2.1  RSC96细胞形态及鉴定  贴壁培养的RSC96细胞株具有原代许旺细胞的典型形态，细胞呈纺锤状或三角形，在细胞两极伸出细长突起，细胞核呈圆形或椭圆形，位于细胞中心，见图1A。S100免疫荧光染色结果显示，RSC96细胞染色阳性，见图1B-C。因此，RSC96许旺细胞株可以用来研究许旺细胞相关生物活性。

2.2  褪黑素对许旺细胞增殖活性的影响  如图2F所示，培养24 h后，不同浓度褪黑素组以及空白对照组两两比较，许旺细胞的吸光度值无显著性差异。表明不同浓度的褪黑素作用24 h，许旺细胞的增殖活性无显著改变，因此，接下来的Transwell细胞迁移实验选择20 h为检测时间点。

2.3  褪黑素促进许旺细胞迁移  用Transwell小室检测不同浓度褪黑素对许旺细胞迁移活性的影响。如图2所示，不同浓度褪黑素组迁移到Transwell下室的细胞数量均高于空白对照组，其中1，10 μmol/L褪黑素组细胞数相较于空白对照组差异有显著性意义(P < 0.001)；此外，1 μmol/L褪黑素组迁移细胞数目显著多于10 μmol/L组(P=0.011)。因此，一定浓度褪黑素促进许旺细胞迁移，对其产生化学性吸引作用，然而随着浓度继续增高，褪黑素促进许旺细胞迁移的作用逐渐减弱。

2.4  许旺细胞主要表达受体MT1  以大鼠松果体作为阳性对照，PCR结果显示，松果体和许旺细胞均表达MT1和MT2的mRNA，见图3A；许旺细胞中MT1和MT2的相对含量表示为各自循环阈值(Ct)与β-actin循环阈值的比值，进而以MT2相对Ct值为参照，比较许旺细胞中MT1和MT2的相对含量发现，许旺细胞中MT1的表达量显著高于MT2 (P=0.003)，见图3B；Western-blot显示，松果体和许旺细胞均表达MT1蛋白，见图3C；此外，在褪黑素作用下，相较于空白对照组，MT1蛋白在许旺细胞中表达量显著增加(P=0.006)，见图3D，E。因此，许旺细胞主要表达褪黑素受体MT1。

2.5  Wnt/β-catenin信号通路而非MT1介导褪黑素促进许旺细胞迁移的作用  接下来探究褪黑素是否通过MT1或Wnt通路促进许旺细胞迁移。分别用MT拮抗剂luzindole (50 μmol/L)或Wnt通路抑制剂IWR-1(2 μmol/L)预处理许旺细胞1 h，然后行Transwell实验。如图4所示：相对于单纯褪黑素组，褪黑素+IWR-1组细胞迁移数量明显降低(P < 0.001)，但仍高于空白对照组(P < 0.001)。然而，褪黑素+ luzindole组相较于单纯褪黑素组迁移细胞数目无明显改变，差异无显著性意义。因此，褪黑素通过激活Wnt/ β-catenin信号通路促进许旺细胞迁移，而MT1不介导褪黑素对许旺细胞迁移活性的影响。

2.6  褪黑素激活许旺细胞Wnt/β-catenin信号通路  Western-blot检测褪黑素促进许旺细胞迁移过程中，Wnt通路的激活情况。结果显示，相对于空白对照组，1 μmol/L褪黑素作用下，许旺细胞中P-Lrp6和LEF-1的蛋白表达上调(P=0.002)，P-Lrp6/Lrp6比值升高(P=0.001)，见图5A-C，且细胞核中β-catenin蛋白水平显著上升(P=0.012)，见图5D-E。因此，褪黑素能促进β-catenin核转移，激活Wnt信号通路。

2.7  褪黑素对许旺细胞Wnt/β-catenin信号通路的活性具有保护性作用  由于IWR-1能在一定程度上拮抗褪黑素促进许旺细胞迁移的作用，接下来通过Western-blot探究IWR-1干预下，许旺细胞中Wnt通路的激活情况。如图6所示，和单纯褪黑素组比较，IWR-1+褪黑素组许旺细胞中LEF-1蛋白表达显著下调(P=0.013)，核β-catenin蛋白水平明显下降(P < 0.001)，但是二者表达量均仍高于空白对照组和单纯IWR-1组(LEF-1分别为：P=0.035，P=0.004；β-catenin分别为：P=0.019，P=0.014)。因此，褪黑素对Wnt信号通路的活性具有保护性作用。

