2.1  大鼠骨髓间充质干细胞的形态  在倒置相差显微镜下观察可见：刚接种的细胞绝大多数呈圆形，以悬浮状分散在培养基中，在24 h半量换液时，部分细胞已贴壁，细胞呈不规则分布，在细胞培养瓶底呈分散片集状；48 h换液时可见绝大多数细胞均已贴壁，细胞开始呈放射状排列，以梭形和星形细胞居多；3-5 d后放射状排列的细胞形成细胞集落，细胞以梭形为主，伸出长短不一的突起，大部分为单核、胞浆丰富，有清晰的核仁，见图1A，B；1周后，细胞呈集落状生长，漩涡状，融合度达到80%左右，在9 d左右细胞片状融合，见图1C，即可传代培养；细胞传代1 d后就会完全贴壁生长，此时可见细胞形态一致，呈梭形，轮廓清楚，生长比较旺盛，见图1D；1周左右可以传代，细胞形态变得越来越均一，无显著变化。

2.2  大鼠骨髓间充质干细胞的生长曲线  从图2可以看出，第3代培养的骨髓间充质干细胞在1-3 d为细胞生长潜伏期，4-6 d为细胞对数增殖期，6 d后进入平台期。

2.3  大鼠骨髓间充质干细胞的成骨诱导能力鉴定  成骨诱导液诱导培养后，细胞形态变化较大，逐渐由梭形转变为多边形，胞质中出现钙化斑点；诱导14 d后碱性磷酸酶染色可见细胞的胞核被染成蓝色，见图3A；诱导21 d后，细胞呈多层性、重叠性排列，形成多层白色的钙化结节，见图3B，茜素红染色矿化结节呈现红色，见图3C，D。

2.4  大鼠骨髓间充质干细胞表面标志物的表达  流式细胞术检测结果显示CD29、CD90为阳性表达，阳性表达率分别为99.9%和99.1%；CD34、CD45为阴性表达，符合骨髓间充质干细胞的表面标记，见图4。

2.5  骨髓间充质干细胞在复合材料周围的生长情况  倒置相差显微镜下可见：骨髓间充质干细胞与材料共培养1 d后生长良好，许多细胞从材料边缘爬出到培养板中，见图5A-C；骨髓间充质干细胞与材料共培养3 d后细胞增殖明显，复合材料边缘已经铺满细胞，见图5D-F。

2.6  锻烧骨/壳聚糖复合材料对成骨诱导的骨髓间充质干细胞成骨分化相关基因表达的影响  图6A-C分别显示碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原和骨钙素在不同时间的表达。在诱导第1天，碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原和骨钙素在每组材料中几乎都没有表达，与对照组比差异无显著性意义(P > 0.05)。

图6A可以看出：碱性磷酸酶从诱导的第1天开始到第14天表达呈上升趋势，14 d后碱性磷酸酶的表达量逐渐下降；在第7天和第14天，3种复合材料组碱性磷酸酶的表达均高于对照组(P < 0.05)，锻烧骨/壳聚糖=2/1组碱性磷酸酶表达略高于另外2种复合材料组，但单因素方差分析结果显示3组不同比例材料之间差异无显著性意义(P > 0.05)。

从图6B可以看出：Ⅰ型胶原从诱导的第1天开始到第14天表达呈上升趋势，14 d后Ⅰ型胶原的表达量逐渐下降，但第21天的表达明显高于第1天；在第7天和第14天，3种复合材料组Ⅰ型胶原的表达均高于对照组(P < 0.05)，锻烧骨/壳聚糖=2/1组Ⅰ型胶原表达仍略高于另外2种复合材料组，但单因素方差分析结果显示3组不同比例材料之间差异无显著性意义(P > 0.05)。

