MicroRNA-17-92基因对胃癌干细胞更新和增殖的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.50.008

摘要/Abstract

摘要：

背景：研究表明，miRNA对肿瘤干细胞的更新分化有调节作用，有关miRNA-17-92在胃癌干细胞更新及增殖中的作用尚未完全阐明。
目的：分析miRNA-17-92在胃癌干细胞自我更新及增殖中的作用。
方法：①利用细胞培养使胃癌干细胞贴壁分化并送miRNA芯片检测，寻找并验证不断缺失的miRNA。②构建并转染miRNA-17-92分子慢病毒稳定转染细胞。③通过tumorsphere实验研究miRNA-17-92与胃癌细胞更新的关系。④通过MTT、平板克隆试验检测miRNA-17-92与胃癌干细胞增殖的关系。
结果与结论：①miR-19b/20a/92a在胃癌干细胞贴壁分化过程中表达逐渐减低。②慢病毒携带的miRNA-17-19基因在MKN28细胞和CD44-/EpCAM-细胞中的表达均明显增加；瞬时转染pre-miR-19b/20a/92a能使CD44-/EpCAM-和MKN28的miRNA表达增高，瞬时转染pre-miR-19b/20a/92a拮抗剂能使SGC7901和CD44+/EpCAM+的miRNA表达降低；过表达lenti-miR-19b/20a/92a能显著增加胃癌细胞形成肿瘤球的能力；在化疗药的作用下，lenti-miR-19b/20a/92a感染细胞的生存时间延长；瞬时转染pre-miR-19b/20a/92a 能够显著增加CD44+/EpCAM+细胞数，转染其拮抗剂可以降低CD44+/EpCAM+细胞数。③miR-19b/20a/92a稳定表达组的胃癌细胞增殖速度较对照组快。瞬间转染miR-19b/20a/92a前体组加快胃癌细胞的增殖速度，而瞬时转染其拮抗物组减慢胃癌细胞的增殖速度；瞬间转染 miR-19b/20a/92a前体组的克隆数较对照组多，而瞬时转染miR-19b/20a/92a拮抗物组的克隆数较对照组少。结果表明miR-19b/20a/92a基因在胃癌干细胞分化过程中不断缺失，miR-17-92基因能够促进胃癌干细胞的更新和增殖。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 肿瘤干细胞, 胃癌, miR-17-92, 增殖, 更新

Abstract:

BACKGROUND: Studies have shown that microRNAs (miRNAs) have moderating effect on the renewal and differentiation of cancer stem cells. However, there is no complete understanding on the effect of microRNA-17-92 gene on gastric cancer stem cell renewal and proliferation.
OBJECTIVE: To explore the effect of miRNA-17-92 in promoting self-renewal and proliferation of gastric cancer stem cells.
METHODS: (1) The gradually reduced miRNAs during gastric cancer stem cell self-renewal were investigated using miRNA array based on RNAs from differentiated and adherent cells. (2) The miRNA-17-92 was constructed and transfected to gastric cancer stem cells. (3) The effects of miRNA-17-92 on the self-renewal of gastric cancer stem cells were studied by tumor sphere assay in vitro. (4) The effects of miRNA-17-92 on the proliferation of
gastric cancer stem cells were investigated by MTT assay and colony formation assay.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) miR-19b/20a/92a expression gradually reduced in the adhesion and differentiation of gastric cancer stem cells. (2) The expression of lentivirus carrying miRNA-17-19 gene in MKN28 cells and CD44-/EpCAM- cells were significantly increased; transient transfection of pre-miR-19b/20a/92a increased the expression of CD44-/EpCAM- and MKN28 miRNA, transient transfection of pre-miR-19b/20a/92a antagonists reduced the expression of SGC7901 and CD44+/EpCAM+ miRNA; overexpression of lenti-miR-19b/20a/92a significantly increased the ability of gastric cells to form tumor spheres; chemotherapy drugs prolonged the survival time of lenti-miR-19b/20a/92a-infected cells; transient transfection of pre-miR-19b/20a/92a significantly increased the number of CD44+/EpCAM+ cells, but transfection of pre-miR-19b/20a/92a antagonist reduced the number of CD44+/EpCAM+ cells. (3) MTT proliferation assay showed that gastric cancer cell proliferation rate in miR-19b/20a/92a stably expressing group was faster than that in the control group. Transient transfection of miR-19b/20a/92a precursor accelerated the growth rate of gastric cancer cells, and transient transfection of its antagonist slowed down the growth rate of gastric cancer cells. Colony formation assay showed that transient transfection of miR-19b/20a/92a precursor significantly increased the colony formation number as compared with the control group; transient transfection of miR-19b/20a/92a antagonist reduced the colony formation as compared with the control group. These findings indicate that miR-19b/20a/92a gene presents with continuous deletion in gastric cancer stem cell differentiation process, and miRNA-17-92 gene can promote the renewal and proliferation of gastric cancer stem cells.

