人骨髓间充质干细胞复合人脐静脉内皮细胞构建预血管化成骨细胞膜片

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2129

中国组织工程研究 ›› 2020, Vol. 24 ›› Issue (31): 4934-4940.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2129

• 骨髓干细胞 bone marrow stem cells • 上一篇下一篇

人骨髓间充质干细胞复合人脐静脉内皮细胞构建预血管化成骨细胞膜片

陈佳1，杨艺强1，胡晨1，陈琦1，赵恬1，雍敏1，马东洋2，任利玲3

1宁夏医科大学总医院口腔医院，宁夏回族自治区银川市 750004；2中国人民解放军联勤保障部队第940医院口腔颌面外科，甘肃省兰州市 730052；3兰州大学口腔医学院, 甘肃省兰州市 730000

收稿日期:2020-02-24 修回日期:2020-02-29 接受日期:2020-04-03 出版日期:2020-11-08 发布日期:2020-09-03
通讯作者: 马东洋，博士，副教授，中国人民解放军联勤保障部队第940医院口腔颌面外科，甘肃省兰州市 730052 任利玲，博士，教授，兰州大学口腔医学院, 甘肃省兰州市 730000
作者简介:陈佳，女，1989年生，2015年兰州大学口腔医学院毕业，硕士，主治医师，主要从事组织工程方面的研究。杨艺强，男，1987年生，2014年兰州大学口腔医学院毕业，硕士，主治医师，主要从事正畸牙周组织改建及植骨区牙移动方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81670969)

Fabrication of prevascularized osteogenic differentiated cell sheet based on human bone marrow mesenchymal stem cells and human umbilical vein endothelial cells

Chen Jia1, Yang Yiqiang1, Hu Chen1, Chen Qi1, Zhao Tian1, Yong Min1, Ma Dongyang2, Ren Liling3

1Stomatology Hospital of General Hospital, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China; 2Department of Craniomaxillofacial Surgery, The 940th Hospital of Joint Logistics Support Force of Chinese PLA, Lanzhou 730052, Gansu Province, China; 3School of Stomatology, Lanzhou University, Lanzhou 730000, Gansu Province, China

Received:2020-02-24 Revised:2020-02-29 Accepted:2020-04-03 Online:2020-11-08 Published:2020-09-03
Contact: Ma Dongyang, MD, PhD, Associate professor, Department of Craniomaxillofacial Surgery, The 940th Hospital of Joint Logistics Support Force of Chinese PLA, Lanzhou 730052, Gansu Province, China Ren Liling, MD, PhD, Professor, School of Stomatology, Lanzhou University, Lanzhou 730000, Gansu Province, China
About author:Chen Jia, Master, Attending physician, Stomatology Hospital of General Hospital, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China Yang Yiqiang, Master， Attending physician, Stomatology Hospital of General Hospital, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81670969 (to MDY)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

预血管化：在三维条件下通过将血管内皮细胞与其他类型的细胞体外共培养获得毛细血管网状结构，植入体内后预先形成的这些毛细血管网能够与宿主的血管网吻合，从而保证了移植组织的成活率。

细胞膜片：是指将细胞高密度接种并连续培养在培养皿底壁形成的片层状结构。

背景：如何使工程化骨组织移植后能够成活并发挥功能，前提条件是必须含有充足有效的血液供应，而这也正是工程化组织应用于临床的主要障碍之一。

目的：探索新的体外构建血管网络的方法以解决工程化骨组织预血管化的问题。

方法：人骨髓间充质干细胞以9×10⁴/cm²高密度接种，经成骨诱导连续培养14 d形成细胞膜片，镜下观察细胞形貌，并进行碱性磷酸酶染色和茜素红染色。然后将培养的人脐静脉内皮细胞以5×10⁴/cm²密度接种到上述细胞膜片上，继续培养至7 d。通过镜下观察、CD31免疫荧光染色、Ⅰ型胶原免疫荧光染色评估血管网形成情况及膜片特性。

结果与结论：①经连续培养可获得完整的成骨诱导细胞膜片，茜素红染色和碱性磷酸酶染色呈阳性；②倒置相差显微镜观察发现人脐静脉内皮细胞接种在成骨诱导细胞膜片上逐渐重排，CD31染色显示进行性管腔形成；③接种人脐静脉内皮细胞后构建的预血管化成骨诱导细胞膜片Ⅰ型胶原染色阳性；④结果表明，经成骨诱导后可形成具有成骨特性的细胞膜片，将人脐静脉内皮细胞培养在该膜片上可体外形成预血管化成骨细胞膜片，为优化构建预血管化的骨组织提供了新的理论指导。

ORCID: 0000-0002-2745-9466(陈佳)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 骨髓间充质干细胞, 预血管化, 细胞膜片, 血管内皮细胞, 成骨, 共培养, 血管网, 实验

Abstract:

BACKGROUND: How to make the engineered bone tissues survive and function after transplantation, the precondition is to have sufficient and effective blood supply, which is one of the main obstacles in the clinical application of the engineered bone tissue.

OBJECTIVE: To explore a new method to acquire vascular networks in vitro to realize vascularized engineered bone tissues.

