萝卜硫素对H2O2诱导人肝细胞氧化应激损伤模型的保护作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2123

中国组织工程研究 ›› 2020, Vol. 24 ›› Issue (31): 5052-5056.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2123

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萝卜硫素对H2O2诱导人肝细胞氧化应激损伤模型的保护作用

谭静1，易国栋2

恩施土家族苗族自治州中心医院，1肾病风湿科，2消化内科，湖北省恩施市 445000

收稿日期:2019-01-12 修回日期:2019-02-15 接受日期:2019-03-01 出版日期:2020-11-08 发布日期:2020-09-04
通讯作者: 易国栋，硕士，主治医师，恩施土家族苗族自治州中心医院消化内科，湖北省恩施市 445000
作者简介:谭静，女，湖北省恩施州人，主治医师，主要从事抗细胞氧化应激损伤研究。

Protective effects of sulforaphane in a H2O2 induced oxidative stress model of human hepatocytes

Tan Jing1, Yi Guodong2

1Department of Nephrorheumatology, 2Department of Gastroenterology, Central Hospital of Enshi Autonomous Prefecture, Enshi 445000, Hubei Province, China

Received:2019-01-12 Revised:2019-02-15 Accepted:2019-03-01 Online:2020-11-08 Published:2020-09-04
Contact: Yi Guodong, Master, Attending physician, Department of Gastroenterology, Central Hospital of Enshi Autonomous Prefecture, Enshi 445000, Hubei Province, China
About author:Tan Jing, Attending physician, Department of Nephrorheumatology, Central Hospital of Enshi Autonomous Prefecture, Enshi 445000, Hubei Province, China

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

抗氧化防御体系：分为酶系和非酶系，酶系主要包括超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽还原酶、硫氧蛋白还原酶等；非酶系包括具有还原性的巯基蛋白如金属硫蛋白、谷胱甘肽及维生素E等。

萝卜硫素：作为一种具有抗氧化损伤的天然活性成分，已在多种疾病的防治中发挥着重要的生物学作用。萝卜硫素对肝脏功能具有很好的保护作用，能降低聚乙二醇诱导的肝细胞毒性，起着保肝、护肝的功效。

背景：氧化应激损伤在慢性肝炎发生发展中起着重要的作用，而天然产物萝卜硫素具有较好的抗氧化活性。

目的：研究萝卜硫素对H₂O₂诱导人肝细胞(LO2)氧化应激损伤的保护作用，并探讨其可能的作用机制。

方法：体外培养LO2细胞，采用H₂O₂诱导LO2细胞造模，并同时将细胞分为对照组、H₂O₂诱导组、H₂O₂+低剂量萝卜硫素组(10 μmol/L)、H₂O₂+中剂量萝卜硫素组(20 μmol/L)及H₂O₂+高剂量萝卜硫素组(40 μmol/L)。采用100 μg/L的H₂O₂处理人肝细胞24 h，诱导细胞氧化应激损伤；H₂O₂+萝卜硫素组将H₂O₂与不同浓度萝卜硫素同时处理细胞24 h。采用CCK8法分析萝卜硫素对细胞存活率的影响，分析细胞匀浆中的氧化应激产物水平，Western Blot法分析Nrf2、GCLC、NQO1及血红素加氧酶1蛋白表达水平。研究方案的实施符合恩施土家族苗族自治州中心医院的相关伦理要求。

结果与结论：①H₂O₂能诱导LO2细胞氧化应激损伤；②相比于H₂O₂模型组，各浓度萝卜硫素能诱导LO2细胞增殖、抑制丙二醛和一氧化氮的产生及促使超氧化物歧化酶活性升高(P < 0.05)；③Western Blot结果显示萝卜硫素能诱导Nrf2向细胞核内转移，诱导GCLC、NQO1和血红素加氧酶1蛋白表达(P < 0.05)；④结果说明，萝卜硫素能改善H₂O₂诱导的LO2细胞氧化应激损伤，其药理学作用与Nrf2信号传导活化有关。

ORCID: 0000-0001-7623-6253(谭静)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 萝卜硫素, 人肝细胞, 氧化应激, 血红素加氧酶1, 核因子E2相关因子2, 蛋白

Abstract:

BACKGROUND: Oxidative stress injury plays an important role in the development of chronic hepatitis, and sulforaphane is a natural product with good antioxidant activity.

OBJECTIVE: To investigate the protective effects of sulforaphane on oxidative stress injury of human hepatocytes (LO2) stimulated by H₂O₂, and to investigate its possible mechanism.