周围神经损伤是当今工业化社会最常见的损伤类型之一，常导致患者感觉丧失、瘫痪和创伤性神经瘤的发生^[1]。不同于中枢神经系统，周围神经损伤后能够再生，这主要取决于其神经胶质细胞——许旺细胞。周围神经损伤后，其远侧残端发生Wallerian变性^[2]，许旺细胞去分化，进而大量增殖，协同巨噬细胞清除变性轴突和髓鞘碎片，分泌多种神经营养因子，并向神经损伤处定向迁移，形成Bunger带，引导近端再生轴突长入^[3-4]，最终形成髓鞘并对靶器官重新形成神经支配。然而，许旺细胞迁移形成管状通道速度较慢，再生轴突长入损伤远端并重新神经支配靶器官需要长达3个月以上^[5-6]，加之神经损伤处易形成胶原瘢痕阻挡轴突再生^[7-8]，周围神经再生的效果很有限。因此，通过外源性因素促进许旺细胞有序迁移，能有效促进周围神经再生。

褪黑素是由松果体分泌的一种毒副作用少且易代谢的神经内分泌激素^[9]，具有广泛的生理活性，如调控昼夜生物节律、抗衰老、改善骨质疏松和软骨退变等^[1，10]，其作用可由其受体介导，其中细胞膜受体褪黑素受体(melatonin receptor1，2，MT1，MT2)研究最广泛^[11]。褪黑素对神经系统也具有广泛的保护作用，不仅对损伤的中枢神经系统具有保护作用^[9，12]，并且能够促进周围神经损伤后再生。褪黑素能够减弱轴突裂解和髓鞘变性，抑制神经损伤处胶原积累和神经瘤形成^[13]，促进切割伤、挤压伤以及缺血再灌注损伤的周围神经再生^[8，14]，对损伤的坐骨神经、面神经和正中神经均具有保护作用^[8，15-16]。在组织工程领域，负载褪黑素的神经导管支架通过促进许旺细胞增殖或减少氧化应激，能有效修复坐骨神经缺损^[1，17]。有研究报道，褪黑素作用于MT1促进许旺细胞增殖^[18]，通过减弱氧化应激抑制许旺细胞凋亡^[19]。然而，褪黑素对许旺细胞迁移的作用及其机制尚不明确。

研究报道，褪黑素能够激活Wnt/β-catenin信号通路延缓神经元细胞衰老^[20]，并抑制损伤脊髓中神经元凋亡^[21]。褪黑素通过激活Wnt/β-catenin信号通路抑制氧化应激导致的许旺细胞凋亡^[19]。此外，Wnt/β-catenin信号通路激活能够促进皮肤成纤维细胞、脐静脉内皮细胞以及MC3T3-E1细胞的迁移活性^[22-24]。因此，实验通过体外培养大鼠许旺细胞RSC96细胞株，研究褪黑素对许旺细胞迁移的影响，并探讨该作用是否由其受体MT和Wnt/β-catenin信号通路所介导，以进一步明确褪黑素促进周围神经损伤修复的机制，为其将来作为临床治疗策略的选择提供一定理论基础。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1  设计  细胞学体外观察实验。

1.2  时间及地点  于2019年3至6月在天津市骨科研究所完成。

1.3  实验方法

1.3.1  RSC96细胞培养  复苏冻存的RSC96细胞(中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；动物伦理审批编号：2020医伦审044)，加入含体积分数10%胎牛血清(FBS，Gibco，美国)的高糖DMEM培养基(含青霉素100 U/mL、链霉素62.5 U/mL)，于37 ℃、含体积分数5% CO₂培养箱中培养，每隔3 d换1次培养基，细胞浓度80%-90%后，EDTA和胰酶消化，1∶3接种培养瓶传代，用于后续实验。

1.3.2  许旺细胞鉴定  将许旺细胞从培养瓶中消化下来行细胞爬片，待细胞铺满约60%行许旺细胞标志物S100 (Abcam，英国)免疫荧光染色进行鉴定。40 g/L多聚甲醛固定细胞30 min，PBS浸洗，浸入体积分数0.3% Triton X-100的PBS中透膜15 min，PBS洗涤，血清封闭，PBS稀释S100小鼠抗大鼠单克隆一抗，4 ℃过夜孵育细胞，PBS浸洗，PBS稀释共轭FITC的山羊抗小鼠二抗，37 ℃孵育1 h，DPAI复染细胞核，PBS浸洗，荧光显微镜观察。