METHODS: Human bone marrow mesenchymal stem cells were cultured on a cell culture dish at a high density 9×10⁴/cm² for 14 days to form a thick cell sheet. The morphology of the cells was observed under a microscope and cells were stained with alkaline phosphatase and alizarin red. The human umbilical vein endothelial cells at 5×10⁴/cm² were seeded onto the surface of human bone marrow mesenchymal stem cells sheet for 7 days. The formation of vascular network and the characteristics of the sheet were evaluated by microscopic observation, CD31 immunofluorescence staining and type I collagen immunofluorescence staining.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) Human bone marrow mesenchymal stem cells proliferated fast and formed an intact sheet, and the sheet cultured in osteogenic-induced medium showed positive staining of alkaline phosphatase and alizarin red. (2) Inverted phase contrast microscope showed that human umbilical vein endothelial cells migrated and aligned arrangement on the osteogenic differentiated cell sheet. The immunofluorescent images for CD31 revealed a progressive process of lumen formation. (3) Positive type I collagen was observed in the pre-vascularized osteogenic differentiated cell sheet. (4) These results indicate that the osteogenic differentiated cell sheet can be formed by continuously culturing. The prevascularizing method using coculture model of culturing endothelial cells onto an osteogenic differentiated cell sheet provides a theoretical guidance for optimizing the construction of prevascularized bone tissue.

Key words: stem cells, bone marrow mescenchyal stem cells, pre-vascularization, cell sheet, vascular endothelial cells, osteogenesis, co-culture, vascularized networks, experiment

中图分类号:

陈佳, 杨艺强, 胡晨, 陈琦, 赵恬, 雍敏, 马东洋, 任利玲. 人骨髓间充质干细胞复合人脐静脉内皮细胞构建预血管化成骨细胞膜片[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(31): 4934-4940.

Chen Jia, Yang Yiqiang, Hu Chen, Chen Qi, Zhao Tian, Yong Min, Ma Dongyang, Ren Liling. Fabrication of prevascularized osteogenic differentiated cell sheet based on human bone marrow mesenchymal stem cells and human umbilical vein endothelial cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2020, 24(31): 4934-4940.

图/表（结果） 5

2.1 人骨髓间充质干细胞膜片表征人骨髓间充质干细胞高密度接种后连续培养2周，培养皿底可见呈现乳白色半透明的薄膜样物质，见图1A，将该膜状物夹起后自然收缩，具有一定弹性，见图1B。镜下观察显示，高密度接种的人骨髓间充质干细胞迅速融合，5 d后细胞融合并持续生长形成致密的细胞膜片；继续培养，单个细胞形态消失，细胞逐渐融合成片，成骨诱导细胞膜片钙盐逐渐沉积，11-14 d时可见白色的矿化结节形成，见图1C。碱性磷酸酶染色发现，成骨诱导细胞膜片内有较多的大小不等的橘黄色沉淀，见图1E，茜素红染色发现数个大小不一的深红色结节，见图1G，而未分化对照组膜片碱性磷酸酶染色和茜素红染色均呈阴性，见图1F，H。

2.2 内皮血管网的形成人骨髓间充质干细胞以9×10⁴/cm²密度接种后第2天即迅速融合，经过14 d的连续培养及成骨诱导形成均匀致密的成骨诱导细胞膜片，见图2A，而人脐静脉内皮细胞膜片则成“铺路石”样排列，见图2B。将人脐静脉内皮细胞以5×10⁴/cm²密度种在上述成骨诱导细胞膜片上，倒置显微镜下观察细胞形貌变化， 0 h时膜片未见明显变化，见图2C，3 d时人脐静脉内皮细胞逐渐发生迁移，排列变得有序，并且膜片中的细胞外基质随之发生重排, 可以观察到膜片上有整齐的微槽结构出现，见图2D；随培养时间的延长，人脐静脉内皮细胞进一步迁移，微槽结构也更加典型，见图2E，并开始形成小的空泡样结构，见图2F。

2.3 进行性管腔的形成倒置相差荧光显微镜下观察成骨诱导细胞膜片接种人脐静脉内皮细胞(5×10⁴/cm²密度)后血管网络结构的进行性形成过程。接种0 h时，内皮细胞呈单个的、形似带足突的圆形，见图3A；接种2 h后，内皮细胞逐渐开始变得细长，见图3B；接种24 h时，人脐静脉内皮细胞在膜片上发生迁移，排列变得有序，见图3C；随时间延长，人脐静脉内皮细胞进一步发生迁移，到第3天时内皮细胞之间互相连接、局部融合，并形成小的空泡样结构，见图3D；接种第7天时，可见细长的分支和细胞间管腔样结构，见图3F。然而, 在培养皿内单纯培养24 h的人脐静脉内皮细胞组则表现出内皮细胞“铺路石样”随机排列，并未发现有类似的改变，见图3G。

