2018;40(6):989-998.
[14] PHAM H, TONAI R, WU M, et al. CD73, CD90, CD105 and Cadherin-11 RT-PCR Screening for Mesenchymal Stem Cells from Cryopreserved Human Cord Tissue. Int J Stem Cells. 2018;11(1):26-38.
[15] KOBOLAK J, DINNYES A, MEMIC A, et al. Mesenchymal stem cells: Identification, phenotypic characterization, biological properties and potential for regenerative medicine through biomaterial micro-engineering of their niche. Methods. 2016; 99:62-68.
[16] XIAO D, YE M, LI X, et al. Biomechanics analysis for the treatment of ischemic necrosis of the femoral head by using an interior supporting system. Int J Clin Exp Med. 2015;8(3):4551-4556.
[17] HUA KC, YANG XG, FENG JT, et al. The efficacy and safety of core decompression for the treatment of femoral head necrosis: a systematic review and meta-analysis. J Orthop Surg Res. 2019;14(1):306.
[18] THEOPOLD J, ARMONIES S, PIEROH P, et al. Nontraumatic avascular necrosis of the femoral head : Arthroscopic and navigation-supported core decompression. Oper Orthop Traumatol. 2020;32(2):107-115.
[19] XU S, ZHANG L, JIN H, et al. Autologous Stem Cells Combined Core Decompression for Treatment of Avascular Necrosis of the Femoral Head: A Systematic Meta-Analysis. Biomed Res Int. 2017;2017:6136205.
[20] PENG K, WANG Y, ZHU J, et al. Repair of non-traumatic femoral head necrosis by marrow core decompression with bone grafting and porous tantalum rod implantation. Pak J Med Sci. 2020;36(6):1392-1396.
[21] KOSUKEGAWA I, OKAZAKI S, Yamamoto M, et al. The proton pump inhibitor, lansoprazole, prevents the development of non-traumatic osteonecrosis of the femoral head: an experimental and prospective clinical trial. Eur J Orthop Surg Traumatol. 2020;30(4):713-721.
[22] FAN L, ZHANG C, YU Z, et al. Transplantation of hypoxia preconditioned bone marrow mesenchymal stem cells enhances angiogenesis and osteogenesis in rabbit femoral head osteonecrosis. Bone. 2015;81:544-553.
[23] HERNIGOU P, FLOUZAT-LACHANIETTE CH, DELAMBRE J, et al. Osteonecrosis repair with bone marrow cell therapies: state of the clinical art. Bone. 2015;70:102-109.
[24] JUNIOR AL, PINHEIRO CCG, TANIKAWA DYS, et al. Mesenchymal Stem Cells from Human Exfoliated Deciduous Teeth and the Orbicularis Oris Muscle: How Do They Behave When Exposed to a Proinflammatory Stimulus? Stem Cells Int. 2020; 2020:3670412.
[25] AYOUB S, BERBÉRI A, FAYYAD-KAZAN M. An update on human periapical cyst-mesenchymal stem cells and their potential applications in regenerative medicine. Mol Biol Rep. 2020;47(3):2381-2389.
[26] HENG BC, ZHU S, XU J, et al. Effects of decellularized matrices derived from periodontal ligament stem cells and SHED on the adhesion, proliferation and osteogenic differentiation of human dental pulp stem cells in vitro. Tissue Cell. 2016;48(2):133-143.
[27] CHEN Y, ZHANG F, FU Q, et al. In vitro proliferation and osteogenic differentiation of human dental pulp stem cells in injectable thermo-sensitive chitosan/β-glycerophosphate/hydroxyapatite hydrogel. J Biomater Appl. 2016;31(3):317-327.
[28] PINHEIRO CCG, LEYENDECKER JUNIOR A, TANIKAWA DYS, et al. Is There a Noninvasive Source of MSCs Isolated with GMP Methods with Better Osteogenic Potential? Stem Cells Int. 2019;2019:7951696.
[29] CHAMIEH F, COLLIGNON AM, COYAC BR, et al. Accelerated craniofacial bone regeneration through dense collagen gel scaffolds seeded with dental pulp stem cells. Sci Rep. 2016;6:38814.
[30] KERMANI S, MEGAT ABDUL WAHAB R, ZARINA ZAINOL ABIDIN I, et al. Differentiation capacity of mouse dental pulp stem cells into osteoblasts and osteoclasts. Cell J. 2014;16(1):31-42.
[31] WOLOSZYK A, HOLSTEN DIRCKSEN S, BOSTANCI N, et al. Influence of the mechanical environment on the engineering of mineralised tissues using human dental pulp stem cells and silk fibroin scaffolds. PLoS One. 2014;9(10):e111010.
[32] 毛丽霞,刘加强,赵晶蕾,等.人牙髓干细胞体外成骨向分化的实验研究[J].口腔颌面修复学杂志,2014,15(4):193-198.
[33] WANG C, WANG Y, MENG HY, et al. Application of bone marrow mesenchymal stem cells to the treatment of osteonecrosis of the femoral head. Int J Clin Exp Med. 2015;8(3):3127-3135.
[34] HERNIGOU P, BEAUJEAN F. Abnormalities in the bone marrow of the iliac crest in patients who have osteonecrosis secondary to corticosteroid therapy or alcohol abuse. J Bone Joint Surg Am. 1997;79(7):1047-1053.

