脂肪来源干细胞向成骨分化及褪黑素干预细胞生物学活性的变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.50.007

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (50): 8072-8076.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.50.007

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脂肪来源干细胞向成骨分化及褪黑素干预细胞生物学活性的变化

路坦¹，尉娜²，张超¹，董玉珍¹

¹新乡医学院第一附属医院骨外科，河南省卫辉市 453100；²新乡医学院第三附属医院神经内二科，河南省新乡市 453003

收稿日期:2015-10-16 出版日期:2015-12-03 发布日期:2015-12-03
作者简介:路坦，男，1982年生，河南省林州市人，汉族，在读博士，主治医师，主要从事脊柱骨关节外科和组织工程研究。
基金资助:
2015年度新乡市科技发展计划项目(15SF27)

Osteogenic differentiation of adipose-derived stem cells and the effect of melatonin on the bio-viability of differentiated cells

Lu Tan¹, Wei Na², Zhang Chao¹, Dong Yu-zhen¹

¹Department of Orthopeadic Surgery, the First affiliated Hospital of Xinxiang Medical University, Weihui 453100, Henan Province, China; ²Second Department of Neurology, the Third Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University, Xinxiang 453003, Henan Province, China

Received:2015-10-16 Online:2015-12-03 Published:2015-12-03
About author:Lu Tan, Studying for doctorate, Attending physician, Department of Orthopeadic Surgery, the First affiliated Hospital of Xinxiang Medical University, Weihui 453100, Henan Province, China
Supported by:
Stem Cells; Adipose Tissue; Cell Differentiation; Osteoblasts; Melatonin; Tissue Engineering
Funding: the Scientific Development Plan of Xinxiang City in 2015, No. 15SF27

摘要/Abstract

摘要：

背景：研究表明褪黑素能促进脂肪来源干细胞向神经元转化，但对脂肪来源干细胞成骨分化后细胞的作用报道较少。
目的：观察脂肪来源干细胞向成骨分化及褪黑素对成骨分化后细胞生物学活性的影响。
方法：①取昆明种小鼠附睾处脂肪利用Ⅰ型胶原酶消化法和差速贴壁法获取、纯化脂肪来源干细胞，应用CD44免疫组化染色对细胞进行鉴定。②取第2代脂肪来源干细胞，加入成骨诱导培养基培养，行碱性磷酸酶染色和von Kossa法检测细胞分化情况。③取成骨诱导后的细胞，加入不同浓度的褪黑素，利用MTT法检测24，48 h时细胞增殖情况。④取成骨诱导后的细胞，加入最佳浓度的褪黑素，分别检测加入药物3，6 d时的碱性磷酸酶活性。
结果与结论：①接种48 h后大多数细胞贴壁，接种后4 d细胞呈现多种细胞形态，并形成大小不一的细胞集落，传代后的细胞形态趋于稳定，均称长梭型，培养细胞CD44呈阳性表达，阳性颗粒位于胞膜，呈棕黄色。②成骨诱导后的细胞应用von Kossa法染色呈阳性，黑色沉积物在细胞外的基质中呈网格状分布；碱性磷酸酶染色呈阳性，细胞内可见棕黑色颗粒。③在24 h和48 h时间点，1，10，100 μmol/L组的吸光度值明显大于空白组(P < 0.05)，选择这3个浓度作为最佳的褪黑素浓度。④各组成骨诱导后细胞内碱性磷酸酶活性随时间延长明显增加，差异有显著性意义(P < 0.05)。褪黑素组(1，10，100 μmol/L)在3 d时的碱性磷酸酶活性与空白组相比无明显差异(P > 0.05)，在6 d时较空白组明显增加(P < 0.05)。提示褪黑素可以增强脂肪来源干细胞成骨分化后细胞增殖，并提高细胞内碱性磷酸酶活性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 脂肪干细胞, 褪黑素, 脂肪来源干细胞, 成骨分化, 成骨细胞, 碱性磷酸酶

Abstract:

BACKGROUND: Studies have indicated that melatonin can promote the differentiation of adipose-derived stem cells into neurons, and the effect of melatonin on the osteoblasts form adipose-derived stem cells is rarely reported.
OBJECTIVE: To observe the osteogenic differentiation of adipose-derived stem cells and the effect of melatonin on the bio-viability of differentiated cells.
METHODS: (1) Adipose-derived stem cells were isolated and purified from the inguinal fat of Kunming mice by type I collagenase digestion and differential adhesion method, respectively. Immunohistochemical staining of CD44 was used as a quality control. (2) Osteogenic induction medium was added to induce osteogenic
differentiation of passage 2 adipose-derived stem cells. Alkaline phosphatase staining and von Kossa method were combined to evaluate differentiation condition. (3) Melatonin at variable concentrations was added to treat mature osteocytes originated from adipose-derived stem cells and MTT was applied to determine their viability at 24 and 48 hours after culture respectively to find out optimal condition of melatonin treatment. (4) Melatonin at the optimal concentration was used to treat differentiated cells and detect alkaline phosphatase activity after 3 days and 6 days respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) After seeding for 48 hours, most cells were adherent, and after 4 days, the cells displayed multiple shapes and colonies of different sizes formed. After subculture, cell morphology homogenized as spindle shape. Cells positive for CD44 were brownish yellow, and localized mainly on the cell membrane. (2) Differentiated cells were positive for von Kossa staining and black sediments scattered in the extracellular matrix. Alkaline phosphatase expressed positively, and brown-black particles, appeared within cells. (3) Melatonin supplement improved the viability of differentiated cells; and 1, 10 and 100 μmol/L was observed as the optimal concentrations both at 24 and 48 hours. (4) The intracellular alkaline phosphatatse activity was increased with time in all the groups (P < 0.05). Compared with the blank group, the intracellular alkaline phosphatase activity in Melatonin groups (1, 10 and
100 μmol/L) had no changes at 3 days, but significantly increased at 6 days (P < 0.05). These findings indicate that melatonin can enhance the proliferation of osteocytes differentiated from adipose-derived stem cells, and improve the activity of intracellular alkaline phosphatase.

中图分类号:

R394.2

路坦，尉娜，张超，董玉珍. 脂肪来源干细胞向成骨分化及褪黑素干预细胞生物学活性的变化[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(50): 8072-8076.

Lu Tan, Wei Na, Zhang Chao, Dong Yu-zhen. Osteogenic differentiation of adipose-derived stem cells and the effect of melatonin on the bio-viability of differentiated cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(50): 8072-8076.

图/表（结果） 6

2.1 实验流程图见图1。

2.2 脂肪来源干细胞体外分离培养刚分离的细胞镜下呈圆形，透亮，折光性强。接种48 h后全量换液，大多数细胞贴壁，部分细胞有点状突起(图2A)。接种后4 d，细胞增殖明显，并呈现多种细胞形态，细胞增殖形成大小不一的散在的细胞集落(图2B)。传代后的细胞形态趋于稳定，均呈长梭型，传代后的细胞增殖速度较快，四五天即可达到80%-90%的融合度(图2C)。

2.3 脂肪来源干细胞CD44免疫组化染色经CD44免疫细胞化学染色结果显示(图3)：阳性细胞胞膜中出现棕黄色
颗粒，胞核未呈显色，几乎所有细胞的胞浆呈黄褐色阳性染色，表明脂肪来源干细胞的纯度较高。

2.4 脂肪来源干细胞成骨诱导

2.4.1 Von Kossa法检测钙结节脂肪来源干细胞转化为成骨细胞后继续培养可使钙质沉积而形成钙化结节，应用von Kossa法染色呈现阳性：黑色沉积物在细胞外的基质中呈网格状分布，而对照组的阳性表现则较弱(图4A)。

2.4.2 碱性磷酸酶染色钙钴法检测碱性磷酸酶的表达情况，阳性表现为细胞内棕黑色颗粒。成骨诱导14 d后，90%以上的细胞都呈强阳性反应(图4B)。

2.5 不同浓度褪黑素对脂肪来源干细胞诱导成骨后细胞增殖的影响由表1可见，48 h时间点各组吸光度值较24 h有所增高，但差异无显著性意义(P > 0.05)，在24 h和48 h时间点，1，10，100 μmol/L浓度组的吸光度值明显大于空白组(P < 0.05)，说明在1，10，100 μmol/L浓度时褪黑素对成骨细胞的增殖强度最大，所以选用1，10，100 μmol/L作为实验最佳刺激浓度。

表1 不同浓度褪黑素在24，48 h成骨诱导后细胞吸光度值 (x(_)±s)

Table 1 Cell absorbance values after 24 and 48 hours of osteoinducion of adipose-derived stem cells in melatonin groups with different concentrations

2.6 最佳浓度褪黑素对脂肪来源干细胞诱导成骨后细胞碱性磷酸酶活性的影响由表2可见，各组脂肪来源干细胞诱导成骨后细胞内碱性磷酸酶活性随时间延长明显增加，差异有显著性意义(P < 0.05)。1，10，100 μmol/L浓度组在3 d时的碱性磷酸酶活性与空白组相比差异无显著性意义(P > 0.05)，在6 d时较空白组明显增加(P < 0.05)，说明褪黑素作用一定时间后能增强脂肪来源干细胞成骨诱导后细胞内碱性磷酸酶活性。