1.3.3  细胞增殖实验  将消化后的许旺细胞用含体积分数10% FBS的高糖DMEM培养基重悬，并调整细胞浓度为1×10⁷ L^-1，每孔100 μL接种于96孔板，在37 ℃，体积分数5% CO₂培养箱中孵育细胞，24 h后饥饿细胞，将培养基更换为含有不同浓度(100 nmol/L，1 μmol/L，10 μmol/L)褪黑素的培养基，并设置不含褪黑素的基础培养基为空白对照组，3种不同浓度褪黑素干预组和空白对照组继续培养24 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，继续孵育4 h后，用酶标仪检测每孔450 nm处的吸光度值。

1.3.4  Transwell细胞迁移实验  将去血清饥饿后的许旺细胞消化后，用含体积分数1%FBS的高糖DMEM培养基重悬细胞并调整细胞浓度为1.5×10⁸ L^-1，将150 μL细胞悬液接种于Transwell小室(24孔，8 μm孔径，Corning公司，美国)上室，将700 μL含不同浓度褪黑素的1% FBS高糖DMEM培养基加到小室下室，体积分数5% CO₂，37 ℃培养箱中培养20 h后取出。棉签擦去上室内表面未迁移细胞，40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS清洗，用0.5%结晶紫溶液(北京索莱宝科技有限公司)染色15 min，PBS清洗，显微镜观察，每张膜随机选9个区域行细胞计数，每组重复实验3次。为探讨褪黑素是否通过受体MT1或者Wnt/ β-catenin信号通路介导许旺细胞迁移，许旺细胞用MT拮抗剂Luzindole(MedChemExpresss，美国)或Wnt通路抑制剂IWR-1(MedChemExpresss)预处理1 h，实验设置为空白对照组，褪黑素干预组，Luzindole组，褪黑素+Luzindole组，IWR-1组和褪黑素+IWR-1组，行Transwell细胞迁移实验，20 h后，迁移至Transwell下室的细胞行结晶紫染色，显微镜观察，每张膜随机选9个区域行细胞计数。

1.3.5  qRT-PCR检测MT1和MT2 mRNA表达  褪黑素绝大多数的生理作用主要由其受体MT1，MT2所介导^[25]。文献报道，褪黑素作用于MT2加速轴突的生长和伸长^[26]，并促进小脑颗粒细胞和脐带血间充质干细胞迁移和运动^[27-28]，而MT1能够介导褪黑素抑制癌细胞迁移^[29]，及褪黑素降低白细胞趋化性的作用^[30]，因此实验通过qRT-PCR检测MT1和MT2 mRNA的表达，以探究褪黑素促进许旺细胞迁移的作用是否由其受体介导。以大鼠松果体作为阳性对照，大鼠由天津医院实验动物研究室提供，体质量(260±10) g，饲养环境：相对湿度50%-80%，温度(22±2) ℃，昼夜循环12 h。用Trizol提取许旺细胞总RNA，用反转录试剂盒(Takara公司，日本)将提取的RNA反转录为cDNA，使用qRT-PCR试剂盒(Takara公司)，根据说明书配制PCR反应液，移置PCR 仪扩增，β-Actin为内参，根据公式2^-∆∆Ct，计算靶基因MT1和MT2在许旺细胞中的相对表达量。引物序列见表1。