2.4 CD31免疫荧光染色结果 CD31免疫荧光染色检测显示成骨诱导细胞膜片接种人脐静脉内皮细胞后2，24 h以及3，7 d时进行性管腔的形成过程。接种人脐静脉内皮细胞至成骨诱导细胞膜片2 h时，人脐静脉内皮细胞变得细长，见图4A；24 h后，人脐静脉内皮细胞在成骨诱导细胞膜片上发生迁移并动态排列，见图4B；培养至3 d时，人脐静脉内皮细胞发生融合，形成空泡样结构，见图4C，此时形成的管腔样结构数量达最大，见图4I；随时间延长，更多的人脐静脉内皮细胞延长并且动态排列；培养至7 d时，一些空泡开始聚集，见图4D，形成的管腔样结构数量反而下降(P < 0.05)。单纯的成骨诱导细胞膜片(未接种人脐静脉内皮细胞)CD31表达阴性，见图4G；单纯在培养皿内的人脐静脉内皮细胞CD31表达阳性，但是该内皮细胞随机排列，无管网状结构形成，见图4H。

2.5 预血管化成骨诱导细胞膜片Ⅰ型胶原改建为进一步证实构建的预血管化膜片仍具有成骨特性，人脐静脉内皮细胞在成骨诱导细胞膜片上培养7 d进行Ⅰ型胶原免疫荧光染色。结果显示单纯成骨诱导细胞膜片、复合内皮细胞后构建的预血管化成骨诱导细胞膜片细胞外基质中均检测到了Ⅰ型胶原的存在，见图5。接种内皮细胞7 d后，成骨诱导细胞膜片中的Ⅰ型胶原改建，出现了明显的空泡样结构，见图5D，F，而单纯成骨诱导细胞膜片组(未接种人脐静脉内皮细胞)未观察到此变化，见图5A，C。

参考文献

[1] NAKANO K, MURATA K, OMOKAWA S, et al. Promotion of Osteogenesis and Angiogenesis in Vascularized Tissue-Engineered Bone Using Osteogenic Matrix Cell Sheets. Plast Reconstr Surg. 2016; 137(5):1476-1484.

[2] MAIA FR, CARVALHO MR, OLIVEIRA JM, et al. Tissue Engineering Strategies for Osteochondral Repair. Adv Exp Med Biol. 2018;1059: 353-371.

[3] BOYCE ST, LALLEY AL. Tissue engineering of skin and regenerative medicine for wound care. Burns Trauma. 2018;6:4.

[4] ASAKAWA N, SHIMIZU T, TSUDA Y, et al. Pre-vascularization of in vitro three-dimensional tissues created by cell sheet engineering. Biomaterials. 2010;31(14):3903-3909.

[5] 周震,王亚敏,任飞,等.骨髓间充质干细胞膜片和脐静脉内皮细胞共培养模型的构建及鉴定[J].中国组织工程研究,2019,23(25): 3951-3955.

[6] LIU X, ZHANG G, HOU C, et al. Vascularized bone tissue formation induced by fiber-reinforced scaffolds cultured with osteoblasts and endothelial cells. Biomed Res Int. 2013;2013:854917.

[7] ANDERSON SM, SIEGMAN SN, SEGURA T. The effect of vascular endothelial growth factor (VEGF) presentation within fibrin matrices on endothelial cell branching. Biomaterials. 2011;32(30):7432-7443.

[8] KOKEMUELLER H, SPALTHOFF S, NOLFF M, et al. Prefabrication of vascularized bioartificial bone grafts in vivo for segmental mandibular reconstruction: experimental pilot study in sheep and first clinical application. Int J Oral Maxillofac Surg. 2010;39(4):379-387.

[9] CHEN W, THEIN-HAN W, WEIR MD, et al. Prevascularization of biofunctional calcium phosphate cement for dental and craniofacial repairs. Dent Mater. 2014;30(5):535-544.

[10] DILLEY RJ, MORRISON WA. Vascularisation to improve translational potential of tissue engineering systems for cardiac repair. Int J Biochem Cell Biol. 2014;56:38-46.

[11] YUAN X, TSAI AC, FARRANCE I, et al. Aggregation of Culture Expanded Human Mesenchymal Stem Cells in Microcarrier-based Bioreactor. Biochem Eng J. 2018;131:39-46.

[12] FU WL, XIANG Z, HUANG FG, et al. Coculture of peripheral blood-derived mesenchymal stem cells and endothelial progenitor cells on strontium-doped calcium polyphosphate scaffolds to generate vascularized engineered bone. Tissue Eng Part A. 2015;21(5-6): 948-959.

[13] HOLNTHONER W, HOHENEGGER K, HUSA AM, et al. Adipose-derived stem cells induce vascular tube formation of outgrowth endothelial cells in a fibrin matrix. J Tissue Eng Regen Med. 2015;9(2):127-136.

[14] GUREL PEKOZER G, TORUN KOSE G, HASIRCI V. Influence of co-culture on osteogenesis and angiogenesis of bone marrow mesenchymal stem cells and aortic endothelial cells. Microvasc Res. 2016;108:1-9.

[15] XING F, DUAN X, LIU M, et al. Construction and preliminary study on biological characteristics of composite cell sheets of mesenchymal stem cells and endothelial progenitor cells derived from peripheral blood. Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi. 2020;34(1): 109-115.

[16] OKANO T, YAMADA N, SAKAI H, et al. A novel recovery system for cultured cells using plasma-treated polystyrene dishes grafted with poly(N-isopropylacrylamide). J Biomed Mater Res. 1993;27(10): 1243-1251.

[17] KOBAYASHI J, KIKUCHI A, AOYAGI T, et al. Cell sheet tissue engineering: Cell sheet preparation, harvesting/manipulation, and transplantation. J Biomed Mater Res A. 2019;107(5):955-967.

