2.1  脱细胞血管材料组织形态分析结果  猪颈动脉脱细胞后呈乳白色，血管形态无明显变化，弹性较好。苏木精-伊红染色显示，正常的猪颈动脉含有大量的细胞，单层排列的内皮细胞均匀分布于管腔中，而平滑肌细胞分布在中膜层的胶原中(图1A)；SDS+Triton X-100组猪颈动脉中可见较多蓝染分布的残留细胞(图1B)；SDS+SDC组猪颈动脉管壁全层与管腔中未见明显蓝染的细胞残留(图1C)。

Masson染色显示，正常的猪颈动脉管壁内含大量蓝染的胶原纤维，并且胶原排列整齐(图2A)；SDS+Triton X-100组猪颈动脉血管壁可见较大的空白区域，同时可见局部纤维断裂(图2B)；SDS+SDC组猪颈动脉血管壁内可见排列整齐且紧密的胶原纤维，胶原完整(图2C)。

2.2  脱细胞血管材料DNA含量分析结果  DNA含量检测显示，脱细胞两组DNA含量明显低于对照组(P < 0.05)；SDS+SDC组DNA含量低于SDS+Triton X-100组(P < 0.05)，见表1所示。

2.3  脱细胞血管材料力学性能分析结果  3组间爆裂强度、缝合耐受强度比较差异有显著性意义(P < 0.05)，脱细胞两组爆裂强度、缝合耐受强度低于对照组(P < 0.05)，脱细胞两组间爆裂强度与缝合耐受强度比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见表1。

2.4  脱细胞材料扫描电镜分析结果  扫描电镜观察结果显示，对照组颈动脉内膜较致密，存在细胞样突起，外膜则较疏松，可见错综复杂排列的纤维组织；SDS+Triton X-100组颈动脉内膜可见较多的小空洞，内膜基底层纤维较分散，而外膜纤维仅见少量的分散纤维；SDS+SDC组颈动脉内膜较完整，未见细胞样突起，外膜可见交错排列的较细纤维束，见图3。

2.5  脱细胞血管材料动物皮下植入实验   

2.5.1  苏木精-伊红染色结果  术后1周时，两组颈动脉材料周围均可见大量的炎性细胞浸润，主要为单核-巨噬细胞、白细胞与淋巴细胞；术后2周时，SDS+SDC组材料周围炎性细胞减少，SDS+Triton X-100组材料周围炎性细胞轻微减少；术后4周时，SDS+SDC组材料周围炎性细胞进一步减少，仅可见小量的炎性细胞浸润，而SDS+ Triton X-100组材料周围仍可见较明显的炎性细胞浸润；术后8周时，SDS+SDC组材料周围已无炎性细胞浸润，SDS+Triton X-100组材料周围仍可见明显的淋巴细胞浸润，见图4。

2.5.2  免疫荧光染色结果  术后1，2，4，8周时，镜下可见大量大鼠自体细胞进入两组颈动脉材料内部，其中以CD68阳性巨噬细胞为主，见图5。但是不同的时间点下，两组CCR7阳性细胞数量与CD163阳性细胞数量存在一定的差异：术后4，8周时，SDS+Triton X-100组CCR7阳性细胞数量明显多于CD163阳性细胞数量(P < 0.01)，SDS+SDC组CD163阳性细胞数量明显多于CCR7阳性细胞数量(P < 0.01)；SDS+Triton X-100组术后2，4周时的CCR7阳性细胞数量多于SDS+SDC组(P < 0.05)，术后4，8周的CD163阳性细胞数量明显少于SDS+SDC组(P < 0.05)；通过统计两组术后不同时间点的CCR7阳性细胞与CD163阳性细胞比例得出，SDS+SDC组CCR7/CD163比例低于SDS+Triton X-100组(P < 0.05)，具体结果见图6。

血管旁路移植手术是许多血管闭塞性疾病的有效治疗手段^[1-2]，临床中多数使用患者自体血管材料，但由于自体血管材料不足使大不部分患者未得到有效治疗，因此寻求可以替代自体血管材料的移植物具有重要的临床意义。早期研究者将尼龙或是涤纶纤维与膨体聚四氟乙烯纤维编织的人工血管材料应用于临床血管的重建，获得了较好的效果^[3]，但是该类人工血管材料增加了血栓栓塞、内膜增生的风险^[4-5]。