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 9

2.1 实验设计流程图见图1。

2.2 芯片的表达验证
2.2.1 miRNA芯片检验情况 miRNA-17-19基因簇成员miR-19b、miR-92a、miR-20a的表达随着肿瘤球的贴壁分化逐渐减低(表1)。

2.2.2 实时荧光定量PCR检测结果实时荧光定量PCR检测结果发现miRNA-17-19基因簇成员miR-19b、miR-92a、miR-20a在贴壁后表达不断下降，贴壁1 d后下降最明显。
2.3 miR-17-92对胃癌干细胞自我更新的作用
2.3.1 慢病毒的感染和表达慢病毒携带的miRNA- 17-19基因簇成员miR-19b、miR-92a、miR-20a在MKN28细胞和CD44-/EpCAM-细胞中的表达均明显增加，都增加10倍以上(图2和表2)。

2.3.2 瞬间转染表达瞬时转染miRNA的precursor或inhibitor能使CD44^-/EpCAM^-和MKN28的miRNA表达增高若干倍，能使SGC7901和CD44⁺/EpCAM⁺的miRNA的表达降低若干倍(表3，4)。

2.3.3 肿瘤球的形成实验过表达lenti-miR-19b/ 20a/92a能显著增加胃癌细胞形成肿瘤球的能力，lenti- miR-19b/20a/92a稳定表达的细胞形成的肿瘤球内细胞数量显著增高(表5)。

2.3.4 药敏实验在化疗药作用的第4天，lenti-miR-19b感染细胞的吸光值为0.82，lenti-miR-20a感染细胞的吸光值为0.74，lenti-miR-92a感染细胞的吸光值为0.90，对照组的细胞吸光值为0.57。表明在化疗药的作用下，lenti-miR-19b/20a/92a感染细胞的生存时间延长。
2.3.5 流式细胞术检测结果瞬时转染pre-miR-19b/ 20a/92a 能够显著增加CD44+/EpCAM+细胞数，转染其拮抗剂可以降低 CD44+/EpCAM+细胞数(表6)。

2.4 miR-17-92促进胃癌干细胞增殖的作用
2.4.1 慢病毒的感染和表达慢病毒携带的miRNA- 17-19基因簇成员miR-19b、miR-92a、miR-20a在MKN28细胞和CD44-/EpCAM-细胞中的表达均明显增加，都增加10倍以上(表7)。

2.4.2 瞬间转染表达瞬时转染miRNA的 precursor或inhibitor能使CD44-/EpCAM-和MKN28的miRNA表达增高若干倍，能使SGC7901和CD44+/EpCAM+的miRNA表达降低若干倍(表8，9)。

2.4.3 MTT增殖实验结果 miR-19b/20a/92a 稳定表达组的胃癌细胞增殖速度较对照组快。瞬间转染miR-19b/ 20a/92a前体组加快胃癌细胞的增殖速度，而瞬时转染其拮抗物组减慢胃癌细胞的增殖速度。
2.4.4 平板克隆形成实验结果稳定表达 miRNA 的平板克隆形成实验结果显示：miR-17-92 稳定表达细胞形成的克隆数显著高于对照组(表10)。瞬时转染 miRNA 后的平板克隆实验结果显示：瞬间转染 miR-19b/20a/92a前体组的克隆数较对照组多，而瞬时转染miR-19b/20a/92a拮抗物组的克隆数较对照组少。