引言

对于激素型股骨头坏死，其发病机制一直是学术界讨论的焦点，主要有脂肪代谢紊乱、血管闭塞或缺血、骨内压升高、血管生成受阻、骨髓内出血等[1-4]，当激素作为诱发因素时，如果合并免疫系统或血管炎类等疾病，长期应用激素发生骨坏死的概率明显增高[5-6]。对于早、中期股骨头坏死患者，髓芯减压和关节置换被大家公认为有效的治疗方法[7-8]，但由于激素型股骨头坏死患者大多年轻且同时合并免疫系统疾病，多数需要多次关节置换，因此股骨头坏死的早期诊断和治疗特别重要[5-6]。
目前大多数学者认为通过大转子下方钻孔可以降低股骨头内压力，有效改善股骨头内血液微循环，促进股骨头内新生骨形成[9-10]，随后出现了许多髓芯减压改良方法应用于基础实验和临床，如在髓芯减压通道内加入相关血管活性药物、血管内皮生成因子或相关骨组织工程材料等[10-11]。近些年来，牙髓干细胞工程发展迅速，由于其具有高度增殖及多向分化等强大生物学特性，可有效加快损伤后软骨组织修复能力[12]，为早期股骨头坏死保髋治疗带来新的希望。研究表明，牙髓间充质干细胞制剂中的干细胞活率在植入12 h后高达90%以上，并且可在2-8 ℃温度下保存和运输，保存周期长、制备方法简单[13-15]，但牙髓干细胞在早期股骨头坏死治疗领域尚未有报道，该研究拟利用口腔干细胞库的资源优势，探讨牙髓干细胞在早期股骨头缺血性坏死治疗中的作用及修复机制，为临床应用提供理论依据和新的治疗方法。