从图6C可以看出：骨钙素从诱导后的第1天到第7天几乎没有表达，从第7天开始到第21天表达呈上升趋势；在第14天和第21天，3种复合材料组骨钙素的表达均高于对照组(P < 0.05)，锻烧骨/壳聚糖=2/1组骨钙素表达仍略高于另外2种复合材料组，但单因素方差分析结果显示3组不同比例材料之间差异无显著性意义(P > 0.05)。

种植义齿因美观、舒适、咀嚼效率高等诸多优点目前已在临床得以广泛应用，但种植义齿修复对骨量有较高要求。在口腔颌面部领域，骨移植材料常被用来填充骨缺损，再生牙周组织，以及保存拔牙位点来为口腔种植奠定基  础^[1]。如今，全球每年都要使用数以万计的骨移植材料来改善骨量，骨缺损的修复和牙槽嵴的保存仍然是临床口腔种植面临的重大难题。目前，国内外学者均在努力寻找各种方法来获得理想的骨修复材料。

骨修复材料包括自体移植、异体移植、异种移植和人工骨替代物^[2]。各种骨移植材料修复骨缺损主要通过3种方式，即骨生成、骨诱导及骨引导^[3]。骨生成是指以成骨细胞和前体成骨细胞建立成骨中心，随后逐步形成骨修复。骨诱导即在成骨诱导因子(如转化生长因子、骨形态发生蛋白、血小板衍生生长因子等)作用下，未分化间充质细胞诱导分化为成骨细胞等从而产生新骨。评价骨修复支架材料是否理想主要考虑以下几点：①生物可降解性理想，也就是组织生长速度和支架材料降解速率基本一致^[4]；②具备高度多孔结构，为骨髓间充质干细胞等细胞提供更多的附着和生长空间，从而使其具有更好的生物学特性；③具有骨传导性和骨诱导活性，有利于间充质干细胞分化为成骨细胞，帮助钙盐沉积和新骨长入^[5]；④表面特性理想，材料表面形貌应能形成纳米壁龛，促进细胞的黏附增殖，其表面活性物质可富集骨诱导因子，产生缓释效果。

骨髓间充质干细胞是一种具有多向分化潜能的细胞，它可以在一定条件下定向诱导分化成为成骨细胞、成纤维细胞、脂肪细胞、软骨细胞、神经细胞等多种细胞，目前已成为组织工程中常用的细胞^[6]。原代骨髓间充质干细胞具有来源丰富、增殖力强、在体外多次大量扩增而不会丧失其多分化潜能等优点，已成为骨组织工程中最好的细胞来源，广泛用于骨组织修复^[7]。自体骨、同种异体骨、异种骨和合成骨可以作为骨增量材料，但它们因为种种缺点在临床应用中受到限制。如何研制出类似“金标准”天然骨的具有微纳多级渐变梯度结构和稳定高效骨诱导活性的人工骨修复材料，是目前亟待解决的关键问题。