[18] SATO M, YAMATO M, HAMAHASHI K, et al. Articular cartilage regeneration using cell sheet technology. Anat Rec (Hoboken). 2014;297(1):36-43.

[19] WANG C, HEI F, JU Z, et al. Differentiation of Urine-Derived Human Induced Pluripotent Stem Cells to Alveolar Type II Epithelial Cells. Cell Reprogram. 2016;18(1):30-36.

[20] GAO H, LI B, ZHAO L, et al. Influence of nanotopography on periodontal ligament stem cell functions and cell sheet based periodontal regeneration. Int J Nanomedicine. 2015;10:4009-4027.

[21] SASAGAWA T, SHIMIZU T, SEKIYA S, et al. Design of prevascularized three-dimensional cell-dense tissues using a cell sheet stacking manipulation technology. Biomaterials. 2010;31(7):1646-1654.

[22] MASUDA S, MATSUURA K, ANAZAWA M, et al. Formation of vascular network structures within cardiac cell sheets from mouse embryonic stem cells. Regen Ther. 2015;2:6-16.

[23] KADO M, TANAKA R, ARITA K, et al. Human peripheral blood mononuclear cells enriched in endothelial progenitor cells via quality and quantity controlled culture accelerate vascularization and wound healing in a porcine wound model. Cell Transplant. 2018;27(7): 1068-1079.

[24] YANG J, YAMATO M, SHIMIZU T, et al. Reconstruction of functional tissues with cell sheet engineering. Biomaterials. 2007;28(34): 5033-5043.

[25] SAWA Y, MIYAGAWA S, SAKAGUCHI T, et al. Tissue engineered myoblast sheets improved cardiac function sufficiently to discontinue LVAS in a patient with DCM: report of a case. Surg Today. 2012;42(2): 181-184.

[26] KARPOV AA, UDALOVA DV, PLISS MG, et al. Can the outcomes of mesenchymal stem cell-based therapy for myocardial infarction be improved? Providing weapons and armour to cells. Cell Prolif. 2017; 50(2):e12316.

[27] FAN Z, LIAO X, TIAN Y, et al. A prevascularized nerve conduit based on a stem cell sheet effectively promotes the repair of transected spinal cord injury. Acta Biomater. 2020;101:304-313.

[28] ZHANG H, LIU S, ZHU B, et al. Composite cell sheet for periodontal regeneration: crosstalk between different types of MSCs in cell sheet facilitates complex periodontal-like tissue regeneration. Stem Cell Res Ther. 2016;7(1):168.

[29] YAMAMOTO K, YAMATO M, MORINO T, et al. Middle ear mucosal regeneration by tissue-engineered cell sheet transplantation. NPJ Regen Med. 2017;2:6.

[30] ZHOU Y, CHEN F, HO ST, et al. Combined marrow stromal cell-sheet techniques and high-strength biodegradable composite scaffolds for engineered functional bone grafts. Biomaterials. 2007;28(5):814-824.

[31] CHEN F, ZHOU Y, BARNABAS ST, et al. Engineering tubular bone constructs. J Biomech. 2007;40 Suppl 1:S73-79.

[32] SYED-PICARD FN, LARKIN LM, SHAW CM, et al. Three-dimensional engineered bone from bone marrow stromal cells and their autogenous extracellular matrix. Tissue Eng Part A. 2009;15(1): 187-195.

[33] MA D, REN L, LIU Y, et al. Engineering scaffold-free bone tissue using bone marrow stromal cell sheets. J Orthop Res. 2010;28(5):697-702.

[34] MA D, REN L, YAO H, et al. Locally injection of cell sheet fragments enhances new bone formation in mandibular distraction osteogenesis: a rabbit model. J Orthop Res. 2013;31(7):1082-1088.

[35] ZHANG R, GAO Z, GENG W, et al. Engineering vascularized bone graft with osteogenic and angiogenic lineage differentiated bone marrow mesenchymal stem cells. Artif Organs. 2012;36(12): 1036-1046.

[36] TSIGKOU O, POMERANTSEVA I, SPENCER JA, et al. Engineered vascularized bone grafts. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010;107(8): 3311-3316.

[37] BAJPAI VK, ANDREADIS ST. Stem cell sources for vascular tissue engineering and regeneration. Tissue Eng Part B Rev. 2012;18(5): 405-425.

[38] MASCARENHAS S, AVALOS B, ARDOIN SP. An update on stem cell transplantation in autoimmune rheumatologic disorders. Curr Allergy Asthma Rep. 2012;12(6):530-540.

[39] LIU Y, MING L, LUO H, et al. Integration of a calcined bovine bone and BMSC-sheet 3D scaffold and the promotion of bone regeneration in large defects. Biomaterials. 2013;34(38):9998-10006.

[40] MENDES LF, PIRRACO RP, SZYMCZYK W, et al. Perivascular-like cells contribute to the stability of the vascular network of osteogenic tissue formed from cell sheet-based constructs. PLoS One. 2012;7(7): e41051.

[41] STOPPATO M, STEVENS HY, CARLETTI E, et al. Influence of scaffold properties on the inter-relationship between human bone marrow derived stromal cells and endothelial cells in pro-osteogenic conditions. Acta Biomater. 2015;25:16-23.