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，多组间比较采用方差分析，进一步两两组间比较采用q检验，方差不齐者采用秩和检验或卡方检验。
1.2 时间及地点实验于2019年11月至2020年6月在武汉云克隆科技有限公司动物实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物成年健康新西兰大白兔52只，雌雄不限，体质量2.0-2.5 kg，购买于湖北逸挚诚生物科技有限公司，实验动物批号：42817300000855，饲养于恒温、恒湿环境中。
1.3.2 实验试剂及耗材醋酸泼尼松龙注射液(浙江仙琚制药股份有限公司，批号181003)；3%戊巴比妥钠(上海新亚药业有限公司)；牙髓干细胞(北京泰盛生物科技有限公司，批号：S20200107)；正置白光拍照显微镜(Eclipse Ci-L，日本Nikon公司)；全景切片扫描仪(3DHISTECH，Hungary)；Skyscan1174 X-Ray Microtomograph(Micro CT)(比利时Bruker公司)；小动物X射线机；STR204颅骨钻；1.5 mm骨克氏针(强生Depuy-synthes)等。
1.4 实验方法
1.4.1 激素型股骨头坏死模型制备及动物分组成年健康新西兰大白兔52只，适应性喂养1周后进行称质量，随机选取10只作为正常对照组，其余42只制备激素型股骨头坏死模型[16]，在新西兰大白兔右侧臀部肌注醋酸泼尼松龙
8 mg/kg，每周2次，连续注射4周；正常对照组右侧臀肌注射等量生理盐水，每周2次，连续注射4周；所有动物左侧臀肌预防性注射青霉素8万U/kg，预防感染，每周2次，共4周。造模完毕后(第4周)随机抽取12只新西兰大白兔验证造模是否成功，取右侧股骨头进行苏木精-伊红染色，镜下观察骨小梁空骨陷窝，骨细胞核固缩，周围骨髓坏死包括脂肪细胞和造血细胞坏死，骨小梁正常而只有骨髓坏死也认为是骨坏死。经检测证实股骨头坏死造模成功后，将剩余30只新西兰大白兔随机分为模型组、溶媒组、牙髓干细胞组，每组10只。
1.4.2 干预方法确定造模成功后，模型组不进行任何治疗；溶媒组右侧行髓芯减压术，同时注射同体积的生理盐水溶液；牙髓干细胞组右侧行髓芯减压术，同时于股骨头减压孔注射牙髓干细胞。
1.4.3 手术方法所有动物右侧股骨头用于实验，采用3%戊巴比妥钠1 mL/kg剂量行耳缘静脉注射麻醉，待动物充分麻醉(3-5 min)后，用剃毛器剃除臀部股骨大转子部位毛发(拉伸收缩可以用手感应到股骨转子，充分暴露手术区)。将兔俯卧位固定，消毒后以大转子下2.0-3.0 cm为中心，沿股骨方向切开长约1.5 cm切口，暴露大转子及股骨转子，使用环形钻与股骨干呈70°角间断钻孔，形成直径2 mm×2 mm的小孔，在手动X射线透视仪监视下，保证导针穿过股骨颈并且不穿出股骨头，用导针抽吸减压。髓芯减压完成后，立即沿髓芯减压隧道注入牙髓干细胞(3×106/只)或等体积生理盐水溶液。注射完毕后，骨蜡封堵，并以3-0缝合线缝合标记隧道口并缝合皮肤切口，无菌纱布包扎固定。牙髓干细胞和生理盐水溶液共注射3次，以建模第1天记为第0天，即细胞注射时间为第4周(第28天)，第5周(第35天)，第6周(第42天)，其中第4周(第28天)细胞注射与髓芯减压术同步进行；第5周(第35天)，第6周(第42天)牙髓干细胞注射时，需要对动物进行静脉麻醉，麻醉成功后手按压寻找髓芯减压孔，若有必要可开小口，仍沿髓芯减压孔注射。
1.5 主要观察指标
1.5.1 X射线片观察骨密度造模12周后(兔子处死前)进行双侧股骨X射线检测，观察正常侧、造模侧骨密度。
1.5.2 大体观察股骨头形态 X射线检测结束后，即第12周末处死新西兰大白兔，大体观察股骨头外观、形态、关节软骨色泽等，拍股骨大体照，股骨取材完毕后，置于固定液中保存。
1.5.3 Micro CT检测骨形态计量学参数取右侧股骨头样本进行Micro CT扫描，采用Skyscan1174型Micro CT机的Scaner软件检测如下指标：骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数量、骨小梁分离度、骨密度、结构模型指数。
1.5.4 病理学检测 Micro CT扫描完成后进行病理学相关检测。股骨头放入体积分数为10%甲醛溶液中固定，5%硝酸脱钙，冠状面剖开取材，常规乙醇梯度脱水，石蜡包埋切片，供组织学观察；①苏木精-伊红染色：光镜下观察骨小梁、骨细胞、髓腔及造血细胞形态、结构和数量的变化。骨组织空骨陷窝率分析方法：每张切片挑选400倍视野进行拍照，拍照时尽量让组织充满整个视野，保证每张照片的背景光一致，应用Image-Pro Plus 6.0软件以400倍标尺为标准，选取相同骨小梁区域内无细胞核的骨组织陷窝为空骨陷窝，作为统一阳性标准，对每张照片进行分析得出空骨陷窝数量与总的骨陷窝数量，求出空骨陷窝率=空骨陷窝数量/总的骨陷窝数量×100%，于高倍镜下任选6个视野，每个视野计数50个骨陷窝，求出空骨陷窝率。②Masson染色：光镜下观察胶原生成情况，每张切片挑选100倍视野进行拍照，尽量让组织充满整个视野，保证每张照片的背景光一致，应用Image-Pro Plus 6.0软件，以单位像素Pixel作为标准单位，测量每张图片中的骨小梁像素面积和视野像素面积，计算出骨小梁面积占比=骨小梁像素面积/视野像素面积×100%。
1.6 统计学分析由第一作者经SPSS 12.0软件包处理，结果以x±s表示，先采用方差分析，如果组间有差异，组间比较采用q检验，方差不齐者采用秩和检验或卡方检验，以α=0.05为检验标准。