壳聚糖是葡萄糖胺和乙酰葡萄糖胺的共聚物，是甲壳素脱乙酰化的产物，来源于市面上可买到的天然聚合物甲壳素。壳聚糖可以被溶菌酶水解，是自然界中可生物降解的高分子材料之一，它的产物可以控制，而且无毒、非致畸、非致癌^[8]。研究表明壳聚糖可以抑制成纤维细胞的增殖和黏附，诱导骨髓间充质干细胞向成骨方向分化，因而具有骨传导及骨诱导的双重功能，在骨移植方面拥有良好的潜力^[9]。锻烧骨是一种天然衍生的骨材料，它的主要成分是羟基磷灰石，其无机成分和牙齿十分相近。锻烧骨具有多孔性，可为成骨细胞和骨髓间充质干细胞的体内外生存提供微环境，将其植入骨缺损部位能形成很好的骨结合。这种材料还具有良好的强度和生物相容性^[10]，因此可以选择锻烧骨作为骨髓间充质干细胞的支架材料。但煅烧骨的力学强度低、脆性大、整体比较松散、不能承重、缺乏骨诱导性，仅仅作为天然骨形成的支架。目前已有学者将壳聚糖与羟基磷灰石、骨髓间充质干细胞等组分进行复    合^[11-13]，发现复合处理既能发挥原组成材料的明显优势，又能克服自身的弊端，具有较好的成骨性能。刘斌钰等^[13]通过动物体内实验证实复合骨髓间充质干细胞和富含血小板血浆的锻烧骨能够促进下颌骨缺损修复，促进血管化与骨化。KIM等^[14]研究表明以羟基磷灰石为主要成分的羟基磷灰石/聚乳酸复合材料能够促进骨髓间充质干细胞成骨分化相关mRNA的表达，具有诱导骨髓间充质干细胞分化成骨的作用。课题组前期实验选用锻烧骨与壳聚糖按照人体骨组织有机质和无机质的比例重组，并对该材料的生物特性进行检验，结果表明该复合材料微观结构与自然骨组织相似，安全无毒，具有良好的生物相容性、生物活性、可降解性、骨传导性及一定的骨诱导性，符合骨移植材料的要求。此外，课题组前期研究已证实成骨细胞在该复合材料上黏附并生长良好，确定了该材料有利于成骨的可能性。基于前期实验成果，该研究将骨髓间充质干细胞与不同质量比例的锻烧骨/壳聚糖复合材料共培养，采用免疫荧光定量PCR方法检测成骨相关基因的表达，从而体外评估锻烧骨/壳聚糖复合材料对成骨分化的影响，为该复合材料的临床应用奠定理论基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1  设计  细胞形态学观察实验。

1.2  时间及地点  2017年1月至2018年9月在四川大学口腔疾病研究国家重点实验室完成。

1.3  材料  实验动物为3周左右的SPF级SD大鼠5只，雌雄不限，体质量20 g左右，由四川大学华西校区实验动物中心提供；α-MEM培养基(Hyclone，USA)；胎牛血清、0.25%胰蛋白酶-EDTA(Gibco，USA)；双抗(青霉素/链霉素，Sigma，USA)；CCK-8试剂盒(DOJINDO，Japan)；碱性磷酸酶测定试剂盒(南京建成，中国)；CD29、CD34、CD45、CD90单克隆抗体(Biolegend，USA)；地塞米松溶液(Sigma，USA)；β-甘油磷酸钠(Sigma，USA)；抗坏血酸注射液(Sigma，USA)；氯仿(成都科龙，中国)；异丙醇(成都科龙，中国)；TRIZOL(Invitrogen，USA)；mRNA反转录试剂盒(Takara，Japan)；real-time RT-PCR引物(Takara，Japan)。

1.4  实验方法

1.4.1  大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养  选取3周龄、体质量20 g左右的SD大鼠，颈椎脱臼法处死，在无菌条件下取股骨内的骨髓，使用含双抗(50 U/mL青霉素、    50 mg/L链霉素)及体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养基放置到37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱中进行培养；培养1 d后半量换液，以后每3 d全量换液；待细胞生长达80%左右融合后，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，按1∶2或1∶3比例传代，根据细胞的生长情况每两三天更换1次培养基，重复以上操作，当细胞传至3代后待用。

1.4.2  大鼠骨髓间充质干细胞的形态学观察  采用倒置相差显微镜观察细胞的形态和生长变化，拍照记录。

1.4.3  大鼠骨髓间充质干细胞的生长曲线  第3代骨髓间充质干细胞按细胞浓度为2×10⁷ L^-1接种到96孔培养板，设10个复孔，测定9个时间点(第1-9天)细胞增殖情况，为了避免检测吸光度时细胞污染，每个时间点各使用1个96孔细胞培养板，共计9个培养板。每孔加入10 μL CCK-8试剂，放入37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱中继续培养1 h，立即用酶联免疫检测仪在450 nm波长下测定每孔的吸光度值。计算10个复孔的平均吸光度值作为最终结果，以时间为横轴，吸光度值为纵轴绘制细胞增殖曲线。