METHODS: LO2 cells were cultured in vitro, followed by 24-hour treatment with 100 μg/L H₂O₂ to induce the oxidative stress model of the cells. The cells were divided into five groups: control group, model group, sulforaphane treatment groups (low-, middle-, high-dose groups: H₂O₂+10, 20, and 40 μmol/L sulforaphane, respectively). Cell counting kit-8 was used to measure the relative survival rate of cells, and analyze the levels of oxidative stress products in cell homogenate. Western blot assay was used to determine the expression levels of

nuclear factor erythroid-2 related factor 2 (Nrf2), GCLC, NQO1 and heme oxygenase-1. The study protocol was in accordance with the related ethic requirements of Central Hospital of Enshi Autonomous Prefecture.

RESULTS AND CONCLUSION: H₂O₂ could induce oxidative stress injury in LO2 cells. Compared with the model group, sulforaphane at various concentrations could significantly induce the proliferation of LO2 cells, inhibit the production of malondialdehyde and nitric oxide, and promote the activity of superoxide dismutase (P < 0.05). Western blot results revealed that sulforaphane could induce the transfer of Nrf2 into the nucleus and significantly increase the expression of GCLC, NQO1, and heme oxygenase-1 proteins (P < 0.05). To conclude, sulforaphane can significantly relieve the oxidative stress injury of LO2 cells induced by H₂O₂ and its underlying mechanism may be related to the activation of Nrf2 pathway.

Key words: sulforaphane, human hepatocyte, oxidative stress, heme oxygenase-1, nuclear factor erythroid-2 related factor 2, protein

中图分类号:

谭静, 易国栋. 萝卜硫素对H2O2诱导人肝细胞氧化应激损伤模型的保护作用[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(31): 5052-5056.

Tan Jing, Yi Guodong. Protective effects of sulforaphane in a H2O2 induced oxidative stress model of human hepatocytes[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2020, 24(31): 5052-5056.

图/表（结果） 4

2.1 萝卜硫素对LO2细胞增殖的影响实验检测发现，H₂O₂刺激可以降低LO2细胞相对存活率(P < 0.01)；当采用低、中、高3种不同剂量萝卜硫素干预后，LO2细胞的增殖情况得到明显改善(P < 0.05)，且3种剂量萝卜硫素组LO2细胞存活率差异有显著性(t=6.327，P < 0.01)，表现出剂量依赖性。见表1。

2.2 萝卜硫素对LO2细胞匀浆中丙二醛、一氧化氮水平及超氧化物歧化酶活性影响见表2，H₂O₂干预能促使LO2细胞释放丙二醛、一氧化氮，而抑制超氧化物歧化酶活性(P < 0.01)；当采用低、中、高3种不同剂量萝卜硫素干预后，LO2细胞氧化应激损伤程度得到很好的改善(P < 0.05)，表现在丙二醛、一氧化氮水平降低，超氧化物歧化酶活性升高，且3种剂量萝卜硫素组丙二醛(t=3.269，P < 0.05)、一氧化氮(t=4.025，P < 0.01)水平及超氧化物歧化酶(t=9.314，P < 0.001)活性差异均有显著性意义。

2.3 萝卜硫素对Nrf2信号传导的影响 H₂O₂干预能抑制Nrf2向核内转移，提示经不同浓度萝卜硫素处理后，能明显促使Nrf2向核内转移(P < 0.05)，且3种剂量萝卜硫素组LO2细胞核中Nrf2蛋白表达差异有显著性意义(t=8.037， P < 0.001)。见图1。

2.4 萝卜硫素上调GCLC、NQO1和HO-1蛋白表达 H₂O₂干预LO2细胞能明显抑制GCLC、NQO1和HO-1蛋白表达(P < 0.01)；随着不同剂量的萝卜硫素干预后，细胞中GCLC、NQO1和HO-1蛋白的表达显著升高(P < 0.05)，且3种剂量萝卜硫素组GCLC(t=5.514，P < 0.01)、NQO1 (t=10.208，P < 0.001)及HO-1(t=6.320，P < 0.01)表达水平差异有显著性。见图2。