1.3.6  Western-blot检测MT1，P-Lrp6，Lrp6，LEF-1和β-catenin蛋白表达  鉴于Wnt/β-catenin信号通路在活化过程中，Wnt配体与跨膜受体(Frizzled/LRP5/6)相结合，进而使下游细胞质中的β-catenin大量积聚并移位入细胞核，并与下游T细胞转录因子/淋巴样增强因子(TCF/LEF)结合形成转录复合体，最终调控相应基因的转录^[31]，因此，实验采用Western-blot检测P-Lrp6，Lrp6，LEF-1和β-catenin蛋白的表达量，以明确褪黑素是否激活Wnt信号通路。将许旺细胞接种于6孔板，检测各实验组靶蛋白表达情况。用含PMSF的RIPA裂解液提取细胞总蛋白，用细胞核蛋白提取试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)提取核蛋白，用BCA蛋白定量试剂盒检测样本蛋白浓度，配置SDS-PAGE凝胶，每组取等量变性蛋白上样行电泳，200 mA电流转膜2 h，硝酸纤维膜浸入体积分数5%脱脂牛奶封闭2 h，加入相应一抗4 ℃过夜孵育，抗体分别为兔抗大鼠P-Lrp6、Lrp6单克隆抗体(1∶1 000, Cell Signaling Technology Inc.，美国)，兔抗大鼠β-catenin多克隆抗体(1∶2 000，Abcam，英国)，兔抗大鼠LEF-1单克隆抗体(1∶1 000，Abcam，英国)，小鼠抗大鼠β-Actin单克隆抗体(1∶3 000，北京索莱宝科技有限公司)，兔抗大鼠MT1多克隆抗体(1∶1 000，Abbiotech，美国)，TBST洗涤，相应辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育2 h，TBST洗涤，ECL显色曝光，以β-Actin为内参，使用软件Image J分析计算各实验组相对于空白对照组条带的相对灰度值。

1.4  主要观察指标  许旺细胞S100免疫荧光染色鉴定结果；CCK-8实验探究褪黑素对许旺细胞增殖活性影响；Transwell细胞迁移实验检测褪黑素对许旺细胞迁移活性的影响；qRT-PCR检测许旺细胞褪黑素受体MT1和MT2表达情况；Western-blot检测褪黑素作用下，许旺细胞中MT1蛋白表达及Wnt信号通路的激活情况。

1.5  统计学分析  研究数据用x(_)±s表示，采用SPSS 22.0软件行统计学分析，两组间比较采用t 检验，多组间比较采用单因素方差分析，采用Bonferroni法行两两比较，P < 0.05为差异有显著性意义。

褪黑素对多种细胞的迁移和运动具有调控制作用，实验发现一定浓度褪黑素增强许旺细胞的迁移活性。研究报道，褪黑素能促进大鼠小脑颗粒细胞迁移^[27]，促进骨髓间充质干细胞归巢，改善肝纤维化^[32]，增强脐带血间充质干细胞运动，促进小鼠皮肤创面愈合^[28]。另一方面，褪黑素也能抑制血管内皮生长因子诱导的人脐静脉内皮细胞迁移^[33]，并能抑制结肠癌、肺癌细胞等癌细胞迁移和侵袭^[29，34]。因此，褪黑素在不同的生物环境下促进或抑制细胞迁移。实验发现，一定浓度褪黑素促进许旺细胞迁移，而随着褪黑素浓度升高，其对许旺细胞迁移的促进作用逐渐减弱。这可能是由于许旺细胞迁移是由多种信号通路所介导，不同浓度褪黑素对不同信号级联反应的调控可能也具有差异性^[18]，在不同信号通路的交叉作用下，导致不同浓度褪黑素对许旺细胞迁移活性的作用表现出差异性。在神经系统发育及损伤后再生过程中，轴突导向因子对轴突延伸起化学吸引或排斥作用，引导轴突正确导向，例如，轴突导向因子Netrin-1基因敲除小鼠的感觉神经轴突在投射过程中会出现严重靶向错误，导致脊髓发育畸形^[35]。周围神经横断后，远断端许旺细胞Netrin-1表达上调^[35]。Netrin-1在体外可作用于Unc5b受体促进许旺细胞迁移^[36]。因此，褪黑素在一定条件下可能也具有类轴突导向因子功能。周围神经损伤后，一定浓度褪黑素对许旺细胞产生化学性吸引作用，参与对许旺细胞有序迁移和排列过程的调控，促进其形成轴突定向再生的通道，进而促进再生轴突正确长入远端^[37]。

MT在实验条件下不介导褪黑素促进许旺细胞迁移的作用。实验发现，许旺细胞主要表达MT1，这和CHANG等^[18]的研究相一致，并且褪黑素显著上调许旺细胞表达的MT1。尽管褪黑素大部分生物学功能由其受体MT1和MT2所介导，并且MT1或MT2可介导褪黑素对小脑颗粒细胞、间充质干细胞以及癌细胞的迁移或侵袭活性的调控^[27-29]，然而，实验发现MT拮抗剂luzindole作用下，褪黑素促进许旺细胞迁移的数目没有显著改变，因此，上调的MT表达水平可能介导褪黑素对许旺细胞其他生理活性的调控。