[42] HUANG CC, PAN WY, TSENG MT, et al. Enhancement of cell adhesion, retention, and survival of HUVEC/cbMSC aggregates that are transplanted in ischemic tissues by concurrent delivery of an antioxidant for therapeutic angiogenesis. Biomaterials. 2016;74:53-63.

[43] NAGAMORI E, NGO TX, TAKEZAWA Y, et al. Network formation through active migration of human vascular endothelial cells in a multilayered skeletal myoblast sheet. Biomaterials. 2013;34(3): 662-668.

[44] REN L, KANG Y, BROWNE C, et al. Fabrication, vascularization and osteogenic properties of a novel synthetic biomimetic induced membrane for the treatment of large bone defects. Bone. 2014;64: 173-182.

[45] REN L, MA D, LIU B, et al. Preparation of three-dimensional vascularized MSC cell sheet constructs for tissue regeneration. Biomed Res Int. 2014;2014:301279.

[46] KINO-OKA M, NGO TX, NAGAMORI E, et al. Evaluation of vertical cell fluidity in a multilayered sheet of skeletal myoblasts. J Biosci Bioeng. 2012;113(1):128-131.

[47] GARCIA-CARDEÑA G, COMANDER J, ANDERSON KR, et al. Biomechanical activation of vascular endothelium as a determinant of its functional phenotype. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001;98(8):4478-4485.

[48] SOUCY PA, ROMER LH. Endothelial cell adhesion, signaling, and morphogenesis in fibroblast-derived matrix. Matrix Biol. 2009;28(5): 273-283.

[49] DEJANA E, LANGUINO LR, POLENTARUTTI N, et al. Interaction between fibrinogen and cultured endothelial cells. Induction of migration and specific binding. J Clin Invest. 1985;75(1):11-18.

[50] SENGER DR, PERRUZZI CA. Cell migration promoted by a potent GRGDS-containing thrombin-cleavage fragment of osteopontin. Biochim Biophys Acta. 1996;1314(1-2):13-24.

[51] SENGER DR, PERRUZZI CA, STREIT M, et al. The alpha(1)beta(1) and alpha(2)beta(1) integrins provide critical support for vascular endothelial growth factor signaling, endothelial cell migration, and tumor angiogenesis. Am J Pathol. 2002;160(1):195-204.

[52] CHEN J, ZHANG D, LI Q, et al. Effect of different cell sheet ECM microenvironment on the formation of vascular network. Tissue Cell. 2016;48(5):442-451.

[53] MALAVAL L, MODROWSKI D, GUPTA AK, et al. Cellular expression of bone-related proteins during in vitro osteogenesis in rat bone marrow stromal cell cultures. J Cell Physiol. 1994;158(3):555-572.

[54] PETERS K, SCHMIDT H, UNGER RE, et al. Software-supported image quantification of angiogenesis in an in vitro culture system: application to studies of biocompatibility. Biomaterials. 2002;23(16): 3413-3419.

[55] BOULETREAU PJ, WARREN SM, SPECTOR JA, et al. Hypoxia and VEGF up-regulate BMP-2 mRNA and protein expression in microvascular endothelial cells: implications for fracture healing. Plast Reconstr Surg. 2002;109(7):2384-2397.

引言

目前，大多数研究通过组织工程方法构建人工骨组织植入体内来修复由外伤、肿瘤或感染引起的大块骨缺损，其能够成活并发挥功能，前提条件是必须含有充足有效的血液供应，而这也正是工程化组织应用于临床的主要障碍之一^[1-3]。研究表明，由于营养弥散的距离有限(最大200 µm)，对于较厚较大的工程化组织移植物，往往会因为缺乏充足的血液供应而发生中心性坏死^[4]。如何使工程化骨组织获得充足有效的血液供应已逐渐受到学者们的广泛关注^[5-6]。近年来，大量研究表明预血管化方法可以实现工程化组织内的血管化。目前，国内外学者已创建了多种血管化的策略来促进血管网的建立，包括在支架材料中添加促血管形成生长因子(血管内皮生长因子、血小板衍生生长因子)^[7]、显微外科技术^[8]、支架材料的修饰与应用^[9-11]、细胞共培养技术^[12-15]。