随着组织工程概念的提出与不断的发展，利用其构建组织工程血管为血管搭桥术的移植血管提供了新的选择。而合适的支架材料在构建组织工程血管中发挥了至关重要的作用。目前组织工程研究中常用的支架有合成材料和生物材料，而近年来经过脱细胞处理的天然材料引起了学者的广大关注^[6-7]。经过脱细胞处理的生物材料保留了细胞外基质与完整的骨架结构，为细胞生长提供了良好的生长环境，但是如果脱细胞不完全可能导致移植物的免疫排斥反应，所以脱细胞技术也是目前研究的热点。去垢剂脱细胞法已被广泛用于制备细胞外基质支架^[8-9]，其可分为离子型和非离子型2种。有研究将不同的去垢剂联合应用于脱细胞中取得了不错的效果^[10]。例如许洁等^[11]联合应用十二烷基硫酸钠、Triton X-100与脱氧胆酸钠制作大鼠子宫去细胞支架，通过扫描电镜、组织化学染色、免疫组化等方法证实该方法可有效去除细胞，完全保留支架中的细胞外基质蛋白成分。梁远锋等^[12]将3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐与十二烷基硫酸钠联合应用于人脐动脉的脱细胞处理，苏木精-伊红、Masson、EVG等组织染色、扫描电镜、DNA及胶原定量分析证实该方法较完全第去除了血管壁的细胞成分，且较为完整的保留了血管的组织结构，同时支架具有良好的细胞相容性与力学性能。蒲磊   等^[13]的体外实验显示非离子型去垢剂联合离子型去垢剂的脱细胞效果优于单一成分脱细胞效果。基于以上研究，实验将脱细胞效果较好的离子型去垢剂十二烷基硫酸钠分别与非离子型去垢剂Triton X-100、离子型去垢剂脱氧胆酸钠联合用于脱细胞处理中，分析两种方式的脱细胞效果及对免疫反应的影响。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

1.1  设计  对观察性实验。

1.2  时间及地点  实验于2019年1至8月在江南大学实验室完成。

1.3  材料  获取市售普通家猪颈动脉40根，颈动脉热缺血时间≤30 min，颈动脉内径3.0-4.0 mm，长度10-12 cm。检查动脉的完整性后以无菌PBS清洗，后置于4 ℃冰盒内。到达实验室后剥离血管外膜及周围脂肪组织，放入含  100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素的无菌PBS内，4 ℃保存备用。

1.3.1  实验动物  健康6周龄SD大鼠32只，体质量200-210 g，由江南大学动物实验中心提供。

1.3.2  主要试剂与仪器  十二烷基硫酸钠购自购自济南旭顺化工有限公司；脱氧胆酸钠购自杭州晓柚生物科技有限公司；Triton X-100购自碧云天生物技术有限公司；PicoGreen^® dsDNA 定量分析试剂盒购自杭州联科美讯生物医药技术有限公司；小鼠抗大鼠CD68抗体购自北京启维益成科技有限公司；兔抗大鼠CD163抗体购自生工生物工程(上海)股份有限公司；兔抗大鼠CCR7抗体购自武汉博士德生物工程有限公司；CST2002智能数字压力校验仪购自西安市高精密仪表厂；CMT2503万用材料试验机购自上海恒驭仪器有限公司；BDS200-FL倒置荧光显微镜购自北京世纪科信科学仪器有限公司；Aseet倒置显微镜购自苏州艾视特光学仪器有限公司。

1.4  实验方法

1.4.1  脱细胞方法  取18根颈动脉，随机分为3组，分别为对照组、SDS+SDC组、SDS+Triton X-100组，每组6根。其中对照组颈动脉不做脱细胞处理。

SDS+SDC组^[14]：将颈动脉放入双蒸水内处理24 h，置于35 mL含1%十二烷基硫酸钠与1%脱氧胆酸钠的混合溶液内处理72 h，每24 h换液一次；24 ℃恒温摇床持续震荡(250 r/min)，去除残存的去垢剂；以PBS漂洗120 h，每12 h换液一次。

  SDS+Triton X-100组^[14]：将颈动脉放入双蒸水内处理24 h，置于35 mL含1%十二烷基硫酸钠与1%Triton X-100的混合溶液内处理72 h，每24 h换液一次；24 ℃恒温摇床持续震荡(250 r/min)，去除残存的去垢剂；以PBS漂洗  120 h，每12 h换液一次。

1.4.2  脱细胞材料组织形态分析  取3组颈动脉部分组织样本，置于40 g/L多聚甲醛中固定24 h，梯度乙醇脱水后二甲苯透明处理，石蜡包埋后切片，切片厚度5 µm，分别进行苏木精-伊红染色与Masson染色。