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引言

材料方法

1.1 设计细胞学体外观察实验。
1.2 时间及地点实验于2014年4月至2015年4月在河北大学实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 细胞系胃癌细胞系MKN28购自解放军军事医学科学院，SGC7901细胞系购自中国科学院上海细胞库。CD44+/EpCAM+胃癌干细胞和CD44-/EpCAM-非胃癌干细胞是从SGC7901细胞系中经流式细胞仪分离得到。
1.3.2 主要试剂 RPMI1640培养基、Trizol、高糖 DMEM 培养基、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、低黏附细胞培养瓶(Invitrogen 公司)；无RNA 酶水、miRNA实时荧光定量 PCR探针、siPORTTMNeoFXTM转染试剂、miRNA 实时荧光定量PCR试剂盒、miRNA 模拟物和抑制物(Ambion公司)；0.05%胰蛋白酶(上海晶天生物科技有限公司)；Array-Pro图像分析软件(Media Cybernetics)；anti-EpCAM、anti-CD44 抗体(BD公司)；双荧光素酶报告基因检测试剂盒(Promega公司)等。
1.3.3 主要仪器 CO2培养箱(Forma Scientific公司)；超净工作台(苏州净化设备仪器厂)；实时荧光定量 PCR仪(罗氏公司)；显微镜(Olympus公司)；高温高压消毒装置(湖南湘雅仪器厂)；阳性克隆测序(美季生物技术)；激光扫描仪(GenePix 4000B，Molecular Device)；台式离心机(湖南湘雅仪器厂)；酶标仪(Bio-Rad公司)等。
1.4 实验方法
1.4.1 miRNA芯片表达和验证
胃癌干细胞培养：胃癌SGC7901和MKN28细胞系在RPMI 1640 培养液(含体积分数为10%胎牛血清)中，置于37 ℃，体积分数为5%CO2培养箱培养。将上述胃癌细胞系分别经胰酶消化、PBS洗涤，无血清DMEM培养基洗涤，然后取1 000个细胞置于低黏附培养瓶中用无血清高糖DMEM培养基(含表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子)培养；培养至第7天终止，在倒置显微镜下观察。
miRNA芯片细胞制备：将上述培养至第7天的肿瘤球细胞离心、洗涤，分别放入普通培养基和含胎牛血清的培养基中培养，消化收集培养8，24，72 h的贴壁细胞。
提取总RNA：将细胞消化、离心、洗涤，反复吹打摇匀后离心，取出上层水样层移至干净试管内，加入异丙醇摇匀离心10 min，移去上层悬液，乙醇沉淀，再离心。
基因芯片：总RNA通过微离心过滤柱分离得到小RNA。在其 3’端加上poly(A)尾巴，再与寡聚核苷酸标记相连。用含有甲酰胺的6xSSPE缓冲液进行杂交反应。杂交后用Cy5荧光染料监测。激光扫描仪采集图像、Array-Pro图像分析软件将图像进行数字化转换。
PCR检测：胰酶消化提取总RNA，在无RNA酶的EP管中进行反转录，将反转录产物进行实时荧光定量PCR反应。
1.4.2 miR-17-92促进胃癌干细胞自我更新作用
构建慢病毒稳定表达细胞：慢病毒载体Pgcsil-008 (kl1496)用NheⅠ进行酶切消化；合成引物；用PCR扩增的基因；制备感受态细胞；PCR产物交换入线性化慢病毒载体转化并克隆测序。将制好的细胞悬液进行细胞瞬间转染。
药物敏感实验：将稳定表达miRNA的细胞培养离心后制成单细胞悬液，用不含血清的DMEM培养基(含表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子)培养；培养第2天时加入5-氟尿嘧啶；加药第2天加入二甲基亚砜，培养后用酶标仪进行检测。
流式细胞术：离心收集瞬间转染细胞，PBS洗涤，加入20 μL抗体孵育，再用PBS洗涤后上机测试。
1.4.3 miR-17-92促进胃癌干细胞增殖的作用
MTT实验：将对数生长期细胞铺入细胞培养板培养(每孔1 000个细胞)，24 h后进行细胞瞬间转染，24 h后每天向孔内加入二甲基亚砜培养30 min-4 h，用酶标仪检测。
平板克隆形成实验：将100个细胞接种于6孔培养板中，培养至细胞形成典型集落，细胞固定、染色后倒置显微镜下计数细胞集落(包含50个细胞以上为1个集落)。
1.5 主要观察指标 ①miRNA芯片检验结果。②miRNA-17-19基因簇慢病毒的感染和表达。③胃癌干细胞肿瘤球形成情况。④miR-17-92对胃癌干细胞自我更新的影响。⑤miR-17-92对胃癌干细胞增殖的影响。
1.6 统计学分析使用 SPSS 18.0软件包，采用方差检验，或Mann-Whitney U和Kruskal-Wallis H检验。