近年来，基于细胞膜片技术来构建预血管化的组织，已逐渐成为血管构建的方向之一。细胞膜片技术是指将细胞高密度接种至温度反应性培养皿后，无需胰蛋白酶消化，以片层状方式获得完整的细胞-细胞外基质复合体的新技术^[16-20]。许多研究已证实基于细胞膜片技术的预血管化系统对于体外三维组织内皮血管网的形成是有利的^[4，21-22]。众多学者应用细胞膜片技术已成功构建出血管化的软组织，用于修复皮肤、黏膜、心肌组织、脊髓损伤、牙周组织、中耳黏膜组织等^[21，23-29]，而更多学者逐渐将研究焦点转向于应用该技术构建血管化的硬组织。ZHOU等^[30]学者于2007年首次报道将成骨诱导骨髓间充质干细胞膜片与外源性磷酸三钙-聚已酸内酯材料复合构建出工程化骨组织，经检测证实有新骨的形成。还有学者进一步证实各种类型细胞膜片与不同支架材料结合可以构建工程化骨组织用以修复骨缺损^[31]。2008年，SYED-PICARD等^[32]首次证实无需外源性支架材料，单纯应用成骨分化细胞膜片构建工程化骨组织的可行性。MA等^[33]通过研究证实骨髓间充质干细胞膜片具有良好的体内成骨能力，无需添加支架材料就可用于构建较大体积的工程化骨组织。然而，基于上述方法构建的工程化骨组织植入体内后发现其内部的成骨量较少，很可能是由于移植物缺乏充足有效的血液供应，很难用于大段骨缺损的修复^[31，34]。为进一步构建血供充足的骨组织，有学者将内皮祖细胞与成骨细胞膜片复合，折叠、卷曲成圆柱状复合物，移植于裸鼠背部皮下，4，8周后均发现有外观色红、质硬的血管化骨样组织形成^[35]。虽然对血管化问题有所解决，但是通过上述方法构建的血管网络常常易退化。因而目前阶段研究的焦点集中在如何为构建的骨组织建立稳定成熟的血管系统。

已有研究表明，骨髓间充质干细胞作为多能干细胞，既具有来源广泛、可体外大量扩增、免疫排斥反应低等特性，又具有向成骨细胞、内皮细胞诱导分化的潜能, 同时可作为血管周细胞与内皮细胞混合培养，对于形成成熟的血管系统是有利的^[36-39]，在基于细胞膜片构建的骨样组织中可以维持血管网络的稳定性^[40]，是构建细胞膜片较为理想的种子细胞来源。血管内皮细胞与成骨细胞之间的关联可能通过调节血管形成以及骨形成细胞的分化从而调节骨代谢^[41-42]。但是，将骨髓间充质干细胞不传代进行连续培养形成细胞膜片后是否仍然具有成骨分化的潜能，对于能否成功构建工程化骨组织相当重要。

该研究将人脐静脉内皮细胞均匀接种在预先培养的成骨诱导骨髓间充质干细胞膜片上，拟在体外构建具有成熟稳定的预血管化网络结构的成骨诱导细胞膜片，进而观察此种模式下人脐静脉内皮细胞的血管网形成潜力以及二者的相互作用关系，以期为优化构建三维预血管化骨组织奠定实验基础。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学实验。

1.2 时间及地点 2018年6月至2019年5月在兰州大学基础医学院实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验细胞人骨髓间充质干细胞购自广州Cyagen生物科技公司，已证明超过90%细胞表达CD105、CD29和CD44，不表达CD34和CD45。绿色荧光蛋白标记的人脐静脉血内皮细胞购自美国波士顿Angio-Proteomie公司。

1.3.2 实验试剂与仪器 DMEM完全培养液、胎牛血清(南美Hylone公司)；内皮细胞生长介质、内皮细胞培养液(美国Lonza公司)；地塞米松、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠(Sigma公司)；L-谷氨酰胺、茜素红(北京达科为生物技术有限公司)；碱性磷酸酶试剂盒(南京建成生物公司)；鼠抗人血小板内皮细胞黏附因子CD31单克隆抗体(ab9498，Abcam公司)；鼠抗人Collagen-1单抗(ab90395，Abcam公司)；Alexa Fluor^® 594标记山羊抗鼠二抗ZF-0513(北京中杉金桥生物公司)；DAPI染色液(碧云天生物技术研究所)；培养瓶、培养皿、6孔板(美国Corning公司)；倒置相差显微镜(日本Olympus)。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞培养人骨髓间充质干细胞培养在含体积分数为10%胎牛血清和1%古洛糖醛酸-青霉素-链霉素的低糖未分化DMEM基础培养液中。绿色荧光蛋白标记的人脐静脉血内皮细胞培养在含体积分数为10%胎牛血清和内皮细胞生长介质的内皮细胞培养液中，每3 d更换1次培养液。所有细胞均置于37 ℃恒温培养箱中培养。倒置显微镜下观察细胞的生长状态，直到细胞扩增达80%-90%融合度时进行传代，所得细胞用于下列实验。

1.4.2 成骨诱导细胞膜片的构建将培养的骨髓间充质干细胞以9×10⁴/cm²的细胞密度均匀接种到预先加入适量完全培养液的直径6 cm培养皿内，1 d后加入低糖-DMEM完全培养液继续培养，隔天待细胞长满后更换为含成骨诱导剂(10^-7 mol/L地塞米松，50 mg/L抗坏血酸，10 mmol/L β-甘油磷酸钠)的高糖-DMEM完全培养液，继续静置培养，每隔3 d进行1次全量细胞换液(含成骨诱导剂的高糖- DMEM完全培养液)，细胞连续培养14 d而不进行传代操作，可见培养皿底壁形成半透明薄片状物质。采用含抗坏血酸(50 mg/L)的高糖-DEME完全培养液同法培养14 d获取细胞膜片作为对照组。任意选取收获的两组膜片，分别用茜素红染色和碱性磷酸酶染色对其矿化性能进行检测，镜下观察并拍照记录染色情况。