1.4.3  脱细胞材料DNA含量分析  取3组颈动脉组织样本100 mg，放入-20 ℃冰箱内过夜，随后置于-80 ℃冰箱内冻干48 h，研磨为粉末后，置于0.1 mL 0.1g/L胃蛋白酶溶液、0.8 mL含0.5 mol/L醋酸的氯化钠溶液中孵育72 h，置于0.1 mL胰蛋白酶溶液与0.1 mL 10×TBS溶液内，利用PicoGreen^® dsDNA 定量分析试剂盒定量分析DNA含量。

1.4.4  脱细胞材料扫描电镜分析  将脱细胞两组颈动脉样本置于2.5%戊二醛中4 ℃固定24 h；PBS清洗3次，每次5 min；叔丁醇渗透后冷冻干燥处理，电镀喷金后日本立式扫描电镜JSM-IT300下观察样本内外膜结构。

1.4.5  脱细胞材料力学性能分析  取3组颈动脉样本，修剪为3 cm长度，将样本的一段结扎密闭，另一端连接于充满PBS的压力泵内，逐渐加压至样本破裂，采用 CST2002 智能数字压力校验仪检测样本破裂时管腔内的压力(爆裂强度)。将3组颈动脉样本修剪为2 cm长度，一端用5-0 Polypropylene缝线等距缝合3针，进针点距切缘2 mm，而后将缝线固定于万用材料试验机的上端；样本的另一端固定于万用材料试验机下端，拉伸速度为10 cm/min，样本撕裂时的拉力为缝合耐受强度。

1.4.6  脱细胞血管材料动物皮下植入实验  将32只SD大鼠随机分为2组，每组16只。腹腔注射1%戊巴比妥钠    35 mg/kg麻醉，脊柱背部剃毛后碘伏消毒，沿背部中央皮肤做一长约1 cm的纵行切口，其中一组皮下植入SDS+ SDC组脱细胞处理颈动脉，另一组皮下植入SDS+Triton X-100组脱细胞处理颈动脉，颈动脉样本长度约1 cm，缝合切口。术后常规饲养。术后1，2，4，8周，每组每个时间点各取4只大鼠麻醉后脱臼处死，取出移植血管材料，进行组织学分析。

苏木精-伊红染色：将标本置于体积分数10%甲醛中固定24 h，梯度乙醇脱水处理，二甲苯透明后石蜡包埋，-20 ℃冷冻石蜡组织24 h，制作厚度约6 µm的石蜡切片，脱蜡水化后常规苏木精-伊红染色，中性树脂封固后显微镜下观察。

免疫荧光染色：将标本置于体积分数10%甲醛中固定24 h，梯度乙醇脱水处理，二甲苯透明后石蜡包埋，-20 ℃冷冻石蜡组织24 h，制作厚度约6 µm的石蜡切片，脱蜡水化；以PBS清洗3次，每次5 min；以体积分数5%山羊血清室温封闭30 min；弃封闭血清后添加稀释的一抗，分别为小鼠抗大鼠CD68(1∶150)、兔抗大鼠CD163    (1∶100)、兔抗大鼠CCR7(1∶150)，4 ℃孵育24 h；室温下复温30 min，以PBS清洗3次，每次5 min；添加荧光标记的二抗，分别为山羊抗小鼠IgG(1∶200)、山羊抗兔IgG(1∶200)，室温孵育2 h；以PBS清洗3次，每次5 min；以含DAPI的封固液封固后荧光显微镜下观察。每张切片随机选择6个部位进行CD163、CCR7阳性细胞计数，取平均值。

1.5  主要观察指标  两组脱细胞材料的组织学分析、扫描电镜分析、力学分析与DNA含量检测结果，以及植入大鼠背部皮下的炎性反应与免疫反应。

1.6  统计学分析  实验结果数据以x(_)±s表示，组间比较采用Tukey法及独立样本t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。统计处理软件为SPSS 21.0。