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引言

材料方法

1.1 设计细胞学实验观察。

1.2 时间及地点实验于2017年6月至2018年5月在恩施土家族苗族自治州中心医院中心试验室完成。

1.3 材料

1.3.1 细胞和药物人肝细胞系LO2购买于上海纪宁公司；萝卜硫素(杭州林格贝公司, 批号：20171106-2，纯度≥98%)。

1.3.2 实验用主要试剂 RPMI 1640培养基(Gibco公司)；胎牛血清(Gibco公司)；CCK8试剂盒(上海威奥公司，批号：CJ-150-25)；丙二醛试剂盒(上海恒远公司，批号：SHP-1230-24)；一氧化氮试剂盒(江苏泽雨公司，批号：HTC-4203-54)；超氧化物歧化酶SOD试剂盒(北京默沙克公司，批号：SJ-1540-93)；BCA试剂盒(北京索莱宝公司，批号：C15740)；SDS-PAGE凝试剂盒(江苏泽雨公司，批号：20170512)；β-actin、Histone、Nrf2、GCLC、NQO1及血红素加氧酶(HO-1)一抗均(美国Sigma公司)；对应二抗(Abcam公司)。

1.3.3 仪器 HBS-1096A酶标仪(南京德铁仪器公司)；SANYO细胞培养箱(美国BIO-RAD)；BIO-RAD成像系统(美国)。

研究方案的实施符合《赫尔辛基宣言》和恩施土家族苗族自治州中心医院对研究的相关伦理要求。

1.4 实验方法

1.4.1 LO2细胞处理 LO2细胞(1×10⁸ L^-1)采用RPMI 1640培养基进行传代培养，恒温37 ℃、体积分数5%CO₂浓度。待细胞生长至90%左右时，用无菌PBS清洗2次，0.25%胰酶-0.125%EDTA消化，收集细胞重悬，以1∶3比例传代培养。

1.4.2 细胞增殖检测将细胞悬液(1×10⁴/孔)接种于96孔板，分为对照组、H₂O₂诱导组、H₂O₂+低剂量萝卜硫素组(10 μmol/L)、H₂O₂+中剂量萝卜硫素组(20 μmol/L)、H₂O₂+高剂量萝卜硫素组(40 μmol/L)。采用100 μg/L的H₂O₂处理人肝细胞24 h，诱导细胞氧化应激损伤；H₂O₂+萝卜硫素组将100 μg/L的H₂O₂与不同浓度萝卜硫素同时处理细胞24 h，进行后续实验。萝卜硫素给药剂量参照文献[11]研究结果确定的低、中、高3种剂量。

培养24 h后吸干旧培养液，每孔加入10 μL CCK8试剂，继续于37 ℃、体积分数5 %CO₂条件下培养1 h，然后在450 nm处测定细胞吸光度A值，然后计算细胞相对存活率。细胞相对存活率(%)=A_药物组/A_对照组×100%。

1.4.3 氧化应激相关指标检测将细胞悬液接种于6孔板，按“1.4.2”项将细胞分组干预，于37 ℃、体积分数5 %CO₂条件下培养24 h后，将细胞裂解成匀浆，然后按照试剂盒操作方法检测丙二醛、一氧化氮水平及超氧化物歧化酶活性。

1.4.4 Western Blot法检测核蛋白Nrf2及组织GCLC、NQO1及HO-1蛋白表达按“1.4.3”项收集细胞，提取核Nrf2蛋白。具体步骤如下：将收集的细胞用2 mL Buffer A溶液重悬、离心、弃上清；在加入1 mL Buffer A溶液重悬细胞，冰上放置10 min；将悬液转入玻璃匀浆器，研磨5组，每组转15圈；1 000×g/min，4 ℃下离心10 min，此时上清为胞浆，可留样做后面的鉴定；将沉淀重悬于3倍体积的Buffer N，并将其轻轻覆盖于2体积的Buffer B上； 1 000×g/min，4 ℃下离心10 min；离心之后可看见管底和管中部液面分界处各有一沉淀，中部的沉淀即为核；再用PBS重悬中间沉淀，1 500×g/min 低温离心10 min，以洗去杂质，洗2遍，沉淀即为胞核。

另收集细胞提取总的GCLC、NQO1及HO-1蛋白。采用BCA试剂盒检测蛋白浓度后，上样进行凝胶电泳。每孔上样量50 μg，70 V电泳3 h，然后275 mA恒流进行电转 90 min，完成后用5%脱脂奶粉封闭1 h，切割目的蛋白条带。将条带放入对应的β-actin、Histone、Nrf2、GCLC、NQO1及HO-1一抗溶液(稀释比均为1∶1 000)中，反应过夜，TBST洗膜3次，每次10 min，加入HRP标记IgG二抗溶液(稀释比为1∶3 000)室温反应1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，ECL显色进行蛋白条带曝光。采用Image软件分析蛋白灰度值。

1.5 主要观察指标 ①各组LO2细胞增殖情况及存活率；②LO2细胞匀浆中丙二醛、一氧化氮水平及超氧化物歧化酶活性；③LO2细胞核中Nrf2蛋白表达；④LO2细胞中GCLC、NQO1和HO-1蛋白表达。