1.4.4  大鼠骨髓间充质干细胞的成骨诱导分化鉴定  第3代骨髓间充质干细胞按照1×10⁶细胞密度接种到6孔培养板，待细胞贴壁生长融合至80%时，在培养板中加入成骨诱导液进行诱导分化。成骨细胞诱导液配方：含体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养基、10 mmol/L维生素C、  1 mol/L β-甘油磷酸钠、1 mmol/L地塞米松。成骨诱导14 d后进行碱性磷酸酶染色，倒置相差显微镜下观察并拍照记录；成骨诱导21 d后，倒置相差显微镜下观察到有白色结节出现，用体积分数为95%乙醇固定，0.1%茜素红染液进行钙结节染色，倒置相差显微镜下观察并拍照记录。

1.4.5  大鼠骨髓间充质干细胞的流式细胞鉴定  第3代骨髓间充质干细胞融合到80%以上时，用0.25%胰蛋白酶- EDTA 37 ℃消化细胞，以细胞浓度为2×10⁹ L^-1加入到流式管中(每管2 mL细胞悬液)；以离心半径13.5 cm，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入3 mL PBS封闭液，常温封闭     20 min，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入3 μL抗体(鼠单克隆抗体CD29、CD34、CD45、CD90)，振荡1 min，4 ℃避光30 min，加入3 mL PBS封闭液，混匀、离心、弃上清；加入300 μL PBS，200目细胞筛过滤，使用贝克曼FC-500流式细胞仪进行检测^[15]。

1.4.6  大鼠骨髓间充质干细胞与锻烧骨/壳聚糖复合材料共培养  锻烧骨/壳聚糖复合材料的制备与表征参见课题组以往发表文章^[16]。将3种不同质量比例的锻烧骨/壳聚糖复合材料(锻烧骨/壳聚糖比例分别为1/2，1/1，2/1)制备成20 mm长×20 mm宽×1 mm厚的膜状。将处理好的复合材料放入6孔培养板，另外设置一个不加复合材料的孔为对照组，每组材料分别设9个复孔。将第3代骨髓间充质干细胞按细胞密度1×10⁵/孔接种到预先放入复合材料的6孔培养板，每孔加入含成骨诱导液的α-MEM培养基2 mL，每隔2 d更换成骨诱导培养液。每天定时在倒置相差显微镜下观察骨髓间充质干细胞在材料周围的生长情况并拍照记录。

1.4.7  RT-qPCR实验  分别在成骨诱导1，2，3周时收集样本，提取总RNA，使用Takara PrimeScript^® RT reagent Kit With gDNA Eraser反转录试剂盒在BioRad 1000^TM Thermal Cycler上进行反转录，获得cDNA。利用primer 6.0生物软件，根据SD大鼠的相对基因mRNA序列设计引物，选择GAPDH基因作为内参，引物由Takara公司合成。引物设计见表1。根据反应体系在ABI 7300上进行实时荧光定量PCR，采用两步法PCR扩增标准程序，反应程序如下：95.0 ℃ 30 min；95.0 ℃ 5 min，56.0 ℃ 30 min，重复39个循环；95.0 ℃ 15 min；熔解曲线65 ℃至95 ℃，扩增0.5 ℃ 5 min。所有样本重复检测3次以减少测量误差。基因表达情况按以下公式计算^[17]：目的基因表达量= 2^-ΔΔCt。ΔΔCt=实验组ΔCt-对照组ΔCt，ΔCt=目的基因Ct-内参基因Ct。

1.5  主要观察指标  ①大鼠骨髓间充质干细胞的形态学观察；②大鼠骨髓间充质干细胞的成骨诱导分化能力鉴定；③大鼠骨髓间充质干细胞表面标志物的表达；④锻烧骨/壳聚糖复合材料与骨髓间充质干细胞共培养成骨诱导后成骨分化相关基因的表达。