生物支架脱细胞的目的在于去除引起异种抗原的细胞成分，最大程度地保留完整的细胞外基质，使材料具备一定的力学性能。目前使用的脱细胞方法主要有物理、化学及生物法^[15-18]，每种各有其优缺点，多数研究尝试联合几种方法进行脱细胞处理以获得较理想的血管材料。去垢剂作为目前较成熟的脱细胞方法，具有操作简便、破坏小、实验条件容易控制等优点，其可以溶解细胞质与细胞核，破坏细胞膜来释放细胞内的细胞骨架蛋白，分离DNA^[18-19]。在离子型去垢剂中，十二烷基硫酸钠和脱氧胆酸钠通过溶解细胞成分获得细胞外基质，具有较好的脱细胞效果。在非离子型去垢剂中，Triton X-100通过破坏脂-脂和脂-蛋白间的分子连接而去除细胞，脱细胞效果较温和^[20-21]。目前国内外联合应用去垢剂脱细胞的研究不多，其中LAWSON等^[10]将十二烷基硫酸钠与3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐(CHAPS)联合应用获得了脱细胞血管材料，并将其成功应用到慢性肾功能衰竭患者的血管移植中，经美国食品药品监督管理局(FDA)批准进入三期临床试验。蒲磊等^[13]研究发现，非离子型去垢剂的脱细胞效果差，其联合应用离子型去垢剂能更有效去除细胞成分，其进一步比较了不同去垢剂联合应用的脱细胞效果，通过苏木精-伊红染色、五色套染、扫描电镜、免疫组织化学检测发现非离子型去垢剂联合应用离子型去垢剂能更有效去除细胞成分^[14]，但是该实验仅为体外观察结果，在此基础上，此次实验观察了非离子型去垢剂联合应用离子型去垢剂脱细胞的体内应用效果。因此，此次实验选择脱细胞效果较好的十二烷基硫酸钠分别与非离子型去垢剂Triton X-100、离子型去垢剂脱氧胆酸钠联合用于脱细胞处理中，分析脱细胞效果。

预实验采用1%十二烷基硫酸钠+1%脱氧胆酸钠、0.5%十二烷基硫酸钠+0.5%脱氧胆酸钠对猪颈动脉进行脱细胞处理，苏木精-伊红染色显示两种方式脱细胞较完全，并且胶原纤维束和弹性蛋白保存完整，但是1%十二烷基硫酸钠+1%脱氧胆酸钠组的微观形态孔隙等结构好于0.5%十二烷基硫酸钠+0.5%脱氧胆酸钠组，异种抗原α-1，3-Gal表达低于0.5%十二烷基硫酸钠+0.5%脱氧胆酸钠组，其顺应性与0.5%十二烷基硫酸钠+0.5%脱氧胆酸钠组比较无统计学差异。虽然1%十二烷基硫酸钠+1%脱氧胆酸钠组的长轴最大应力和杨氏模量较0.5%十二烷基硫酸钠+ 0.5%脱氧胆酸钠组有所下降，但是也在可接受的范围之内，所以综合各方面结果，作者认为1%十二烷基硫酸钠+ 1%脱氧胆酸钠的处理方法更适合应用于脱细胞血管基质的制备。此次实验苏木精-伊红染色与Masson染色显示，1%十二烷基硫酸钠联合1%脱氧胆酸钠脱细胞方案未见明显的细胞残留，脱细胞较完全，并且保留了较完整的细胞外基质结构，而1%十二烷基硫酸钠联合1%Triton X-100脱细胞方案可见细胞残留，脱细胞不完全，细胞外基质结构有轻微破坏。组织工程学组织工程学中有效脱细胞的标准为每1 mg干质量组织内的DNA含量<50 ng^[22]，此次实验DNA含量分析两种联合脱细胞方案的DNA含量均<50 ng，说明两种方法均可有效去除细胞成分，但是相较于1%十二烷基硫酸钠联合1%Triton X-100脱细胞方案，1%十二烷基硫酸钠联合1%脱氧胆酸钠脱细胞方案可较完全的去除细胞成分。

任何一种去垢剂均不可避免的破坏细胞外基质结构，而基底膜是细胞黏附和增殖的理想锚基。扫描电镜结果显示，1%十二烷基硫酸钠联合1%Triton X-100脱细胞方案基底膜破坏较明显，而1%十二烷基硫酸钠联合1%脱氧胆酸钠脱细胞方案基底膜保存较完整，为细胞的黏附与增殖提供了条件。但是也有研究认为完整的基底膜不利于细胞的迁移^[23]。

理想的血管材料必须具备一定的机械强度与爆破强度，但脱细胞处理会不同程度的破坏细胞外基质结构，影响其生物力学性能。此次实验结果显示，脱细胞处理后颈动脉的机械强度与爆破强度较正常血管降低，1%十二烷基硫酸钠联合1%Triton X-100脱细胞方案组机械强度与爆破强度稍高于1%十二烷基硫酸钠联合1%脱氧胆酸钠脱细胞方案，但组间差异无统计学意义。多数研究证实在脱细胞材料中植入内皮细胞或平滑肌细胞可显著提升材料的力学性能^[24-25]，作者认为在脱细胞血管中植入内皮细胞或平滑肌细胞可进一步提升材料的爆裂强度，进而满足组织工程血管要求。两种脱细胞方案获得的血管材料缝合强度均大于2 N，可以耐受组织工程血管移植^[26-27]。