讨论

恶性肿瘤组织是一个异质体，由处于不同分化阶段的细胞构成，而这些细胞中有少数具有更新分化潜能的干细胞样细胞，这些细胞称之为肿瘤干细胞。肿瘤干细胞存在的标准是肿瘤内带有特殊标志物的肿瘤细胞，这类肿瘤细胞可以在免疫缺陷鼠体内形成移植瘤^[1]。Han等^[2]将胃癌细胞进行培养并分离出带有特异标志物的胃癌细胞，将其植入鼠皮下形成肿瘤，表明胃癌干细胞是存在的。

胃癌干细胞可能来源于骨髓干细胞或胃干细胞：Quante等^[3]建立小鼠模型，发现骨髓来源的干细胞在胃黏膜处促使胃黏膜发生癌变；胃干细胞位于胃腺体峡部，胃干细胞突变可以形成肿瘤，Karam等^[4]的研究认为胃癌是由于胃癌干细胞的突变引起的。胃癌干细胞主要通过Wnt/β-catenin信号通路和Hedgehog信号通路进行分子调控。Wnts是一种分泌性糖蛋白，Wnt/β-catenin信号通路参与胃癌干细胞的分化增殖和凋亡，该信号通路异常可导致肿瘤的发生，Cai等^[5]的研究发现：抑制Wnt/β-catenin信号通路可抑制肿瘤的更新和增殖，反之，激活该通路可提高胃癌的更新增殖。Hedgehog信号通路在胚胎的发生过程中参与细胞的分化和器官形成的调节，Song等^[6]发现在Shh通路的抑制剂环巴胺及5E1的共同作用下，肿瘤干细胞的更新和抗化疗能力下降。另外BMP信号通路及Notch信号通路等也参与胃癌干细胞的调控，各种信号通路在胃癌的发生发展中具有不同的作用。各信号之间相互作用共同调控肿瘤的发生^[7]。

目前胃癌治疗效果不佳主要是由于部分胃癌干细胞逃避化疗药物的作用，成为胃癌复发和转移的主要原因之一^[8]。胃癌的靶向治疗给胃癌患者带来了新的希望，好的靶向治疗药物应该能抑制损伤胃癌干细胞而对正常细胞无影响。胃癌干细胞的标志物能否成为靶向治疗的靶点需进一步研究证实^[9-10]。Yashiro等^[11]发现抑制c-met基因能够增加胃癌干细胞对化疗的敏感性。胃癌干细胞与胃癌的预后也密切相关，有研究表明CD44⁺干细胞样细胞高表达可以预测生物学侵袭行为，也是胃癌疗效的独立预测因子^[12]，Golestaneh等^[13]发现胃癌干细胞在致瘤过程中mRNA表达水平有差异，这些mRNA参与癌症细胞的生物程序调控^[14-16]。