1.6  统计学分析  利用SPSS 17.0软件包对数据进行统计分析，两组之间的比较用独立样本t 检验，多组之间的比较用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，组内两两比较采用SNK法，P < 0.05为差异有显著性意义。

在所有的骨修复材料中，自体骨移植是金标准^[18]，因为它们拥有最佳的骨传导性矿物质、骨祖细胞和骨诱导蛋白，可促进骨生长而不引起任何免疫原性反应。然而，考虑到自体骨移植的缺点，如供体组织不足^[19]、不可预测的吸收问题以及取骨供区疼痛、感染等问题^[20-21]，临床医生经常使用商业骨替代物(包括同种异体骨、异种骨和人工骨替代物)，这些替代物易于获得，易于加工成形以适应特定应用。课题组使用的煅烧骨就是通过高温煅烧牛骨获得的异种骨。

目前用于分离培养骨髓间充质干细胞的技术主要有全骨髓培养法^[22-23]、密度梯度法^[24]、免疫磁珠法及流式细胞仪法^[25-26]。实验采用全骨髓培养法获取骨髓间充质干细胞，利用骨髓间充质干细胞容易贴壁的特点进行传代培养和纯化。实验方法简单易行可靠，对试剂要求较少，经传代和换液等方法即可去除杂细胞，传至第3代时就能得到纯度较高的细胞，相比其他实验方法保持了细胞较高的增殖活性。关于骨髓间充质干细胞的鉴定，目前没有统一的“金标准”，但是普遍认为可以通过3个方面检测来鉴定待测的细胞为骨髓间充质干细胞：①形态和生长特征：骨髓间充质干细胞在塑料及玻璃培养瓶容易贴壁，细胞呈纤维细胞样、集落状生长；②多向分化潜能：经特定的成骨或成脂诱导液诱导后，可分化为成骨细胞或脂肪细胞；③细胞的免疫标志物：骨髓间充质干细胞中阳性表达的标志物有CD13、CD29、CD44、CD56、CD105，而CD14、CD34、CD45、CD90呈阴性表达^[27]。该实验分离培养的骨髓间充质干细胞经流式细胞术鉴定CD45、CD34阴性，CD29、CD90表达阳性，结合经成骨诱导液后碱性磷酸酶染色及茜素红钙结节染色均显示成骨细胞的阳性特征，表明实验中采用的全骨髓培养法培养的骨髓间充质干细胞纯度较高，保证后续实验的准确性和真实性。在骨形成过程中，前成骨细胞分化为成熟的成骨细胞需要经历3个时期^[28]：细胞增殖期、基质成熟期和基质矿化期，在不同的阶段会有不同的细胞表面标志物共同参与表达。在细胞增殖期，成骨细胞数量不断增多，此时主要分泌Ⅰ型胶原，碱性磷酸酶也开始有表达；随后细胞的增殖速度变慢，细胞开始分化并进入基质成熟期，此时碱性磷酸酶表达进入高峰期，Ⅰ型胶原也存在较高的表达，在基质成熟后期可以检测到骨保护素和骨钙素的表达；随着基质矿化期的到来，骨保护素和骨钙素逐渐高表达。

碱性磷酸酶是一种细胞膜相关的酶，出现于成骨分化早期，被广泛认为是成骨分化早期的标志物^[29]，也是成骨细胞功能标志物，在成骨细胞早期就有丰富的碱性磷酸酶表达，基质成熟期达到高峰^[30]。碱性磷酸酶可以通过水解的方式将化合物状的磷酸盐分解成游离状的磷酸盐，再与细胞中的Ca²⁺结合形成Ca₃(PO₄)₂，沉积在基质中形成骨组织^[31]。碱性磷酸酶的表达量高低代表成骨细胞的分化程度，分化好的成骨细胞碱性磷酸酶呈高表达，碱性磷酸酶的表达量随着矿化期的到来逐渐降低^[32]。实验中骨髓间充质干细胞在成骨诱导14 d后行碱性磷酸酶染色，胞核被染成蓝色，表明碱性磷酸酶呈阳性表达。PCR结果显示3种复合材料在骨髓间充质干细胞向成骨分化过程中可以促进碱性磷酸酶的表达。