皮下埋植实验显示，1%十二烷基硫酸钠联合1%脱氧胆酸钠脱细胞血管材料具有良好的组织相容性。有研究显示脱细胞的有效性与巨噬细胞极化和体内重塑结局密切相关^[28]，未有效去除细胞成分的材料主要诱导巨噬细胞向M1型分化，导致重塑结果较差。巨噬细胞可分化为包括M1、M2a、M2b、M2c在内的极化表型，其中的M2表型巨噬细胞在组织修复和伤口愈合中发挥了重要作用。M1型巨噬细胞可促进单核巨噬细胞的聚集，分泌大量促症因子包括白细胞介素12、白细胞介素6、肿瘤坏死因子等，然而M2型则可以分泌大量抗炎症因子，诱导巨噬细胞清除凋亡细胞及组织修复的作用。巨噬细胞浸润为血管再生的关键步骤，在大鼠主动脉移植的实验中发现^[20]，CD68标记的巨噬细胞在移植的血管壁上均匀分布，随着时间推移，细胞数逐渐增多，同时血管移植后的第7天和14天时在血管移植物周围组织中CD206标记的M2巨噬细胞也被发现，进一步表明了巨噬细胞可能会刺激细胞迁移至移植物并参与调节其增殖、分化、分泌细胞因子及组织重塑。实验以CD68标记巨噬细胞，以CCR7标记M1型巨噬细胞，以CD163标记M2型巨噬细胞，实验结果显示，两种脱细胞处理血管材料皮下埋植后血管内的巨噬细胞表型有很大的差异，1%十二烷基硫酸钠联合1%脱氧胆酸钠脱细胞血管材料各个时间点的CD163阳性细胞数量明显多于CCR7阳性细胞数量，而1%十二烷基硫酸钠联合1%Triton X-100脱细胞血管材料各个时间点的CCR7阳性细胞数量多于CD163阳性细胞数量，说明1%十二烷基硫酸钠联合1%脱氧胆酸钠脱细胞血管材料主要诱导巨噬细胞向M2型分化，1%十二烷基硫酸钠联合1%Triton X-100脱细胞血管材料主要诱导巨噬细胞向M1型分化。但是目前关于细胞核成分残留与体内免疫反应程度之间的关系与具体机制尚不清楚。

综合此次实验结果，相对比1%十二烷基硫酸钠联合1%Triton X-100脱细胞处理方案，1%十二烷基硫酸钠联合1%脱氧胆酸钠脱是较有前景的脱细胞细胞处理方案，但是关于两种去垢剂的最适配比与作用时间值得进一步研究。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

文题释义：

去垢剂：又称表面活性剂，是一类既具有亲水基又具有疏水基的物质，一般具有乳化、分散和增溶作用，可分阴离子、阳离子和中性去垢剂等多种类型，中性去垢剂在蛋白提取中应用较多。 

巨噬细胞的极化：巨噬细胞可分化为包括M1、M2a、M2b、M2c在内的极化表型，其中的M2表型巨噬细胞在组织修复和伤口愈合中发挥了重要作用。M1型巨噬细胞可促进单核巨噬细胞的聚集，分泌大量促症因子包括白细胞介素12、白细胞介素6、肿瘤坏死因子等，然而M2型可以分泌大量抗炎症因子，诱导巨噬细胞清除凋亡细胞及组织修复的作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

目前国内外联合应用去垢剂脱细胞的研究不多，其中Lawson等将十二烷基硫酸钠与3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐(CHAPS)联合应用获得了脱细胞血管材料，并将其成功应用到慢性肾功能衰竭患者的血管移植中，经美国食品药品监督管理局(FDA)批准进入三期临床试验。研究发现，非离子型去垢剂的脱细胞效果差，其联合应用离子型去垢剂能更有效去除细胞成分，其进一步比较了不同去垢剂联合应用的脱细胞效果，通过苏木精-伊红染色、五色套染、扫描电镜、免疫组织化学检测发现非离子型去垢剂联合应用离子型去垢剂能更有效去除细胞成分，但是该实验仅为体外观察结果，在此基础上，此次实验观察了非离子型去垢剂联合应用离子型去垢剂脱细胞的体内应用效果。因此实验选择脱细胞效果较好的十二烷基硫酸钠分别与非离子型去垢剂Triton X-100、离子型去垢剂脱氧胆酸钠联合用于脱细胞处理中，分析脱细胞效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程