微小RNA(miRNA)是一种非编码小分子单链RNA，由核苷酸构成，没有开放性阅读框。动物基因组中有大量miRNA基因，多位于同一个多顺反子内，因此成为miRNA基因簇，作为一组致癌或者抑癌基因参与肿瘤的复发和转移。人类有300多个基因簇，miRNA-17-92基因簇是其中一种，因miRNA-17-92基因簇与哺乳动物的器官发育和肿瘤的发生相关，因此备受大家关注。miRNA-17-92基因簇是典型的高度保守基因簇，可产生miR-17，miR-18，miR-19a，miR-19b，miR-20和miR-92，具有复杂多样性^[17]。miRNA-17-92基因簇参与免疫系统、心肺及血管生长等的分化过程^[18]，在多种肿瘤中也高表达，被作为“癌基因”。miRNA-17-92基因簇有多种下游靶基因^[19-21]，其中人干扰素调节因子、促凋亡基因BCL2L11、缺氧诱导因子1α等参与肿瘤周期的调控。miRNA-17-92基因簇一方面直接抑制肿瘤内血管形成，另一方面促进肿瘤细胞外血管内皮细胞的生长^[22]，另外还可以调节内皮细胞的增殖功能^[23]。抑制miRNA-17-92基因簇可以促进血管生成^[24]。miRNA-17-92基因簇对卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌等都有一定的影响^[25-31]；对肺癌、肝癌、胃癌的分化增殖凋亡也有影响^[32-33]，在B细胞淋巴瘤^[34]、白血病中高表达，可作为B细胞淋巴瘤的一种诊断方法^[35-36]。

许多研究发现miRNA的表达与胃癌相关，其中一些miRNA在胃癌细胞中高表达，一些在胃癌细胞中显著下调^[37-38]。miRNA的表达与胃癌的发生发展关系密切，如miR-21的高表达与胃癌肿瘤的大小和浸润深度相关，miR-451与miR-125a-5p 在胃癌细胞中的低表达与肿瘤的转移、浸润及预后有关^[39]，miR-409-3p、miR-221表达下调与患者的淋巴结转移有关^[40-41]，miR-196a在血清中的含量与胃癌的复发相关^[42]。外周血标记物方便筛查及随访，是诊断癌症最好的标记物。目前研究发现在胃癌中表达上调的miRNA有：miR-17、miR-21、miR-106a、miR-21和miR-106b等^[43]，一项对手术前后血浆miRNA水平的研究表明：miR-451和miR-486在手术后的表达显著下调。本实验利用miRNA表达谱芯片对胃癌干细胞贴壁分化过程进行细胞芯片分析，发现miR-19b、miR-20a和 miR-92a表达逐渐缺失，而这些miR属于miR-17-92基因簇的成员，胃癌干细胞的贴壁分化过程是胃癌干细胞更新受到抑制的过长，因此在胃癌干细胞贴壁分化过程中逐渐缺失的miR-17-92基因簇成员可能参与了胃癌干细胞的自我更新过程。本研究结果发现：慢病毒携带miRNA-17-19基因在MKN28细胞和CD44^-/EpCAM^-细胞中的表达均明显增加；瞬时转染pre-miR-19b/20a/92a能使CD44^-/EpCAM^-和MKN28的miRNA表达增高，瞬时转染pre-miR-19b/ 20a/92a拮抗剂能使SGC7901和CD44⁺/EpCAM⁺的miRNA表达降低；过表达lenti-miR-19b/20a/92a能显著增加胃癌细胞形成肿瘤球的能力；在化疗药的作用下，lenti-miR-19b/20a/92a感染细胞的生存时间延长；瞬时转染pre-miR-19b/20a/92a 能够显著增加CD44⁺/EpCAM⁺细胞数，转染其拮抗剂可以降低CD44⁺/EpCAM⁺细胞数。MTT增殖实验结果显示miR-19b/20a/92a 稳定表达组的胃癌细胞增殖速度较对照组快。瞬间转染miR-19b/20a/ 92a前体组加快胃癌细胞的增殖速度，而瞬时转染其拮抗物组减慢胃癌细胞的增殖速度；平板克隆形成实验结果显示：miR-17-92 稳定表达细胞形成的克隆数显著高于对照组；瞬时转染 miRNA的平板克隆实验结果显示：瞬间转染miR-19b/ 20a/92a前体组的克隆数较对照组多，而瞬时转染miR-19b/ 20a/92a拮抗物组的克隆数较对照组少。

综上所述，miR-19b/20a/92a基因在胃癌干细胞分化过程中不断缺失，miR-17-92基因能够促进胃癌干细胞的更新和增殖。