1.4.3 预血管化成骨诱导细胞膜片的构建镜下观察在内皮细胞培养液中培养的人脐静脉内皮细胞，当细胞融合达80%-90%时，加入0.25%胰蛋白酶消化，将消化后收集的人脐静脉内皮细胞悬液，以5×10⁴/cm²的细胞密度接种在上述成骨诱导细胞膜片上，并培养在内皮细胞培养液中，每3 d换液1次。单纯成骨诱导细胞膜片和单纯人脐静脉内皮细胞作为对照组，每组重复3次。倒置相差显微镜下观察细胞及膜片的形态。

1.4.4 免疫荧光染色人脐静脉内皮细胞以5×10⁴/cm² 的细胞密度均匀接种到预先培养好的成骨诱导细胞膜片上，在0，2 h以及1，3，5，7 d时，倒置相差荧光显微镜下观察成骨诱导细胞膜片接种人脐静脉内皮细胞后血管网络结构的进行性形成过程。在2，24 h以及3，7 d进行血小板内皮细胞黏附因子CD31进行免疫荧光染色，观察血管网形成情况。在7 d时，分别对单纯成骨诱导细胞膜片及接种人脐静脉内皮细胞构建的预血管化成骨诱导细胞膜片进行Ⅰ型胶原免疫荧光染色。

按如下方法进行染色：人脐静脉内皮细胞或成骨诱导细胞膜片用磷酸盐缓冲液冲洗3次，每次5 min，然后室温下加入40 g/L多聚甲醛溶液固定30 min，去除多聚甲醛，磷酸盐缓冲液冲洗3次，加入适量体积分数为10%山羊血清室温下封闭膜片1 h，磷酸盐缓冲液洗3次，每次5 min，将鼠抗人CD31一抗(用1%BSA-PBS按1∶500比例稀释)、鼠抗人Ⅰ型胶原一抗(用1%BSA-PBS按1∶2 000比例稀释)加入6孔板内，放于4 ℃湿盒内静置孵育过夜，磷酸盐缓冲液冲洗3次，将山羊抗鼠二抗(Alexa Fluor^® 594标记，按 1∶300比例稀释)加入6孔板使膜片完全浸润，室温避光条件下孵育1 h，磷酸盐缓冲液漂洗3次，最后加入足够DAPI染色液进行胞核复染5 min，PBS冲洗，镜下观察并拍照。

1.5 主要观察指标细胞膜片形貌、免疫荧光染色图像、血管网络结构。

1.6 统计学分析选取在同一实验条件下及同一拍摄条件下获取的图片进行处理分析。通过SPSS 17.0软件计数图片中形成的管腔状结构的数目(n=5)。所得计量资料表示为x(_)±s，选用t 检验进行统计分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

该研究将人骨髓间充质干细胞连续培养2周并经成骨诱导，可以获得完整的成骨诱导细胞膜片，通过将人脐静脉内皮细胞与成骨诱导细胞膜片共培养，体外成功构建了具有预血管化网络结构的细胞膜片。实验结果证实，成骨诱导细胞膜片可以促进人脐静脉内皮细胞迁移、重排，进而形成血管样网络结构和微血管空腔。

2013年，NAGAMORI^[43]将人脐静脉内皮细胞接种到多层骨骼肌成肌细胞膜片上，发现人脐静脉内皮细胞从多层骨骼肌成肌细胞膜片底部逐渐向上迁移爬行，并最终在膜片的中层和顶部形成血管网状结构。课题组既往研究亦证实人骨髓间充质干细胞膜片为人脐静脉内皮细胞血管网在各个方向上的生长和迁移提供了三维微环境^[44-46]。该研究发现人脐静脉内皮细胞接种至成骨诱导细胞膜片之后，人脐静脉内皮细胞发生迁移、逐渐重排，并形成毛细血管样网络结构和微血管空腔样结构，显示了血管腔形成的进行性动态过程。然而，人脐静脉内皮细胞单独在培养皿表面培养而没有成骨诱导细胞膜片支持时，内皮细胞则呈“铺路石样”随机型分布，并无管网状、管腔样结构的发生。这个结果进一步说明血管网的形成和血管化的进程是由成骨诱导细胞膜片及其与人脐静脉内皮细胞的相互作用共同促进的。在此过程中有2个方面的作用，一方面是细胞与细胞之间，即人脐静脉内皮细胞和成骨诱导人骨髓间充质干细胞之间的相互作用；另一方面在于来源于成骨诱导人骨髓间充质干细胞的丰富细胞外基质为人脐静脉内皮细胞的增殖、迁移、重排进而相互融合形成血管网提供了适宜的微环境，即细胞外基质与人脐静脉内皮细胞之间的相互作用。GARCIA-CARDENA等^[47]学者认为内皮细胞有高度的可塑性，可对周围的微环境作出反应，而SOUCY等^[48]学者则认为细胞外基质对于内皮细胞的修饰在血管腔形成过程中起重要作用。此外，不同的细胞外基质成分均可以支持内皮细胞的迁移，例如纤维蛋白原^[49]、骨桥蛋白^[50]、α1β1和α2β1整合素^[5¹^]、Ⅰ型胶原蛋白等^[5²^]，且各自作用效果不同。骨髓间充质干细胞向成骨诱导分化过程中涉及包含Ⅰ型胶原(多达90%)、骨钙蛋白、碱性磷酸酶、纤维粘连蛋白、骨涎液蛋白等组分的细胞外基质的产生^[53]。该实验发现人脐静脉内皮细胞复合成骨诱导细胞膜片共培养后检测到了Ⅰ型胶原的存在，与此同时在血管化进程中Ⅰ型胶原中出现了空泡样结构，说明在此过程中Ⅰ型胶原发生了改建。还有研究证实，内皮细胞接种至Ⅰ型胶原、细胞基质胶等诱导型基质中时，内皮细胞迅速重组，在数小时之后便可以相互连接形成管腔样结构^[54]。在此过程中，主要是人脐静脉内皮细胞通过基质金属蛋白酶的水解作用，对细胞外基质进行了重排和修饰，在细胞外基质微环境中形成物理性空间(即空泡样结构)，为血管的形态发生、周细胞的募集以及基底膜基质的组装提供了条件。