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引言

材料方法

1.1 设计细胞学体外实验。
1.2 时间及地点于2012年6月至2014年12月在新乡医学院第一附属医院组织工程实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物健康成年昆明种雄性小鼠54只，体质量27-35 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2006-0009。
1.3.2 实验试剂褪黑素(Sigma)；H-DMEM、L-DMEM(海克隆生物化学制品有限公司)；胎牛血清(天津市灏洋生物制品科技责任有限公司)；胰蛋白酶、地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠、多聚赖氨酸(Sigma)；免抗小鼠CD44抗体、SABC检测试剂盒和DAB显色试剂盒(武汉博士德公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 脂肪来源干细胞体外分离、培养[1] 成年雄性小鼠处死后浸泡于体积分数为75%乙醇中0.5 h，无菌获取附睾处脂肪，去除肉眼可见的纤维组织和血管并剪碎，加入0.075%Ⅰ型胶原酶，37 ℃水浴振荡消化1 h，1 300 r/min离心10 min。去除漂浮的脂肪层及消化液，无菌D-Hank’s液洗涤，1 300 r/min离心10 min，去上清，H-DMEM重悬，100目筛网过滤，细胞计数板调整细胞浓度为5×108 L-1，接种于25 cm2培养瓶内，差速贴壁法重复操作3次，以去除混杂的成纤维细胞，置于饱和湿度、体积分数为5%CO2、37 ℃孵箱内培养，24 h后首次换液，此后每3 d换液1次。每日在倒置显微镜下观察细胞生长情况。
1.4.2 脂肪来源干细胞CD44免疫组化染色取生长状态较好的第3代脂肪来源干细胞，加入0.25%胰酶消化， 1 100 r/min离心5 min后细胞重悬，将细胞浓度调整为1.5×109 L-1，从培养皿内取出细胞爬片，PBS冲洗后浸入纯丙酮室温固定90 min，再浸入内源性过氧化物酶灭活液室温30 min，随后滴加5%BSA封闭液，室温20 min(甩去多余液体，不洗)，滴加1∶100稀释的免抗小鼠CD44抗体(一抗)，37 ℃ 1.5 h，PBS冲洗后再滴加生物素化山羊抗免IgG(二抗)，37 ℃ 20 min。滴加试剂SABC，37 ℃ 20 min，PBS冲洗后滴加DAB显色液，避光显色，镜下控制显色时间，蒸馏水冲洗终止显色；常规脱水、透明，中性树胶封固。
1.4.3 脂肪来源干细胞向成骨诱导分化取生长状态较好的第3代脂肪来源干细胞，加入含成骨诱导液(抗坏血酸 50 mg/L，地塞米松10 nmol/L，β-甘油磷酸钠10 mmol/L)的培养基，继续培养，取成骨诱导后第2代细胞留作下一步实验。
1.4.4 脂肪来源干细胞诱导成骨后的鉴定
Von Kossa法检测：取成骨诱导分化14 d细胞爬片行Von Kossa染色，PBS冲洗，40 g/L多聚甲醛固定10 min，蒸馏水冲洗；加入5%硝酸银溶液1 mL，将培养板开盖在紫外灯下照射1 h，蒸馏水冲洗3遍。加入5%硫代硫酸钠溶液1 mL，中和残留的硝酸银溶液，吸出残液，室温下晾干，封固，显微镜下观察并照相。
碱性磷酸酶染色：取成骨诱导分化第2代细胞爬片行钙钴法碱性磷酸酶染色，浸入纯丙酮室温固定90 min，蒸馏水冲洗，浸入碱性磷酸酶孵育液中37 ℃作用60 min，蒸馏水漂洗数次，浸入2%硝酸钴溶液5 min，蒸馏水漂洗数次，再浸入1%硫化铵溶液5 min，蒸馏水漂洗数次，晾干，封固，显微镜下观察并照相。
1.4.5 褪黑素对脂肪来源干细胞诱导成骨后细胞生物学活性的影响
不同浓度褪黑素对脂肪来源干细胞诱导成骨后细胞增殖的影响：实验分为空白组、褪黑素处理组(0.1，1，10，100 μmol/L和1，10 mmol/L)，分别将脂肪来源干细胞成骨诱导后第2代细胞悬液以每孔5.0×106个细胞接种于96孔培养板中，然后每组按照既定的设计加入含不同浓度褪黑素的培养基培养(空白组仅加入培养液)，每组分别在24 h和48 h各选取8孔，根据MTT检测试剂盒逐步加入试剂，用酶标仪在550 nm波长处测定吸光度值。
最佳浓度褪黑素对脂肪来源干细胞诱导成骨后细胞碱性磷酸酶活性的影响：实验分为空白组和褪黑素处理组(由上述实验得出最佳浓度)。褪黑素处理组应用含褪黑素的培养液培养3，6 d，空白组用不含褪黑素的培养液培养，弃去各组培养液，D-Hank’s液冲洗3次，根据碱性磷酸酶活性测定试剂盒逐步加入试剂，用酶标仪在520 nm波长处测定吸光度值，即代表细胞碱性磷酸酶活性。
1.5 主要观察指标 ①脂肪来源干细胞的生物学形态。②免疫细胞化学染色检测CD44表达。③Von Kossa法染色、碱性磷酸酶染色鉴定脂肪来源干细胞成骨诱导分化能力。④MTT检测和碱性磷酸酶活性检测褪黑素对脂肪来源干细胞诱导成骨后细胞生物学活性的影响。
1.6 统计学分析实验结果采用SPSS 13.0统计学软件包进行处理，数据用x(_)±s表示，采用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。统计学处理由第二作者完成。