Wnt/β-catenin信号通路介导褪黑素对许旺细胞迁移活性的调控。Wnt/β-catenin信号可介导多种细胞的迁移活性^[22-24]。其在激活状态下，Wnt配体与跨膜受体(Frizzled/ LRP5/6)相结合，失活细胞质中降解复合体(APC/GSK3β/ CK1/AXIN)，使β-catenin在细胞质中稳定积聚，进而进入细胞核，与T细胞转录因子/淋巴样增强因子(TCF/LEF)结合形成转录复合体，调控靶基因转录。无Wnt配体时，β-catenin与APC和AXIN结合并被GSK3β和CK1磷酸化，随后被该降解复合体泛素化并降解^[31]。研究报道，褪黑素通过激活β-catenin信号通路，促进间充质干细胞和小鼠成骨前体细胞MC3T3-E1向成骨细胞分化^[31，38]。褪黑素激活Wnt/β-catenin信号通路延缓神经元细胞衰老^[20]，并抑制损伤脊髓神经元凋亡^[20]。此外，褪黑素也可失活Wnt/ β-catenin信号从而抑制脊索瘤复发和肺癌细胞侵袭^[29，39]。因此，褪黑素既可以激活，也可失活Wnt/β-catenin信号通路，从而介导不同生理活动。坐骨神经损伤后，Cdc42激活Wnt/β-Catenin信号通路促进许旺细胞增殖和迁移^[40]。褪黑素通过激活Wnt/β-catenin信号通路抑制氧化应激导致的许旺细胞凋亡^[19]。Wnt/β-catenin信号通路激活后既能促进许旺细胞去分化和增殖^[41]，也能促进许旺细胞形成髓  鞘^[42]，在周围神经再生的不同阶段皆可起到促进作用。实验发现，Wnt通路抑制剂IWR-1显著抑制褪黑素促进许旺细胞迁移的作用，Western-blot显示，褪黑素促进β-catenin核定位，显著上调许旺细胞中P-Lrp6和LEF的表达，并在一定程度上抑制IWR-1导致的Wnt信号失活。作为一种强效的亲脂亲水剂，褪黑素能独立于MT直接穿透细胞膜清除氧自由基^[9]，有研究报道，褪黑素对缺血性脑损伤的神经保护作用也不通过膜受体MT介导^[43]。因此，一定浓度褪黑素激活Wnt/β-catenin信号通路促进许旺细胞迁移，而这一作用可能独立于其胞膜受体。

褪黑素腹腔注射或局部给药均能促进损伤周围神经再生，这与其促进许旺细胞增殖、并抑制其凋亡相关^[8，18-19]，实验通过体外实验进一步阐明，一定浓度褪黑素通过激活经典Wnt/β-catenin信号通路促进许旺细胞迁移，对其产生化学性吸引作用。因此，实验进一步明确了褪黑素促进损伤周围神经再生的分子机制，丰富了其应用于临床治疗创伤性周围神经缺损的理论基础，然而，尚须进一步研究其他信号通路在褪黑素调控许旺细胞迁移过程中的作用。此外，尽管RSC96许旺细胞株已广泛应用于许旺细胞迁移活性的研究中^[39]，但与原代细胞仍有一定差异性，尚须进一步探讨褪黑素对原代许旺细胞迁移活性的影响；也须通过动物实验验证褪黑素对许旺细胞迁移的作用。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

文题释义：

褪黑素：是一种广泛存在于动植物中的胺类化合物(N-乙酰基-5-甲氧基色胺)。在哺乳动物体内主要由松果体分泌，也广泛存在于胃肠道、肾脏、性腺等组织器官，其分泌受昼夜节律调控，并具有广泛的生理作用。

许旺细胞：是周围神经系统的神经胶质细胞，由神经嵴细胞分化而来，形成髓鞘，包裹轴索，使轴突与周围组织绝缘，实现神经动作电位“跳跃式传导”。周围神经损伤后，成熟的许旺细胞去分化，协同巨噬细胞清除变性的轴突和髓鞘碎片大量增殖，分泌神经营养因子和轴突导向因子，定向迁移形成Bunger带，促进损伤神经再生。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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