讨论

目前早期治疗股骨头坏死主要是通过各种手术技术或药物来改善股骨头局部血供，进而促进新生骨形成，预防或进一步阻止股骨头负重区塌陷。保留股骨头的治疗方法有很多，如非负重、电刺激、高压氧、旋转截骨、髓芯减压、松质骨或钽金属棒植入、肌骨瓣移植或血管移植等，其中最常用的方法为髓芯减压[17-21]，促进骨髓微循环及造血组织等病理生理改变，特别是对Ficat Ⅰ期及Ⅱ期患者疗效较好[8]，但是髓芯减压术本身仅仅是为患者提供了一个减压的环境，并不能有效诱导新生血管及新生骨形成，随后出现了许多髓芯减压的改良方法应用于实验和临床，主要是在髓芯减压的基础之上植入一些血管活性药物或成骨相关因子等[22-24]。该实验利用牙髓间充质干细胞强大的生物学活性及诱导成骨的作用，于不同时期注射于髓芯减压隧道内，是治疗早期股骨头坏死一种新的方法。
牙髓干细胞作为组织工程来源最为广泛的自体成体干细胞之一，通过增殖、诱导可以分化为软骨、成骨、神经、肌肉、脂肪等组织，目前在再生医学及组织工程领域受到研究者日益关注[25-26]。牙髓干细胞取自牙髓组织，取材方便且丰富，来源广泛，具有多向分化、高度增殖、免疫调节、分泌细胞活性因子等生物学特性[27-28]。体外培养的牙髓干细胞在适当的诱导条件下可以向成骨细胞分化，与骨髓间充质干细胞相比，分化能力更强，增殖速度更快[29-30]；KERMANI等[30-31]学者证实牙髓干细胞成骨诱导后可以表达碱性磷酸酶、骨桥蛋白等骨性标志物，并向成骨细胞分化，另外国内学者毛丽霞等[32]研究发现牙髓干细胞还具有独特的矿化能力，能够形成矿化结节和钙盐沉积。CHAMIEH等[29]学者将牙髓干细胞与生物支架材料共同培养，表现出较高的增殖分化和矿化能力，表达碱性磷酸酶、骨钙素、胶原蛋白等骨性标志物。研究表明，骨髓间充质干细胞可促进股骨头内微血管形成，还有实验证实其可以直接进入空骨陷窝并将其转化为成骨细胞[33]，而作者这项实验也证实了牙髓干细胞组空骨陷窝率明显低于溶媒组和模型组，病理学检查结果提示牙髓干细胞组可见较多新生成骨细胞，新生骨小梁形态规则，隧道内可见少量新生骨痂，成骨明显，空骨陷窝明显减少；与溶媒组相比，牙髓干细胞组骨小梁丰富且连续性好，未见骨小梁中断现象，隧道内有新生骨组织长入，可见部分新生毛细血管，提示牙髓干细胞能够促进股骨头坏死区新生骨形成。
髓芯减压术被公认为是股骨头缺血性坏死的有效治疗手段之一，早期股骨头坏死的治疗旨在及时修复坏死的骨组织，避免负重区进一步塌陷。HERNIGOU等[34]认为髓芯减压术的效果与骨髓基质细胞数目减少密切相关，最终导致股骨头修复不完全。作者这项实验研究发现股骨头坏死模型经过髓芯减压治疗12周后，溶媒组隧道区虽有不同程度新生骨形成，但是骨小梁覆盖面积明显小于牙髓干细胞组，成骨细胞明显少于牙髓干细胞组，说明钻孔区内骨髓基质干细胞数目太少，其质量和数量直接影响到软骨下骨的成骨和支撑问题，最终导致成骨不全及股骨头无法完全修复。
目前，牙髓干细胞已经成功在体外进行分离和培养并通过极限稀释法进行纯化，在X射线监视下通过髓芯减压术将体外培养的牙髓干细胞植入骨隧道内联合治疗股骨头坏死，旨在改善微循环、降低骨内压的同时提供股骨头修复重建的种子细胞。实验结果显示，造模后12周单纯髓芯减压组钻孔区骨小梁较模型组丰富，但仍出现骨质缺损区域，牙髓干细胞组隧道内有不同程度新生骨组织长入，可见较多新生成骨细胞，新生骨小梁形态规则，隧道内可见少量新生骨痂，成骨明显，空骨陷窝明显减少，说明牙髓干细胞产生了明显的生物学效应，提示牙髓干细胞能够改善股骨头血运、促进坏死骨修复。在实验观察各个阶段，牙髓干细胞组骨隧道内未见到明显的异物排斥反应，未发现明显聚集的炎性细胞产生，说明二者组织相容性好且免疫排斥反应发生率低，从组织学角度说明牙髓干细胞移植治疗股骨头坏死安全有效。影像学检测提示随着时间的延长，溶媒组和牙髓干细胞组股骨头均有不同程度的修复重建，Micro-CT各组参数均较模型组明显改善，牙髓干细胞治疗组疗效最佳，说明牙髓干细胞联合髓芯减压治疗股骨头坏死优于单纯髓芯减压术。影像学数据及病理学观察也证实了髓芯减压术在治疗早期股骨头坏死过程中起到了一定的作用，但程度有限，牙髓干细胞能够为股骨头修复重建提供种子细胞，并且与自体组织无任何免疫排斥反应，初步证实了牙髓干细胞联合髓芯减压术治疗早期股骨头坏死的疗效更佳。
早期股骨头坏死的保髋治疗已经成为目前临床研究的重点，牙髓干细胞具有高度的增殖分化及独特的矿化能力，可以作为股骨头坏死骨组织修复重建的理想种子细胞，促进骨缺损修复，对股骨头坏死的治疗有较大价值，因其较强的成骨能力在骨科及口腔科领域已得到广泛应用，但在股骨头坏死早期治疗领域尚未有实验报道。该实验根据影像学、病理学结果提示牙髓干细胞联合髓芯减压治疗早期股骨头坏死优于单纯髓芯减压术，为今后进一步研究乃至应用于临床提供了实验基础。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