讨论

Zuk等^[1]最先在人类抽脂处理细胞中发现存在着具有多向分化潜能的成体干细胞，并命名为脂肪来源干细胞。国内梁笃等^[2]总结提出脂肪来源干细胞的鉴定方法需要满足以下几个条件：①首先来自脂肪组织，呈成纤维细胞相似的形态。②该细胞的生长曲线和倍增时间与干细胞接近。③通过对诱导分化的细胞进行鉴定，然后逆推得知原始细胞是否为干细胞。④细胞表面有间充质干细胞特异性分子抗原。有研究证实脂肪来源干细胞表面表达CD44，其表达率为95%以上^[3-5]，故实验采用CD44免疫组化法进行检测，发现培养的细胞CD44表达为阳性，结合细胞来源于脂肪，且成骨诱导后脂肪来源干细胞有较好成骨活性，证明分离培养的细胞是脂肪来源干细胞。
如何使脂肪来源干细胞成骨转化后增加成骨活性，提高临床上组织工程骨治疗骨缺损的效果。此次实验中选择褪黑素作为生物学因子，褪黑素是一种小分子肽类激素，主要由松果体分泌释放，具有参与多项生理功能，如调节昼夜节律变化，抗炎，调节免疫系统功能^[6]。目前研究人员发现青少年特发性脊柱侧弯和老年骨质疏松症中，褪黑素缺失是造成该疾病的重要原因^[7-10]，另外有些研究将褪黑素在不同条件下作用于成骨细胞，可以明显促进成骨细胞的增殖^[11-13]。然而对于间充质干细胞的影响仍存在争议，大多数研究人员认为褪黑素能促进间充质干细胞向神经系细胞分化，抑制成脂分化，减轻神经元的损伤，促进干细胞向神经元转化，促进神经修复^[14-15]。Zaminy等^[16]应用褪黑素作用于骨髓间充质干细胞和脂肪来源干细胞时发现，褪黑素对骨髓间充质干细胞有诱导成骨作用，对脂肪来源干细胞表现出阴性结果。而Sethi等^[17]研究发现21 d持续应用褪黑素可以通过MT2受体介导人间充质干细胞表现出较高的碱性磷酸酶活性和钙沉积。本实验将脂肪来源干细胞向成骨细胞分化后加入褪黑素进行作用，探讨褪黑素对间充质干细胞成骨后细胞生物学活性的空白影响。在实验过程中，选用0.1，1，10，100 μmol/L和1，10 mmol/L 6种不同的褪黑素浓度，与不加处理因素的空白组对比，发现褪黑素对脂肪来源干细胞活性的影响呈现一定的剂量依赖性，1，10， 100 μmol/L均能促进脂肪来源干细胞成骨后细胞增殖，在1 mmol/L和10 mmol/L浓度时出现下降趋势，出现这一现象的可能性可能是在这一剂量时受体达到饱和状态。
本实验选择碱性磷酸酶检测脂肪来源干细胞成骨分化后的生物学活性。碱性磷酸酶是成骨细胞所分泌的一种酶蛋白，其活性是成骨细胞分化的特异性标志，碱性磷酸酶活性越高，成骨细胞越趋成熟，间充质干细胞本身含碱性磷酸酶较少^[18]，通常用于细胞成骨分化的检测。实验观察到褪黑素刺激组在第3天碱性磷酸酶表达与空白组无明显差异，在作用第6天的碱性磷酸酶表达量明显高于空白组，说明一定浓度的褪黑素作用一段时间后能增强脂肪来源干细胞成骨诱导后细胞生物学活性，这与国外Zaminy等^[19]的结果相似。
通过实验发现脂肪来源干细胞能成功转化为成骨细胞，可以作为一种修复骨缺损的理想种子细胞应用于临床研究，褪黑素能明显增强脂肪来源干细胞转化为成骨细胞后的碱性磷酸酶活性，可以与脂肪来源干细胞共同构建组织工程骨治疗各种疾病引起的骨缺损症状，为临床治疗提供理论依据。

脂肪来源干细胞向成骨分化及褪黑素干预细胞生物学活性的变化

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