1.6 统计学分析运用SPSS 20.0软件进行数据处理，数据采用x(_)±s呈现，组间比较采用单因素方差分析检验，多组间计量资料采用单因素方差分析和LSD检验比较，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

氧化应激水平提示肝细胞中活性氧的产生及清除的稳态失衡，活性氧积累造成肝损伤。肝细胞线粒体、微粒体及氧化酶体都能够生成活性氧，主要以线粒体生成量居多。在清除活性氧体系中包含抗氧化酶、小分子抗氧化物质及具有抗氧化作用的Ⅱ相代谢酶，细胞中均依靠它们来维持氧化还原的稳态。在机体病理状态下活性氧过量生成，超过了抗氧化系统清除能力，引起肝功能障碍、肝细胞坏死，导致肝脏再生障碍^[8-9]。H₂O₂作为一种促氧化剂是由于本身表现出氧化作用，还能够引起活性氧的过量产生而导致蛋白质及脂质的过氧化损伤，常用于诱导氧化应激损伤模型^[10]。此次实验采用H₂O₂成功构建LO2细胞氧化损伤模型，能作为后续实验的研究对象。

萝卜硫素作为一种具有抗氧化损伤的天然活性成分^[6-7]，已在多种疾病的防治中发挥着重要的生物学作用。此次实验结果也发现萝卜硫素可以很好地改善H₂O₂诱导的氧化损伤，主要通过抑制丙二醛、一氧化氮的产生及超氧化物歧化酶活性来实现。前期预实验结果发现萝卜硫素给药剂量在5-60 μmol/L范围内对LO2细胞没有明显毒性作用，并参照早期相关研究的结果^[11]，最终确定此次实验萝卜硫素的低、中、高3种剂量。相关研究也提出，萝卜硫素对肝脏功能具有很好的保护作用，包括上调肝组织中药物代谢酶的活性^[12]，还能降低肝脏中葡萄糖的产生，进而降低了2型糖尿病发生的风险^[13]。萝卜硫素还能降低聚乙二醇诱导的肝细胞毒性^[14]，起着保肝、护肝的功效。另外，萝卜硫素对哺乳期暴露于铅的鼠海马区的氧化损伤也表现出较好的药理作用，主要抑制了海马组织丙二醛的产生及诱导了超氧化物歧化酶活性^[15]。早期发现萝卜硫素对缺血/再灌注肝损伤具有显著的保护作用，主要通过抑制肝细胞凋亡来发挥保护作用^[16]。然而，萝卜硫素在保肝护肝中的作用机制还处于初步研究阶段。其中Nrf2信号传导是介导氧化应激反应最经典的通路，当Nrf2磷酸化后与Keap1相互结合转入至细胞核，从而结合到ARE序列编码相关靶基因的转录^[17-18]。早期研究也证实萝卜硫素能通过激活Nrf2信号传导抑制多种炎症小体的活化^[19]，还能诱导肿瘤细胞凋亡^[20]。

Nrf2是调节氧化还原稳态的关键转录因子之一^[21-22]，可调控氧化应激相关酶类包括谷氨酰半胱氨酸连接酶催化亚单位(GCLC)^[23]、NAD(P)H醌氧化还原酶(NQO1)及血红素加氧酶(HO-1)的基因表达^[24^-^25]，从而对抗环境中有害物质引起的氧化应激反应。在衰老和氧化应激过程中，萝卜硫素能通过诱导Nrf2/ARE/PRDX6信号通路活性，使细胞的抗氧化防御能力重新激活^[26]。此次研究发现萝卜硫素能诱导Nrf2向细胞核内转移，进而转录GCLC、NQO1及HO-1等基因表达。文章缺乏对Nrf2下游通路ARE/PRDX6活化的作用，于是会在后续实验中考察萝卜硫素对Nrf2/ARE/ PRDX6信号通路活性的影响。

实验结果发现H₂O₂能明显抑制Nrf2向细胞核内的转移，加快了LO2细胞氧化损伤的发展；而萝卜硫素能显著缓解H₂O₂的这种抑制作用，促使Nrf2向细胞核内的转移，并上调GCLC、NQO1及HO-1蛋白的水平。总之，萝卜硫素能很好的改善LO2细胞的氧化损伤，可能与Nrf2信号通路的活化有关。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

萝卜硫素对H2O2诱导人肝细胞氧化应激损伤模型的保护作用

Protective effects of sulforaphane in a H2O2 induced oxidative stress model of human hepatocytes

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