研究表明，在血管内皮细胞和成骨细胞共培养过程中发现了大量具有调控作用的细胞因子，包括血管内皮生长因子、血小板衍生因子、转化生长因子β1、转化生长因子β2、成纤维细胞生长因子2、骨形成蛋白2、表皮生长因子和骨保护素等^[55]。骨髓间充质干细胞与血管内皮细胞混合后培养，具有周细胞的功能，有利于成熟血管系统的建立^[36-37]，并且在基于细胞膜片构建的骨样组织中可以维持血管网络的稳定性^[40]。课题组既往研究发现，来源于成骨诱导细胞膜片和未分化人骨髓间充质干细胞膜片的细胞外基质中Ⅰ型胶原蛋白和纤维粘连蛋白含量不同，同时成骨诱导细胞膜片细胞外基质中Ⅰ型胶原蛋白的含量较高，可以显著促进内皮血管网的形成^[52]。基于此，实验选取未分化骨髓间充质干细胞进行成骨诱导获得细胞膜片，与单纯预血管化成骨细胞膜片或预血管化骨髓间充质干细胞膜片相比，接种人脐静脉内皮细胞后构建的预血管化成骨诱导细胞膜片既具有成骨细胞、内皮细胞共培养的双向调控机制，又叠加了周细胞的功能。与此同时，该细胞膜片仍具有成骨特性，此种策略对于建立血管化充足且更加成熟稳定的预血管化骨组织是有利的。

综上所述，利用人脐静脉内皮细胞与成骨诱导细胞膜片进行体外共培养，可以成功在体外构建预血管化的成骨细胞膜片，这种全新的预血管化膜片构建策略为骨组织的再生提供了新的思路。同时，所构建的预血管化成骨细胞膜片能够与其他类型的材料或者膜片结合，可体外构建三维立体的预血管化骨组织，为大块骨缺损的修复提供了新的途径。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

人骨髓间充质干细胞复合人脐静脉内皮细胞构建预血管化成骨细胞膜片

Fabrication of prevascularized osteogenic differentiated cell sheet based on human bone marrow mesenchymal stem cells and human umbilical vein endothelial cells

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 5

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	林清凡, 解一新, 陈婉清, 叶振忠, 陈幼芳. 人胎盘源间充质干细胞条件培养液可上调缺氧状态下BeWo细胞活力和紧密连接因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 4970-4975.
[2]	蒲锐, 陈子扬, 袁凌燕. 不同细胞来源外泌体保护心脏的特点与效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-.
[3]	张秀梅, 翟运开, 赵杰, 赵萌. 类器官模型国内外数据库近10年文献研究热点分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1249-1255.
[4]	王正东, 黄娜, 陈婧娴, 郑作兵, 胡鑫宇, 李梅, 苏晓, 苏学森, 颜南. 丁酸钠抑制氟中毒可诱导小胶质细胞活化及炎症因子表达增多[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1075-1080.
[5]	汪显耀, 关亚琳, 刘忠山. 提高间充质干细胞治疗难愈性创面的策略[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1081-1087.
[6]	万然, 史旭, 刘京松, 王岩松. 间充质干细胞分泌组治疗脊髓损伤的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1088-1095.
[7]	廖成成, 安家兴, 谭张雪, 王倩, 刘建国. 口腔鳞状细胞癌干细胞的治疗靶点及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1096-1103.
[8]	谢文佳, 夏天娇, 周卿云, 刘羽佳, 顾小萍. 小胶质细胞介导神经元损伤在神经退行性疾病中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1109-1115.
[9]	李珊珊, 郭笑霄, 尤冉, 杨秀芬, 赵露, 陈曦, 王艳玲. 感光细胞替代治疗视网膜变性疾病[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1116-1121.
[10]	焦慧, 张一宁, 宋雨晴, 林宇, 王秀丽. 乳腺癌类器官研究进展及临床应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1122-1128.
[11]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
[12]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.
[13]	孔德胜, 何晶晶, 冯宝峰, 郭瑞云, Asiamah Ernest Amponsah, 吕飞, 张舒涵, 张晓琳, 马隽, 崔慧先. 间充质干细胞修复大动物模型脊髓损伤疗效评价的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1142-1148.
[14]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.
[15]	史洋洋, 秦英飞, 吴福玲, 何潇, 张雪静. 胎盘间充质干细胞预处理预防小鼠毛细支气管炎[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 991-995.