Ⅰ型胶原是骨基质中最丰富的蛋白，它组成了基质中90%的有机成分，在成骨细胞的增殖期就可以被检测到Ⅰ型胶原mRNA的高表达^[33]；与碱性磷酸酶一样，Ⅰ型胶原也是代表成骨细胞分化的早期标志物，为基质成熟与矿化必不可少的物质^[34]，在细胞增殖期起主要作用，可以促进成骨细胞表型的分化^[3]。实验结果表明锻烧骨/壳聚糖复合材料可以增加骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导过程中Ⅰ型胶原表达，促进骨髓间充质干细胞成骨分化。

骨钙素是成骨分化晚期(基质矿化期)标志物，是成骨细胞成熟才分泌的一种蛋白，属于非胶原蛋白，出现在成骨分化晚期，参与控制基质矿化过程^[35-36]。HIGUCHI等^[37]认为骨钙素能够调节基质矿化的速度和方向，属于成骨细胞独一无二的特异性生化指标。FRANCESCHI等^[38]研究认为骨钙素在成骨分化的10-15 d便可以检测到，25-30 d骨钙素的表达即达到高峰。实验结果表明，锻烧骨/壳聚糖复合材料可以增加成骨分化过程中骨钙素的表达，从而促进骨基质的矿化。

总之，锻烧骨/壳聚糖复合材料与骨髓间充质干细胞具有较好的生物相容性，锻烧骨/壳聚糖复合材料具有促进大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的作用。前期的研究已经证实，该复合材料的理化性能优良、生物安全性可靠，可望成为一种具有发展潜力的新型骨移植材料应用到口腔种植骨增量中。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

文题释义：

锻烧骨：是经高温锻烧处理动物骨所获得的无机材料，主要成分是羟基磷灰石，钙磷比接近于人骨，与人工合成羟基磷灰石相比，煅烧骨保留了天然骨的孔隙率、孔径大小、孔隙贯通等结构特点，而且制作成本低、方法简单。然而，锻烧骨由于高温处理使其失去了有机相的胶原，其力学强度下降，脆性增加，多数情况下只能作为充填材料用于拔牙窝位点保存，对于牙槽骨骨量严重不足的种植病例其应用受到限制。

壳聚糖：是一类重要的碱性天然多糖，无毒、具有良好的生物相容性，生物可降解，能够增强前体骨细胞的分化，促进骨的形成。然而，单一组分的壳聚糖由于缺乏骨组织的无机结构，没有骨键合的生物活性，不能直接用于骨组织修复，所以通常被用作辅助材料与其他骨移植材料复合，从而使两种材料达到优势互补的生物性能，更好地满足骨移植材料的要求。

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人体骨具备复杂的结构、拥有独特的理化性能和生物学性能，成分单一的骨移植材料无法达到这一要求，而复合材料既能发挥原组成材料的主要优势，又能克服自身弊端，从而获得新的优越性能，因此复合材料的研究已经成为目前的研究热点。该实验通过高温煅烧牛骨的方法得到煅烧骨，并将煅烧骨与壳聚糖复合得到一种新的复合材料，这种复合材料在组成结构和力学性能等方面模拟人体天然骨，通过前期对材料的理化性能、力学性能、细胞毒性及生物相容性进行体外研究，证实该材料具备了作为骨移植材料的基本要求，为后期的动物体内实验打下坚实基础，有望为口腔种植中的骨移植材料提供一种新的选择。

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