髓芯减压联合牙髓干细胞治疗兔早期激素性股骨头坏死

Core decompression combined with dental pulp stem cells in the treatment of steroid-associated femoral head necrosis in rabbits

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 9

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	谭新访, 郭艳幸, 秦晓飞, 张斌清, 赵东亮, 潘琨琨, 李瑜卓, 陈皓宇. 顺轴疲劳运动对兔髌股关节软骨损伤的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(在线): 1-6.
[2]	王宝娟, 郑曙光, 张琪, 李田洋. 苗药熏蒸治疗膝骨关节炎模型兔可延缓细胞外基质的破坏[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1236-1242.
[3]	吕依妍, 李寒冰, 马晓庆, 张晗, 张宇航, 李根林. 采用复合因素建立内热消渴小鼠模型的特点分析[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1243-1249.
[4]	王景, 熊山, 曹金, 冯林伟, 王信. 白细胞介素3在骨代谢中的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1316-1322.
[5]	肖豪, 刘静 , 周君. 脉冲电磁场治疗绝经后骨质疏松症的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1323-1329.
[6]	朱婵, 韩栩珂, 姚承佼, 张强, 刘静, 邵明. 针刺治疗帕金森病：动物实验显示的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1330-1335.
[7]	阚厚铭, 范利君, 陈学泰, 申文. 富血小板血浆在神经病理性疼痛中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1345-1353.
[8]	张璟琳, 冷敏, 朱博恒, 汪虹. 干细胞源外泌体促进糖尿病创面愈合的机制及应用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1113-1118.
[9]	黄晨玮, 费彦亢, 朱梦梅, 李鹏昊, 于兵. 谷胱甘肽在干细胞“干性”及调控中的重要作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1119-1124.
[10]	惠小珊, 白京, 周思远, 王阶, 张金生, 何庆勇, 孟培培. 中医药调控干细胞诱导分化的理论机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1125-1129.
[11]	安维政, 何萧, 任帅, 刘建宇. 肌源干细胞在周围神经再生中的潜力[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1130-1136.
[12]	范一鸣, 刘方煜, 张洪宇, 李帅, 王岩松. 脊髓损伤后室管膜区内源性神经干细胞反应的系列问题[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1137-1142.
[13]	梁学振, 杨曦, 李嘉程, 骆帝, 许波, 李刚. 补肾活血胶囊介导Hedgehog信号通路调控大鼠骨髓间充质干细胞成骨成脂分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1020-1026.
[14]	王继芳, 鲍祯, 乔亚红. miR-206调控小细胞肺癌干细胞EVI1基因表达及细胞生物学行为[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1027-1031.
[15]	刘峰, 彭宇环, 罗良平, 吴本清. 植物源性碱性成纤维细胞生长因子维持人胚胎干细胞的生长与分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1032-1037.